Souris

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Saines, elles reçoivent trois injections destinées à produire des anticorps contre des peptides liés à la spermatogenèse, avec prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions ou des ulcérations cutanées et les prélèvements des saignements et des hématomes. Il décrit la souris comme le "meilleur modèle" pour induire l'immunisation et rattache le projet à une étude internationale sur les effets du COVID sur la fertilité.

Objectifs

L’auto-immunité est la conséquence d’un système immunitaire qui s’emballe et dépasse son rôle de défense contre les agents extérieurs pour s’attaquer aux propres cellules de l'organisme. Les agents extérieurs peuvent être des bactéries, champignons, virus. Ainsi l'épidémie de COVID-19 a incité les scientifiques, et en particulier les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La principale préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une maladie auto-immune. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains, entraînant une réactivité auto-immune. La présente étude porte sur l'appareil reproducteur. Les tissus du système reproducteur sont très vulnérables aux infections virales, de plus les ovaires et les testicules expriment des récepteurs qui servent également a la voie par laquelle le virus pénètre dans les cellules. Par ailleurs, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns; à cet égard, une altération de la spermatogenèse a été signalée dans des études menées sur des patients atteints de COVID-19. Notre première analyse a permis d'identifier 4 sequences (peptides) communes liées à la spermatogenèse et la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons également découvert que des patients masculins et féminins affectés par le COVID-19 développaient des anticorps contre 2 des 4 peptides sélectionnés liés à la spermatogenèse, soulignant l'apparition de nouveaux troubles de la fertilité dans la population. Le but de ce projet est la production d'anticorps anti-peptides sur des souris saines afin de vérifier l'impact sur la fertilité

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur la population en général. Cette étude nous permettra de produire des anticorps qui seront utilisés dans un projet plus vaste afin de comprendre leur rôle.

Procédures

Trois injections et les prélèvement sanguins sont réalisées sur animal anesthésié. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2 minutes/souris

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle. Le prélèvement de sang peut provoquer des saignements excessifs et des hémorragies sous-cutanées.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la prodédure pour prélèvement.

Remplacement

Le projet actuel constitue la phase finale d'une large étude internationale à grande échelle qui a commencé par une analyse visant l'identification de peptides partageant des séquences similaires avec la protéine Spike du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, nous avons démontré la réactivité des anticorps des sérums des patients COVID-19 envers lesdites protéines/peptides liées à la spermatogenèse par des tests in vitro (sérums collectés de divers centres cliniques internationaux). L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme complexe. Cela nécessite d’induire une réponse immunitaire contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez ou à partir d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin del la procédure.

Réduction

Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre vos travaux.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un groupe social et dans des cages enrichies (matériaux de nidation, tubes). L'expérience est arrêtée lorsque l'analyse de sang confirme la présence d'anticorps. Nous avons établi des points-limites nous permettent de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leurs systèmes physiologiques schématisent les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire l'immunisation. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront recrutées. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont génétiquement modifiées pour supprimer une réaction inflammatoire cérébrale, et toutes sont isolées en cage jusqu'à huit jours, soumises à un régime gras puis à un jeûne de seize heures, avec contentions dans un scanner corporel, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur revendique la souris comme un "modèle de référence" pour les études métaboliques et affirme qu'aucun modèle de substitution n'existe pour cette approche intégrée. Les retombées annoncées, une meilleure compréhension de la boulimie, de l'hyperphagie ou de l'anorexie, restent formulées comme une possibilité.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Récemment, notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques après consommation d’un repas gras. Toutefois, chez les mammifères, il existe un équilibre dynamique entre les apports et les dépenses énergétiques de l’organisme qui reste constant en condition de vie normale. Cet équilibre est appelé homéostasie énergétique. Il vise à faire coïncider la prise alimentaire (calories assimilées) par rapport aux besoins de l’organisme (calories brûlées), liés à son fonctionnement et à l’activité physique. La question est de savoir si la PIR n’agit que sur la prise alimentaire ou contrôle également les dépenses énergétiques de l’organisme. Pour tester cette hypothèse, nous allons mesurer différents aspects des dépenses énergétiques (dont activité locomotrice et métabolisme basal) chez des souris dont la PIR cérébrale a été abolie ou non. Cette approche de perte de fonction sera possible grâce à l’étude d’animaux mutants ne pouvant pas déclencher la PIR au niveau cérébral. Des animaux non mutants seront les témoins de l’expérience. Les animaux seront étudiés dans différents états nutritionnels (sous régime standard ou gras pendant 72 heures). Ils seront également soumis à un test d’effort calorique conventionnel (mise à jeun pendant 16 heures). L’ensemble de ces analyses fonctionnelles sera réalisé en cages calorimétriques dédiées. A la fin des études, les animaux seront mis à mort et les cerveaux seront collectés post-mortem pour analyses histologiques. Au total, 128 souris seront utilisées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les fonctions de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur les mécanismes cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété et du métabolisme énergétique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

La procédure implique une mise en cage individuelle pendant 8 jours au maximum, afin de mesurer les dépenses énergétiques de chaque individu, ce qui peut engendrer stress et inconfort. Des contentions seront réalisées afin d’évaluer la composition corporelle (procédure non invasive mais nécessite un transfert des animaux dans un scanner corporel). Une injection intrapéritonéale d’anesthésique durant 5 secondes sera réalisée avant mise à mort sous sédation.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont liées aux conditions d’hébergement isolées pendant 6 à 8 jours. Le stress métabolique induit par la mise sous régime gras pendant 3 jours et par la mise en jeun pendant 16 heures représente une nuisance supplémentaire. Enfin, la contention des animaux (notamment pour mesurer la composition corporelle dans le scanner EchoMRI), et les injections intrapéritonéales d’agent d’anesthésique avant la mise à mort représentent aussi des nuisances. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal. Pendant les expériences de calorimétrie, la surveillance quotidienne du bien-être animal sera assurée de manière visuelle, à travers les cages transparentes, et par suivi des enregistrements de prise alimentaire, prise hydrique, et locomotion. De plus, lors des changements de conditions nutritionnelles (introduction du régime gras HFD (High fat diet ) après SD, ou du régime équilibré SD (standard diet) après mise à jeun), une observation directe des animaux sera faite.

Devenir

Les 128 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses métaboliques et comportementales fines.

Réduction

La procédure décrite a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits.

Raffinement

Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les principaux dispositifs instrumentaux utilisés dans ce projet (cages métaboliques et scanner EchoMRI) permettent des mesures non-invasives. Une liste de points limites a été préalablement établie et si un animal présente des signes de souffrance ou atteint pour une durée de plus de trois jours, un des points limites décrits dans les procédures l'animal sera ecarté de l'étude.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.

90 souris et 30 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée d'une étude à l'autre, le reste tué. Ils reçoivent jusqu'à cinq administrations de composés chimiques ou biologiques par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, pour déterminer les doses toxiques avant de futurs tests d'efficacité. Le porteur indique que les effets peuvent aller de la perte de poids aux stéréotypies, à la prostration et à la détresse respiratoire, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude est "indispensable" et ne peut pas se faire autrement que sur des animaux vivants, les tests in vitro étant jugés insuffisants.

Objectifs

L’objectif du projet est de collecter des données de tolérance et de toxicité pour des nouveaux composés chimiques et biologiques dont la bibliographie est insuffisante ou inexistante. La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques. Elle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la phase de test d’efficacité biologique.

Procédures

Administration de composés par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, ou sous cutanée ;10 secondes par administration ; maximum 5 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Nous cherchons à déterminer si les produits testés induisent de réactions toxiques pour l’animal à certaines doses. Si c’est le cas, ces nuisances s’exprimeront par : - une perte de poids - des modifications du comportement: . des comportements stéréotypés marqués (animal tournant en rond, se cabrant, agressif) . diminution de la mobilité, prostration . diminution de l’alimentation et du toilettage, voire de l’aspect général de l’animal (pelage sale autour face/ région urogénitale, hirsute) - des effets sur l’activité respiratoire

Devenir

Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés, et considérés comme en utilisation continue étant donné qu’ils seront utilisés dans les mêmes procédures. Si une autre étude sur un nouveau biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si aucune étude n’est planifiée, les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude.

Remplacement

Le but de cette étude est de déterminer une activité toxique in vivo et ne peut donc pas être réalisée par d’autres moyens que d’utiliser des animaux vivants. En effet les études de toxicité in vitro sont insuffisantes et un composé peut se révéler toxique chez l’animal à des doses non toxiques in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les recommandations OCDE, considéré comme suffisant pour conclure (3 animaux par groupe); moins de 3 animaux par étude serait insuffisant. Un animal pourra être utilisé pour une deuxième étude dans les cas suivants : Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si une autre étude sur un nouveau composé biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés.

Raffinement

Voici la liste des points limités : Perte de poids > 15% Changements majeurs : - Diminution marquée de la motilité - Absence d’alimentation et de toilettage - Prostration - Comportements stéréotypés marqués (tourne en rond, se cabre, agressivité) - Recroquevillé - Effets marqués sur la respiration avec détresse respiratoire - Décoloration et fourrure sale autour de la bouche et de la région urogénitale Pour l’administration par voie Intra péritonéale, surveillance au point d’injection. Si un des points limites est observé, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L’OCDE recommande d’utiliser des rongeurs pour ce type d’étude. Nous avons choisi les souriscar cela est suffisant dans le cadre de notre projet, les tests d’activité biologique des composés étant réalisés chez la souris. La souris est par ailleurs l'espèce la plus utilisée sur le campus. Nous avons complété cette demande pour le hamster car c'est à priori une autre espèce pour laquelle nous pourrions être sollicité (études SRAS-CoV-2 ou virus de la même famille). Si nous sommes sollicités pour tester des molécules qui vont être étudiées chez d'autres espèces, nous discuterons avec le scientifique de la nécessité de définir la DMT chez cette espèce. Des animaux adultes seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les adultes ; des jeunes animaux ou des animaux âgés seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les jeunes ou les animaux âgés respectivement.

Toutes mises à mort vers l'âge de 5 mois pour le prélèvement de plusieurs tissus, dont les reins, le cœur, le pancréas, le cerveau et le foie, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles naissent d'œufs fécondés dans lesquels l'équipe microinjecte des ARN de spermatozoïdes d'hommes obèses ou non obèses, et peuvent devenir obèses et diabétiques. À 4 mois puis à 4 mois et demi, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de glucose, puis d'insuline, suivie à chaque fois de deux heures de mesures de la glycémie sur du sang prélevé à la queue, toutes les 15 minutes la première heure. Le porteur dit ce matériel biologique "indispensable" et affirme que "seul ce modèle expérimental est disponible" pour savoir si ce mode d'hérédité vaut chez l'homme. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite, ou dont la glycémie reste trop basse deux heures après une injection de glucose lors du test à l'insuline, est mise à mort.

Objectifs

L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.

Remplacement

Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.

Réduction

Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.

Raffinement

Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (

Choix des espèces

Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.

Pour savoir si des cellules stromales issues du tissu adipeux peuvent traiter la sclérodermie systémique, 154 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, des poumons, de la rate et de la peau. Elles reçoivent des injections dans le derme cinq jours par semaine pendant quatre ou six semaines, soit jusqu'à trente, et une seule injection de ces cellules dans la veine de la queue. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés peuvent provoquer des démangeaisons, parfois des plaies ou des irritations de la peau, et les souris développent une fibrose de la peau et des poumons. Le porteur affirme que cette fibrose pulmonaire n'entraîne "pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires", ne mentionne aucun point limite, et prévoit seulement que des sédatifs ou des antidouleurs "pourront" être donnés si des signes de souffrance apparaissent.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes

Une injection intrapéritonéale par jour pendant deux jours, sous anesthésie locale, puis une anesthésie générale sans réveil attendent la moitié des 162 souris de ce projet, l'autre moitié étant seulement endormie avant d'être tuée. Toutes sont mises à mort pour des prélèvements d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe veut préciser le rôle du métabolisme dans l'altération de l'immunité des patients atteints de syndrome de détresse respiratoire aiguë, une insuffisance respiratoire mortelle dans 30 à 40 % des cas. Le porteur affirme avoir choisi "le modèle le plus pertinent" parmi dix qui reproduisent ce syndrome, sans dire lequel ni ce que contiennent les injections, et ne décrit comme effets qu'une "douleur légère de courte durée" et un "léger stress".

Objectifs

Le syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) est une forme gravissime d'insuffisance respiratoire avec une mortalité élevée (30-40%) sans traitement curatif disponible. Les patients atteints de SDRA présentent une altération des réponses immunitaires qui participent à la gravité de ce syndrome et donc au taux de mortalité. Nous avons pu mettre en évidence chez ces patients que l’altération de leur réponse immunitaire pourrait être liée à des anomalies métaboliques. Nos objectifs sont donc de préciser le rôle du métabolisme dans l’altération des réponses immunitaires afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes visant à corriger ces anomalies. Ce syndrome complexe et sévère fait intervenir plusieurs types cellulaires et seule l'expérimentation animale nous permettra de retrouver l'ensemble des acteurs au sein d'un même modèle.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme pourrait influencer la dysimmunité dans le SDRA pourrait aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou permettre de développer des outils pour la prise en charge et le suivi de l'évolution clinique des patients.

Procédures

La moitié des animaux (9 groupes) subira 2 interventions, chacune de très courte durée (

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du syndrome de détresse respiratoire aigüe est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro car le métabolisme et la réponse inflammatoire et immunitaire représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudiés qu’in vivo. En effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les interactions de plusieurs organes et types cellulaires : d’un côté le poumon, en particulier les cellules endothéliales pulmonaires, le parenchyme pulmonaire, les cellules immunes résidentes au niveau du poumon; de l’autre côté, les facteurs circulants, les médiateurs inflammatoires, les adipokines, les hormones et les cellules immunes circulantes ; enfin, le tissu adipeux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique de puissance qui permet de garantir l’observation de résultats exploitables. Grâce à ce test, nous obtenons n = 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, raffinant ainsi leurs conditions de vie. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les injections seront précédées d'une anesthésie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée. Pour la réalisation de la procédure, des points limites précoces ont été établis au moyen d'un score et seront appliqués si nécessaire, comme défini dans la description de la procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de veiller à leur bien-être.

Choix des espèces

En ce qui concerne le modèle, nous avons choisi avec attention le modèle le plus pertinent pour notre projet parmi les 10 modèles qui miment le syndrome de détresse respiratoire aigu chez l’Homme. En ce qui concerne l’espèce, nous avons choisi la souris car nous prévoyons d’utiliser des animaux transgéniques. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des souris âgées de 5 semaines et pesant 20 grammes chacune seront utilisées.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime gras de trois à six mois jusqu'à l'obésité, puis subissent une chirurgie abdominale de quatre-vingt-dix minutes avec pincement du pédicule du foie et des prélèvements de sang, pour mettre au point un modèle d'ischémie-reperfusion sur foie stéatosé. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité et que la chirurgie provoque une perte de poids et une défaillance du foie plus ou moins transitoire. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas un foie vascularisé et juge le recours à l'animal nécessaire.

Objectifs

La transplantation d’organe solide constitue le traitement curatif de choix des patients présentant des défaillances d’organe à un stade terminal. Malheureusement, les besoins augmentent plus vite que les organes disponibles et entraînent des pénuries de greffon, ce qui engendre des listes d’attente importantes. L’une des stratégies envisagées est l’élargissement des prélèvements chez des donneurs présentant des facteurs de comorbidité (association de plusieurs maladies) ; notamment des foies stéatosés atteints de stéato-hépatite non alcoolique (NASH), caractérisés par l’apparition de dépôts graisseux liée à un régime alimentaire trop riche en sucre et en graisse. Lors de la transplantation, des phénomènes liés à l’ischémie (défaut d’apport en nutriments et en oxygène) et aussi à la reperfusion (reprise du flux sanguin de l’organe chez le receveur) sont à l’origine de processus physiopathologiques qui vont contribuer aux lésions irréversibles du greffon. Dans le cas de la greffe de foie, la séquence d’ischémie-reperfusion peut entraîner des lésions sévères, à l’origine de dysfonctions du greffon et potentiellement du rejet de l'organe à plus ou moins long terme. L’utilisation de foies stéatosés pour augmenter le nombre d’organes transplantables doit être rigoureusement étudiée étant donné que les conséquences de la stéatose sur la qualité de la transplantation continuent à faire débat. Afin de répondre aux attentes cliniques, notre objectif est de mettre au point un modèle murin d’ischémie-reperfusion hépatique chez des souris atteintes de stéatose (obésité nutritionnelle) afin d’étudier les effets combinés de la stéatose et des lésions d’ischémie reperfusion. La première étape sera de définir les points limites de ce modèle en testant différentes durées de régime et de temps de reperfusion tout en évaluant l’impact sur les lésions d’ischémie-reperfusion hépatiques et la nuisance pour les animaux. La validation de ce modèle permettra ensuite d’établir la durée optimale de régime et de temps de reperfusion afin d’identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir les effets de l’ischémie-reperfusion en transplantation de foies stéatosés chez l’homme.

Bénéfices attendus

A court terme, la mise en place de ce modèle permettra d’étudier in vivo les effets combinés de la stéatose et d’une ischémie-reperfusion sur les fonctions hépatiques, ce qui n’est pas possible chez l’homme. A moyen terme, après la validation de ce modèle, nous pourrons identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion et améliorer la reprise de fonction. A long terme, ce projet vise à augmenter le pool de greffons disponibles à la transplantation chez l’homme.

Procédures

Régime riche en graisses et sucres durant 3 à 6 mois pour 144 souris. Pesée 1 fois par semaine pendant la durée du régime pour 288 souris (10s). Un jeûne de 4h avant tous les prélèvements sanguins. Prélèvements sanguins (8 maximum pour 32 animaux sinon entre 4 et 7 prélèvements pour 256 souris) sous anesthésie gazeuse d’une durée de 30s par prélèvement. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse AVEC pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse SANS pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 3, 4 ou 6 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre l’obésité. Les animaux obèses seront un peu moins mobiles mais sans conséquence sur l’accès à leur alimentation et eau de boisson et leur bien-être général. L’acte de pesée sur animal vigile pourra induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un léger inconfort au réveil. Après la chirurgie abdominale, un stress transitoire peu intense, une mobilité réduite de quelques heures (due aux sutures abdominales) peuvent être observés. En post-opératoire, une perte de poids de quelques heures jusqu’à sept jours après la chirurgie pour les animaux obèses qui reprennent un régime normal peut également nuire à l’animal. L’autre effet indésirable attendu est une défaillance plus ou moins transitoire de la fonction hépatique dont l’impact principal sera la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Un modèle in vitro de cellules hépatiques stéatosées réalisé au laboratoire nous permet d’avoir une première approche des mécanismes mis en jeu au niveau cellulaire. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un foie, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie hépatique notamment associée à une modulation du métabolisme d’un foie vascularisé. En effet, les méthodes d’études in vitro ou in silico sont très limitées pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents dans les modèles in vitro ou in silico : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’évaluer de manière intégrative et systémique la mise en jeu des éléments immunitaires et métaboliques dans les lésions d’ischémie-reperfusion en utilisant un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques de la procédure découle d’une part d’un compromis entre les questions de minimisation et d’autre part d’un calcul de puissance pour définir le nombre d’animaux par groupe suffisant pour détecter des différences statistiques biologiques intra-groupes et intergroupes. Un total de 288 animaux maximum sera nécessaire pour la réalisation de ce projet de 5 ans. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d’organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition des souris en surpoids sera prise en compte pour le bien-être animal. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire avec des grilles de score. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et locale en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène et le modèle d’ischémie-reperfusion hépatique chez la souris, sont validés et adaptés pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques (cytokines, protéines recombinantes, anticorps de détection). Les animaux seront âgés de 6 semaines au démarrage des régimes. Il est important de démarrer les régimes de façon précoce pour une meilleure installation de la pathologie. Les chirurgies pour ischémie-reperfusion seront réalisées sur animaux adultes à maturité (3 à 6 mois après démarrage des régimes).