Souris
Identifier les déterminants physiologiques de maladie (obésité, diabète…) par l’analyse non-invasive des paramètres métaboliques chez le petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 48
252 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré du "sans réveil" au léger, une partie réutilisée pour d'autres études et le reste tué pour prélèvement d'organes. Les animaux passent par une plateforme de mesure métabolique non invasive, avec un isolement individuel d'environ deux semaines présenté comme la seule contrainte. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et estime qu'un quart environ des animaux est tué dans son établissement. Le dispositif sert des collaborations extérieures, le devenir de chaque animal dépendant de l'équipe qui le récupère.
Objectifs
Le but est d'étudier au niveau préclinique le métabolisme énergétique des souris ou rats par un outil non-invasif et complètement automatisé. Pour cela, la plateforme d’Exploration Physiologique Fonctionnelle (EPF) est composée de 12 cages et permet la mesure en temps réel et pour chaque souris ou rats : - la prise alimentaire et hydrique - la mesure de la consommation d’oxygène - la production de dioxyde de carbone - la mesure du quotient respiratoire (indicatif de la nature du métabolisme glycolytique ou oxydatif) - la dépense énergétique globale de l’animal - l’activité spontanée et la mesure fine des déplacements dans les 3 dimensions spatiales (X, Y, Z). La plateforme EPF permet aussi l’analyse non-invasive de la composition corporelle des souris et rats par un scanner à résonance magnétique. Ce système ne requiert pas d’anesthésie et permet de déterminer la masse maigre, la masse grasse, les fluides corporels et la composition totale en eau sur des souris et rats.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre de collaborations qui auront été préalablement validées par des comités éthique locaux aux équipes voulant collaborer avec nous pour connaitre les comportements métaboliques et cela sans douleur et en limitant le stress des animaux.
Procédures
Aucune intervention n'est effectuée, il s'agit d'une procédure non invasive de mesure de calorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Cette lecture métabolique est non-invasive et nécessite un isolement de 2 semaines au total avant d'être regroupé. Nous n'attendons aucun effet indésirable sur les animaux, ceux-ci ont de la nourriture et de l'eau à disposition comme dans une cage d'hébergement classique, la seule contrainte étant l'isolement de l'animal obligatoire pour les prises de mesure. Chaques études collaboratives (21 par an) sont réalisées sur 12 souris ou rats.
Devenir
En fonction des collaborations, les animaux seront récupérés dans le cadre des collaborations et mis directement à mort pour prélèvements d'organes. Nous pouvons estimer que 25% des animaux sont mis à mort dans notre EU.
Remplacement
Dans le cadre des projets de collaborations nous devrons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour nos études nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux (activité, prise alimentaire et hydrique) et de métabolique . De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs / le stress dans la procédure. Cette procédure est non invasive et ne provoquent normalement aucun effet indésirable sur les animaux.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur. Les animaux doivent être âgées au minimum de 10 semaines lorsque toutes les structures cérébrales et le métabolisme soient stabilisés.
Mécanismes biologiques du codage prédictif dans le néocortex de la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies crâniennes d'une heure sous anesthésie, la pose d'une plaque de tête et l'implantation d'électrodes, puis une contention de la tête et un entraînement en réalité virtuelle, parfois sous restriction d'eau pour les motiver. Le porteur affirme que l'enregistrement cérébral est "indolore" car le cerveau ne possède pas de récepteurs de la douleur, tout en reconnaissant douleur post-opératoire, risque d'infection et perte de poids. La recherche est présentée comme fondamentale, ses retombées médicales étant renvoyées au "long terme".
Objectifs
Nous étudions les mécanismes neuronaux qui sous-tendent le comportement animal. Notre hypothèse est que les processus mentaux génèrent constamment des prédictions sur le monde extérieur. Cette hypothèse considère le cerveau comme une machine prédictive capable de bien plus qu'une simple analyse des informations sensorielles arrivant par les yeux, les oreilles, etc. Au contraire, l'expérience antérieure est utilisée pour construire des modèles internes du monde qui sont ensuite utilisés pour prédire les événements extérieurs. Si vous êtes assis dans votre jardin, si vous voyez le chat du voisin sauter la clôture, vous vous y attendez et l'activité cérébrale produite par cette scène est faible. En revanche, si un kangourou saute la clôture, cet événement n'est pas prévu par votre modèle interne de votre jardin, et l'activité cérébrale sera élevée pour traiter cette situation inattendue et potentiellement dangereuse. À l'inverse, si vous déménagez en Australie et que vous vivez dans l'arrière-pays, votre modèle interne sera rapidement mis à jour par les expériences que vous avez vécues en voyant un kangourou sauter la clôture et vous ne serez pas surpris la prochaine fois que cela se produira. Nous étudions les fondements biologiques de ce calcul, comment les modèles internes sont formés et comment ils régissent la perception et le comportement. Nous utilisons des souris pour nos recherches, car elles possèdent un riche répertoire comportemental et une architecture cérébrale similaire à celle des humains. En outre, nous disposons d'outils de recherche inégalés pour enregistrer et modifier l'activité cérébrale des souris. Nous étudions comment les cellules du cerveau se connectent les unes aux autres et comment elles communiquent afin de permettre un traitement prédictif. En outre, nous étudions les souris au cours d'un comportement naturaliste dans un environnement de réalité virtuelle, où nous pouvons contrôler ce qu'elles voient, de sorte que nous pouvons introduire des événements inattendus (comme le kangourou). En enregistrant et en modifiant l'activité cérébrale au cours de ces comportements, nous pouvons mieux comprendre quels calculs le cerveau des mammifères effectue et comment. Ce travail est essentiel pour comprendre les processus mentaux. Il est important de noter que la compréhension du fonctionnement d'un esprit sain nous permettra de mieux comprendre ce qui ne va pas dans les maladies psychiatriques, comme la dépression ou la psychose.
Bénéfices attendus
Bénéfices principaux: Ce programme de recherche vise à combiner des techniques expérimentales de pointe avec des approches nouvellement développées afin d'ajouter de nouvelles connaissances fondamentales à notre compréhension de la fonction cérébrale et des structures qui la soutiennent. Nous publierons ces données dans des revues de premier plan et diffuserons les résultats lors de conférences nationales et internationales. Nous nous engageons aussi activement à rendre nos données, notre code et nos développements techniques open source. Bénéfices secondaires: La nature invasive de nos approches expérimentales permet d'obtenir une quantité inégalée d'informations sur la structure et la fonction du cerveau, mais elle est limitée à l'étude d'organismes modèles. Cependant, la compréhension du cerveau des rongeurs conduira inévitablement à une meilleure compréhension du cerveau humain. Cette recherche de découverte fondamentale ne peut être réalisée sans l'utilisation d'animaux. La connaissance du cerveau sain est nécessaire à la réparation causale des dysfonctionnements dans les pathologies. Nos travaux apporteront de nouvelles connaissances sur les calculs cérébraux fondamentaux qui sont déréglés dans les maladies psychiatriques et, à long terme, de nouvelles pistes pour améliorer la santé humaine. Selon l'OMS, la santé mentale et les maladies neurologiques représentaient 13 % de la charge totale de morbidité dans le monde en 2004. Le coût de la maladie en 2010 était estimé à 2,5 billions de dollars US pour les maladies mentales (contre 0,3 billions de dollars US pour le cancer), et atteindra 6 billions de dollars US d'ici 2030 (The Global Economic Burden of Noncommunicable Diseases. Genève : Forum économique mondial 2011).
Procédures
Les animaux subiront au maximum trois interventions chirurgicales d'une heure sous anesthésie gazeuse. Ces interventions comprennent des injections dans le cerveau et la mise en place d'une plaque de tête pour faciliter l'immobilisation des animaux pendant l'enregistrement. En outre, des électrodes d'enregistrement peuvent être implantées. Pendant et après l'opération, les souris recevront une injection d'anesthésique local dans le crâne, un analgésique et un anti-inflammatoire. Pour la procédure 1, quelques semaines après l'opération, des études ex vivo seront menées en utilisant des méthodes d'enregistrement et d'optogénétique de pointe. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront entraînés à la réalité virtuelle et des enregistrements électriques du cerveau seront effectués pour étudier le codage neuronal. Les souris peuvent ressentir une gêne légère et transitoire pendant quelques jours, le temps qu'elles s'habituent à la fixation de la tête. Les séances d'entraînement et d'enregistrement dureront de 1 à 3 heures et seront répétées de manière ponctuelle pendant 2 à 7 jours. L'enregistrement cérébral est indolore, car le cerveau ne possède pas de récepteurs de la douleur. Les stimuli (visuels et vestibulaires) sont indolores.
Impact sur les animaux
En général, toutes les procédures sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. En ce qui concerne la chirurgie implantaire, les désagréments comprennent la douleur postopératoire, le risque potentiel d'infection et la perte de l'implant. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera due uniquement à des aspects périphériques. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure le stress lié à l'isolement et le stress lié à la manipulation. Dans certains cas, la restriction d'eau sera utilisée pour motiver le comportement des animaux, ce qui peut entraîner une baisse de poids modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sans cruauté à la fin des procédures. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses anatomiques et physiologiques ultérieures afin d'obtenir le maximum de données sur chaque animal.
Remplacement
Malgré un siècle de recherche sur le cerveau, la science est encore loin de comprendre les détails biologiques de la fonction cérébrale. L'étude des processus cognitifs chez les animaux et les tissus cérébraux vivants est essentielle pour la recherche biologique fondamentale. À mesure que nous en apprendrons davantage sur les neurones et les synapses à l'étude, nous pourrons utiliser davantage la modélisation mathématique et informatique. Cependant, pour que les approches de modélisation soient utiles, elles devront être étroitement limitées par des mesures biologiques. L'utilisation d'animaux est inévitable pour les questions scientifiques importantes que nous souhaitons aborder. Cependant, nous utiliserons également la modélisation informatique aux niveaux synaptique, cellulaire et réseau pour tester des scénarios possibles afin de générer des hypothèses testables.
Réduction
Les objectifs nécessitent l'utilisation de lignées de souris transgéniques. Le nombre d'animaux requis reflète les schémas de reproduction connus, la taille des portées et la demande. Dans la mesure du possible, les lignées seront maintenues à l'état homozygote, afin de limiter le nombre de descendants présentant des génotypes inappropriés. Pour la plupart des expériences quantitatives, le plan sera basé sur les directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org/) et nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour fournir une description adéquate basée sur l'expérience précédente (la nôtre et celle de la littérature) . Nous avons une expertise statistique à l'Institut pour déterminer adéquatement la taille de l'échantillon en fonction de l'analyse de puissance. Nous utiliserons les méthodes de recherche les plus modernes qui maximisent la quantité de données recueillies sur chaque animal. De plus, en effectuant des enregistrements répétés sur les mêmes animaux, nous pouvons obtenir des données plus précieuses sur la dynamique des processus neuronaux des individus, réduisant à nouveau le nombre d'animaux nécessaires, par rapport aux expériences ponctuelles uniques. Enfin, dans la mesure du possible, le tissu cérébral d'un animal sera partagé et/ou déplacé pour d'autres analyses expérimentales, par exemple, l'histochimie dans un tissu fixé après des enregistrements in vivo.
Raffinement
Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, la détresse ou les dommages durables à l'animal seront prises. Des protocoles expérimentaux ont été affinés en utilisant les pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. La douleur et/ou la détresse des animaux sont réduites par sédation, analgésie, anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, suivant une pratique vétérinaire reconnue. Les injections cérébrales stéréotaxiques et les chirurgies d'implantation seront réalisées dans des conditions aseptiques pour prévenir les infections post-chirurgicales. La récupération de l'animal après l'opération est directement surveillée dans une salle de réveil jusqu'à ce que l'animal soit ramené dans sa cage d'accueil. Une fois que les animaux sont retournés dans leur cage d'accueil, ils sont observés au moins deux fois par jour. De plus, les souris sont généralement hébergées en groupes et bénéficient d'un enrichissement environnemental, ce qui réduit considérablement les niveaux de stress par rapport au logement isolé. Enfin, nous surveillons en permanence les meilleures pratiques et les nouvelles informations disponibles dans la littérature internationale (par exemple https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources). Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales en recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec le plus grand soin et qui contribue à apporter à la société informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont choisies car leur système nerveux est largement similaire à celui de l'homme et qu'elles disposent d'une riche boîte à outils génétique pour les expériences. En outre, elles ont une bonne acuité visuelle, sont suffisamment petites pour être fixées sur la tête et constituent l'espèce de mammifère la plus simple pour réaliser ces expériences. Les objectifs de cette recherche sont de découvrir les mécanismes de la fonction cérébrale bien développée chez les animaux adultes. Pour certaines expériences (par exemple celles nécessitant un long temps d'expression des vecteurs viraux), nous utiliserons des animaux juvéniles (P18+). Pour la plupart des expériences, des animaux âgés de P35+ seront utilisés.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, une chirurgie de trente minutes, pour introduire deux mutations d'un gène du développement cérébral reproduisant des traits proches de l'autisme. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter stress, douleur post-opératoire, bagarres entre mâles et retards de croissance, et précise que les organismes génétiquement modifiés ne peuvent être ni replacés ni relâchés. Les reproducteurs âgés comme les souriceaux sont tués pour prélèvement de tissus, les bénéfices restant une meilleure compréhension du neurodéveloppement "à terme".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Impact des acides biliaires sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, le métabolisme, l’immunité anti-tumorale et la réponse aux immunothérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de la tumeur, du foie, de l'intestin, des ganglions et de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les procédures, elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries et quatre d'acides biliaires, une injection d'un traceur dans un ganglion et une prise de sang finale. L'équipe veut savoir si des acides biliaires déjà présents dans la pharmacopée humaine pourraient restaurer l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez les patients traités par antibiotiques, un bénéfice que le porteur formule au conditionnel. Il dit avoir défini un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe", sans en donner la valeur ni le nombre de groupes qui mène à 8 256 souris.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur.
Bénéfices attendus
Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min).
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.
Étude métabolique et fonctionnelle en imagerie in vivo d’un modèle de gliomes chez la souris (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines de glioblastome dans le cerveau par chirurgie, puis passent trois séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses post-mortem. Le porteur indique que l'injection peut provoquer une neuroinflammation, un état fébrile, une perte d'appétit et une léthargie pendant une douzaine d'heures. Les bénéfices avancés, un biomarqueur d'imagerie utile pour évaluer de futures thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont renvoyés au conditionnel.
Objectifs
Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquente. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelée IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie pat tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure afin de permettre des analyses post-mortem in vitro. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.
Remplacement
Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en blocs expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en blocs (de 5 à 7 souris s) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque bloc. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultrasons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonore est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.
Rôle d’un inhibiteur d’enzymes vasculaire dans une pathologie rénale, la glomérulonéphrite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'une protéine dans une maladie rénale inflammatoire. Une glomérulonéphrite est induite par injection d'un sérum, avec collecte d'urine par pression sur la vessie et prises de sang, une partie des souris étant irradiée pour détruire leur moelle osseuse ou opérée du rein pour y injecter des particules virales. Le porteur décrit une présence de protéines dans les urines et un gonflement du ventre, et fixe une durée limitant l'aggravation de la maladie, avant mise à mort pour analyser les reins. Il affirme que la fonction rénale et la circulation sanguine ne peuvent se reproduire in vitro.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de determiner si notre protéine d'intêret, un inhibiteur d'enzymes vasculaire, joue un rôle dans le développement d'une maladie rénale, la glomérulonéphrite. Notre hypothèse est que cette protéine pourrait être protectrice et limiter l'insuffisance rénale liée à cette maladie. De plus nous voulons déterminer quelles cellules de l'organisme produisant cette protéine sont importantes pour la régulation de la glomérulonéphrite. Nous souhaitons également tester la possibilité de bloquer le développement de la glomérulonéphrite en modulant l'expression de cet inhibiteur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de determiner si notre protéine d'interêt, qui bloque l'activité d'enzymes dans les vaisseaux, régule le développement de la glomérulonéphrite et pourrait représenter une nouvelle cible pour les maladies rénales. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre son rôle dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme et son mécanisme d'action, pour pouvoir cibler cette protéine au cours de la maladie afin d'améliorer la santé des patients.
Procédures
La glomerulonephrite sera induite par injection intraveineuse d'un serum (2 injections de 1min, 1 par jour pendant 2 jours) sous anesthésie et nous suivrons le développement de la maladie pendant 14 jours. Pour cela, de l'urine, émise spontanément par la souris pendant quelques secondes en pressant la vessie, sera collectée tous les 3 jours et un prélèvement sanguin durant quelques minutes sera effectué après 7 jours. Un groupe de souris sera auparavant exposé à des rayons X afin d'éliminer les cellules de la moelle osseuse qui sont remplacées le lendemain par injection intraveineuse de cellules de la moelle d'autres souris qui n'ont pas notre protéine d'interêt. Un autre groupe de souris sera auparavant injecté soit par voie intraveineuse, soit directement dans le rein par une procédure chirurgicale avec des particules virales qui permettent de modifier la production de notre protéine d'intêret. A la fin des procédures,un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale et les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien être de l'animal. La maladie rénale est associée à la présence de protéines dans les urines et à un gonflement du ventre (oedème rénal). La durée du protocole est établie pour éviter un développement trop important de la maladie et donc éviter au maximum la souffrance des animaux. Ils sont cependant anesthésiés plusieurs fois pour réaliser des injections et prélèvements sanguins et certains auront une petite chirurgie qui peut engendrer un inconfort et une douleur modérée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir analyser les reins.
Remplacement
L'étude des cellules, celle de la fonction de l'inibiteur vasculaire étudié et l'étude des fonctions rénales nécessitent la présence des conditions caractéristiques de la circulation sanguine que l'on ne peut retrouver que dans un être vivant. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés. Nous prévoyons de faire les expérimentations en deux fois sur deux groupes de souris. Si le premier groupe montrait l'absence flagrante d'effet de notre protéine d'interêt ou de l'injection des particules virales, nous ne ferons pas de deuxième groupe.
Raffinement
La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 3 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés. Les prélèvements sanguins et la chirurigie seront effectuées sous anesthésie et analgésie. Un antibiotique est donné après l'exposition aux rayons X pour éviter toute infection.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, le modèle de glomerulonephrite est bien établi chez la souris adulte. Les souris de 10-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interêt, avec de surcroit la disponibilité des lignées avec des déficits spécifiques de cette protéine. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit les processus pathologiques qui peuvent être favorisés par l'age.
Modulation métaboliques et transcriptionnelles dans la rétine au cours du processus neurodégénératif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour étudier les atteintes de la rétine dans des maladies neurodégénératives. Elles subissent des prélèvements de larmes, des injections intrapéritonéales et des injections dans l'œil de vecteurs viraux sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le système nerveux central. Le porteur indique que l'injection dans l'œil provoque une douleur locale et une sécheresse oculaire, traitées par gel et antalgique, et que les modèles de Parkinson restent asymptomatiques sur la période étudiée. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable, tout en prévoyant d'approfondir ensuite les analyses sur des cultures de rétine.
Objectifs
L'impact des handicaps visuels (atrophies optiques, glaucome, dégénérescence maculaire) s’accroît dans nos pays développés avec l’augmentation de la communication visuelle et le vieillissement de la population. Des déficiences du système visuel sont également retrouvées dans des pathologies neurodégénératives, qu’elles ciblent directement le système visuel comme dans le cas de l'Atrophie Optique Dominante (AOD), ou indirectement comme la Maladie de Parkinson (MP). En effet, la patients atteints de MP subissent des troubles visuels très précocement, avant même l’apparition des premiers symptômes moteurs. De ce fait, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires expliquant ces défaillances visuelles pourrait permettre de déterminer des facteurs prédictifs ou pronostiques de l'évolution de ces pathologies. L’AOD et la MP ont des étiologies très différentes mais présentent toutes 2 des troubles dans la physiologie de la rétine et/ou du nerf optique, liées à des défauts de l’activité des mitochondries. Ces dysfonctions mitochondriales produisent un stress cellulaire auquel les cellules tentent de répondre en modifiant leur activité métabolique et ceci passe par une reprogrammation de l’expression de certains gènes. Ainsi, notre projet vise à étudier le remodelage métabolique et transcriptionnel de la rétine et du nerf optique au cours de l’évolution des processus dégénératifs dans le but d’étudier la sensibilité particulière de la rétine dans le processus neurodégénératif et de déterminer de potentiels biomarqueurs pronostiques précoces pour ces pathologies.
Bénéfices attendus
Notre projet, validé par différentes instances scientifiques et financeurs, permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes physiopathologiques de ces maladies, notamment dans leurs étapes précoces impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux dans les neurones. Nos résultats permettront également de définir des biomarqueurs pronostiques précoces, voire des cibles thérapeutiques pour ces pathologies pour lesquelles il n’existe encore à l’heure actuelle que très peu de prise en charge.
Procédures
Les animaux seront soumis à (1) des prélèvements non-invasifs sur animaux vigiles (larmes), de facon hébodmadaire tout au cours de lexpérimentation - ces prélèvements sont réalisés à l'aide de papier buvard (30 secondes) ; (2) injections intrapéritonéales sur animaux vigiles (1ml/100g, 5 secondes) ; (3) des procédures chirurgicales sous anesthésie : injections intravitréennes de vecteurs viraux (2ul, 1 min). Tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Les injections intravitréennes de vecteurs viraux induisent une douleur locale et transitoire qui sera gérée par l’application de d’un antalgique oculaire juste après l’injection. Une sécheresse oculaire peut également être observée dans les 2 à 3 jours qui suivent l’injections. Nous appliquerons systématiquement et quotidiennement un gel lubrifiant sur les yeux des souris les 3 premiers jours après l’injection. Les modèles de Parkinson que nous utiliserons dans ce projet sont asymptomatiques pour les périodes étudiées, les souris ne devraient donc pas présenter de stress, douleur ou de souffrance particulière en dehors des procédures d’injection et chirurgie, qui seront elles réalisées sous analgésie/anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanisés en fin de procédure car les études porteront sur les tissus frais du système nerveux central.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies et des interactions cellulaires impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Néanmoins, une fois que nous aurons validé ces points chez l’animal, l’analyse des mécanismes moléculaires sera approfondie à partir de cultures organotypiques de rétines murines que nous avons également mis en place au laboratoire.
Réduction
Nous planifierons chaque expérience pour minimiser le nombre d’animaux tout en permettant une analyse statistique fiable de nos résultats. Pour le modèle d’AOD, la déplétion d’OPA1 induite avec une injection de vecteur viral sera réalisée sur un œil, tandis que l’autre œil recevra le vecteur contrôle, minimisant ainsi à la fois le nombre de souris et le risque de variabilité inter-groupes. Les modèles d’induction de Parkinson choisis ont été déjà validés par nous-mêmes et nos collaborateurs et nous savons que des groupes de 5 souris sont en général suffisants pour pouvoir exploiter les résultats. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi rapproché quotidien des animaux dès l’initiation des différents modèles. Ce suivi nous permettra d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée et l’animal euthanasié en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences tenus à jour des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour le développement de ces modèles pathologiques du fait de son faible coût, de sa facilité de manipulation et de son adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour être déficients en Foxo3 ou exprimer une sous unité ribosomique taguée qui n’existent que chez la souris. Enfin, les caractéristiques des modèles de MP et d’AOD utilisés dans ce projet ont été établis chez cet animal, et nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc ...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Amélioration de la longévité et de la régénération tissulaire par un court traitement de reprogrammation tardive
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
56 souris âgées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée pour prélever des organes, l'autre suivie jusqu'à la fin de sa vie pour mesurer sa longévité. Elles reçoivent soit une reprogrammation cellulaire par un composé dans l'eau de boisson, soit des injections de plasma de jeunes souris deux fois par semaine pendant deux mois, avec des prises de sang mensuelles. Le porteur décrit des nuisances mineures, une douleur possible aux points d'injection et lors des prises de sang, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids. Il affirme que l'effet du plasma jeune et de la reprogrammation sur le vieillissement ne peut s'étudier ni chez l'humain ni in vitro.
Objectifs
Une avancée importante a été réalisée en 2006 avec la capacité de reprogrammer des cellules somatiques adultes en exprimant une combinaison de facteurs de transcription pour les ramener à un état pluripotent (c'est-à-dire qu'elles peuvent se différencier en cellules des trois couches embryonnaires). Les cellules reprogrammées de cette manière sont appelées iPSC (cellules souches pluripotentes induites). Ces cellules présentent les mêmes caractéristiques qu'une cellule souche embryonnaire, à savoir l'autorenouvellement et la pluripotence. Ce projet est basé sur ce concept de reprogrammation cellulaire et vise à étudier l'impact de la reprogrammation courte sur le vieillissement et la régénération des tissus au cours du vieillissement. Pour ce faire, nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifié pour induire une reprogrammation cellulaire transitoire in vivo. Pour aborder le vieillissement, nous avons travaillé dans notre laboratoire sur un phénotype dommageable du modèle de souris accéléré du vieillissement, la progéria, classée comme sévère. À la suite des résultats obtenus avec la progéria, la nouvelle procédure vise à effectuer le même traitement de reprogrammation à l'aide de la doxicycline sur des souris naturellement âgées sans phénotype dommageable (classées comme légères). Sur un autre lot de souris âgées, des injections de plasma jeune acheté seront réalisées pour tester l'effet des facteurs circulants dans le plasma de jeunes souris sur la reprogrammation cellulaire (classée comme légère), qui a été démontrée comme ayant un impact rajeunissant sur les cellules sénescentes.
Bénéfices attendus
Créer des opportunités nouvelles pour la prévention et le traitement des maladies associées au vieillissement. Cette étude aidera les chercheurs à mieux comprendre les changements biologiques typiques qui accompagnent le vieillissement et à améliorer la régénération métabolique des tissus des personnes âgées.
Procédures
Pour la reprogrammation avec la doxicycline dans l'eau du biberon, les souris seront traitées pendant 16 jours seulement, sans aucune autre intervention. Pour l'injection de plasma, les souris seront injectées deux fois par semaine pendant deux mois, la première IP: 15 secondes, contention comprise, et la deuxième injection IV : 1 minute, contention comprise. Les prélèvements sanguins seront effectués une fois par mois pendant la durée du traitement et dureront 1 minute par souris, contention comprise.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables mineurs peuvent survenir, tels que le stress lors de la manipulation. Les animaux doivent donc être familiarisés avec l'environnement, la contention physique et l'interaction avec le personnel. Il est possible que les injections de plasma provoquent une douleur au point d'injection. La prise de sang peut être douloureuse. Il ne devrait pas y avoir d'effets secondaires douloureux suite au traitement.
Devenir
Quelques animaux seront euthanasiés à la fin du traitement doxicycline et les organes seront prélevés pour fournir des groupes homogènes de tissus de souris âgées à des fins d'analyse et de comparaison avec nos résultats précédents, tandis que les animaux restants seront utilisés pour l'étude de longévité afin d'étudier l'effet sur la prolongation de la durée de vie. De même pour le plasma, les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour fournir des groupes homogènes de tissus de souris âgées afin de les analyser et de les comparer.
Remplacement
L’étude de l’influence de la reprogrammation transitoire et l'effet du plasma jeune sur le vieillissement d’un organisme ne peut être mise en place chez l’homme ou in vitro, d’où la nécessité d’avoir recours à des animaux pour mener de telles études. Cette approche permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents et d'évaluer les effets potentiels de ces interventions sur le vieillissement et la santé.
Réduction
Le projet approuvé a commencé avec un nombre de souris progeria qui a été réduit et non atteint. Pour confirmer les résultats obtenus sur des souris naturellement âgées, un groupe plus petit sera utilisé. Afin de respecter la règle des 3Rs et de réduire autant que possible l'utilisation de souris. Nous utiliserons les deux sexes, mâles et femelles. En outre, nous avons décidé de considérer un premier groupe d'induction à la doxicycline de 20 souris pour la longévité et de 16 souris pour la collecte d'organes, comme cela a été publié dans la littérature. Pour l'injection de plasma, 20 souris est le minimum requis, 10 étant le groupe de contrôle et 10 pour le groupe traité.
Raffinement
Les deux procédures ne nécessitent aucun type d'anesthésie ou d'analgésie. L’examen journalier des souris sera effectué pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies (isolement, absence de mobilité, perte d’appétit, hérissement des poils, dos voûté…). L’état de santé des animaux sera évalué par les tests de réflexe du retournement et de la capacité d'agrippement qui constitueront un point limite entrainant la mise à mort de l’animal. Si une perte de poids de 20% du poids maximal est observée, les animaux seront mis à mort et sortis du lot expérimental. Si une réhydratation ou un enrichissement est nécessaire, de la nourriture, de l'eau gélifiée et de l’enrichissement seront ajoutées à la cage.
Choix des espèces
Les génotypes complexes nécessaires à cette étude ne sont accessibles que chez la souris. La souris que nous avons utilisée dans la première partie de ce projet présente un état vieillissant au bout de 6 mois et décède au bout de 9 mois environ. Les résultats obtenus seront comparés à ceux de souris naturellement âgées. Afin de suivre l’impact de l’action tardive d’une reprogrammation transitoire sur le vieillissement, les souris sont traitées à 94 semaines puis suivies tout le long de leur vie pour suivre l'impact sur leur longévité. Un groupe d'animaux sera euthanasié à 102 semaines afin de disposer de groupes homogènes de tissus de souris âgées pour analyse et comparaison avec nos résultats précédents. Parallèlement, afin de tester la possibilité d'une reprogrammation et d'un rajeunissement cellulaires dus à des facteurs circulatoires juvéniles, des souris sauvages âgées de 94 semaines seront injectées puis euthanasiées à 102 semaines afin de disposer de groupes homogènes de tissus de souris âgées pour analyse et comparaison avec nos résultats précédents. Les périodes utilisées sont en accord avec les résultats précédemment obtenus au laboratoire.
Fonction et potentiel thérapeutique des neutrophiles dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dans deux modèles de la maladie de Charcot. Elles reçoivent des anticorps par voie intraveineuse et des prises de sang, sont suivies par des tests de motricité et de coordination, puis subissent une ponction intracardiaque sous dose létale d'anesthésique pour prélever le système nerveux. Le porteur indique que l'un des modèles perd progressivement sa masse musculaire jusqu'à des difficultés à se déplacer et que la maladie y est fatale, tout en affirmant que les souris ne montrent pas de signes de douleur. Il présente le recours à l'animal comme "indispensable" et le seul à reproduire les interactions entre système immunitaire et système nerveux.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, fatale, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles volontaires. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Malgré l'explosion des connaissances sur les processus pathologiques centrés autour du neurone moteur, d’autres faisceaux d’évidences suggèrent que la maladie met en jeu le système immunitaire. Le système immunitaire comprend de nombreux médiateurs de l’inflammation, un processus qui peut influencer les maladies neurodégénératives comme la maladie de Charcot. Les neutrophiles représentent une population de globules blancs très abondante dans le sang et la première barrière de défense de l’organisme contre les infections bactériennes. Ils ont récemment été montrés comme jouant un rôle dans la maladie d’Alzheimer. En revanche leur rôle dans la maladie de Charcot demeure inconnu. Notre objectif est de comprendre la fonction des neutrophiles dans la maladie et d’évaluer leur potentiel comme cible thérapeutique. A cette fin, nous aborderons cette problématique par une description précise des défauts de cette population de cellules immunitaires au cours du temps. Notre dernier objectif est d’évaluer une approche d’immunothérapie visant sélectivement les neutrophiles. Le but de ce projet est donc de fournir un nouvel éclairage sur la maladie en mettant en évidence la contribution d’un nouveau type cellulaire du système immunitaire et offrir de nouvelles perspectives.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux acteurs cellulaires qui contribuent à la dégénérescence des neurones moteurs dans la maladie de Charcot permet d’avoir une vue plus complète de la maladie et proposer ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les bénéfices de cette étude présentent donc un potentiel clinique. Ce projet propose de faire progresser nos connaissances scientifiques sur cette pathologie qui est particulièrement complexe. Notre connaissance encore incomplète de la pathologie explique pour une grande part les nombreux échecs thérapeutiques rencontrés chez les patients jusqu’à présent. Notre projet propose d’explorer une population de cellules du système immunitaire. Facile d’accès en terme thérapeutique, le système immunitaire facilite ainsi le développement des thérapies. Notre projet explore une approche d’anticorps thérapeutiques qui a un fort potentiel clinique comme l’illustre l’efficacité des anticorps médicaments dans la sclérose en plaque par exemple. L’utilisation de deux modèles différents de la maladie est un point fort de cette étude en mimant l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux modèles différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet.
Procédures
Le projet implique de délivrer des anticorps thérapeutiques dans la circulation sanguine des souris et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celle d’une piqure. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions le rôle de certaines populations de globules blancs dans la pathologie et leur potentiel thérapeutique. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux et de cytométrie du système immunitaire. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaques sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Des souris pourront se trouver hébergées individuellement, dans un environnement enrichie amplifié pour une durée de 21 jours.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien caractérisés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées de souris est la diminution des capacités motrices. Ces modèles présentent une atteinte motrice variable, un début et une progression de la maladie différents. Les modèles de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits quant au tableau et à la chronologie clinique de la pathologie. Un des modèles présentent une réduction progressive de la masse musculaire commençant par les membres inférieurs. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés déambulatoires. Le deuxième modèle perd très lentement ses capacités à effectuer une tache motrice et présente une posture anormale (dandinement) qui est stable pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise poids. Ce modèle présente une atteinte motrice plus légère qui n’est pas associée à une espérance de vie plus courte. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par des anticorps thérapeutiques. L’administration d’anticorps thérapeutiques dans la circulation est une approche peu invasive, maitrisée et standardisée. Les animaux qui rentrent dans l’évaluation thérapeutique sont impliqués dans du comportement moteur consistant à évaluer de façon non-invasive, non-douloureuse, très peu contraignante et de courte durée la capacité à effectuer une activité motrice simple.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les liens entre système immunitaire et système nerveux central et déterminer les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. L’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans un des modèles murins utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
La maladie de Charcot est une maladie fatale et incurable qui se caractérise par une perte des neurones qui contrôlent l’activité des muscles squelettiques. L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux. Une telle interaction qui se met en place durant des mois et qui implique d’autres cellules autres que le neurone moteur, ne peut pas être mimée in vitro. Seul les modèles expérimentaux mammifères présentent la complexité des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules du système nerveux, et les barrières physiologiques comme les méninges. Cependant, afin d’explorer les mécanismes impliqués dans l’interactions neutrophiles et neurones moteurs, nous développons des systèmes de cultures in vitro entre neutrophiles et neurones moteurs. Notre objectif étant également de développer une thérapie utilisant des anticorps ciblant cette population de globules blancs, l’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est également indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre système immunitaire et système nerveux requiert un modèle physiologique complet que seul l’animal offre. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 4 années, un nombre total de 590 souris. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la SLA chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques, de séquençage et de cytométrie. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologique, de séquençage et de cytométrie. Afin de minimiser le nombre d’animaux, ceux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. Nous utilisons également des cohortes mixtes male et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage. Notre projet inclut également une étude in vitro qui permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, lanières de papier craft et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Pour chaque modèle animal de la maladie de Charcot un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration d’anticorps thérapeutiques est réalisée avec un anesthésique appliqué localement et les animaux sont suivis régulièrement après chaque injection. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celui de l’homme. Les modèles de la maladie de Charcot qui sont utilisés récapitulent les principales étapes de la maladie. Nous utiliserons 2 modèles différents qui permettent de représenter l’hétérogénéité clinique et génétique de la maladie. Afin de suivre la maladie nous utiliserons les lignées à trois stades significatifs. L’âge de chaque stade étant différent en fonction du modèle. Nous utiliserons les souris 1) au stade précédent les premiers signes moteurs, c’est le stade asymptomatique. 2) Le stade de début de la maladie ou les premiers signes moteurs sont quantifiables. 3) Un stade ou la maladie est installée, qui est le stade symptomatique. L’espérance de vie des souris est également étudiée dans une procédure thérapeutique.
Rôle du microbiote intestinal sur le phénotype mastocytaire des souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans le développement de certaines cellules immunitaires. Elles reçoivent des gavages quotidiens d'antibiotiques et de laxatif pendant une semaine pour supprimer leur microbiote, puis une partie subit des gavages de bactéries, avant mise à mort pour prélever les intestins. Le porteur qualifie le gavage répété de source de stress et l'antibiothérapie de sans effet comportemental majeur. Il présente les souris comme des modèles "incontournables" faute de modèle cellulaire satisfaisant.
Objectifs
Au sein du laboratoire, des données préliminaires d'analyses génétiques décèlent deux populations de mastocytes au sein de l'organisme : les mastocytes muqueux et les mastocytes connectifs. Les mastocytes connectifs se développent en période prénatale (dans le fœtus), indépendamment du microbiote tandis que les mastocytes muqueux n'apparaissent que plus tardivement (après la naissance) et colonisent des endroits particulièrement riches en microbiote ; à savoir le tractus digestif et les poumons. De plus, notre étude sur des souris Germ-Free (nées exemptes de microbiote) montre une baisse du nombre de mastocytes muqueux par rapport à des souris contrôles avec microbiote. Nous émettons donc l'hypothèse que le microbiote joue un rôle dans le développement et le maintien de cette population de mastocytes muqueux au sein de l'organisme. Les objectifs de ce projet sont donc de 1) déterminer si la perte du microbiote intestinal, à l'âge adulte, altère le nombre/phénotype/localisation des mastocytes muqueux, 2) savoir s'il existe une fenêtre temporelle critique en post-natal durant laquelle le microbiote jouerait un rôle crucial dans le développement des mastocytes muqueux et leur survie au sein de l'intestin et à terme 3) définir les voies de signalisation entre le microbiote et les mastocytes, si elles existent, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mettre en évidence, s'il existe, un rôle du microbiote dans le développement des mastocytes, plus précisément les mastocytes muqueux et/ou un rôle de celui-ci dans le maintien de cette population au sein de leur niche intestinale. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de mettre en lumière une potentielle fenêtre temporelle durant laquelle le microbiote exerce son rôle. Pour finir, si une interaction microbiote - mastocyte existe, ce projet permettra aussi de décrire les voies de signalisation sous-jacentes.
Procédures
Les animaux seront soumis uniquement à des gavages d'antibiotiques et de polyéthylène glycol à hauteur de 7 fois par semaine (5 jours d'antibiotiques + 1 jour de polyéthylène glycol deux fois) pendant une semaine seulement dans le but de dépléter leur microbiote intestinal. Par la suite, 1500 d'entre eux seront soumis à un deuxième protocole de gavage par des souches bactériennes, 3 fois par semaine pendant une semaine. Chaque gavage représente une manipulation brève, d'environ 10 secondes afin de limiter le stress de l'animal. Entre les deux procédures, les souris ne subiront aucune autre intervention pour une durée de deux semaines.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de nos expériences, les manipulations ainsi que le gavage a répétition peuvent entrainer un stress chez les animaux. L'antibiothérapie en elle-même n'induit en revanche aucun changement comportemental majeur connu à ce jour dans la littérature.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes, majoritairement les intestins et évaluer leur phénotype mastocytaire par FACS et imagerie confocale.
Remplacement
Ce projet vise à étudier le rôle du microbiote dans le maintien des différentes populations de mastocytes présentes au niveau intestinal. Il n’existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de ce phénomène. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact du microbiote sur les phénotype mastocytaire, in vivo.
Réduction
L’expérience du porteur du projet sur les mastocytes et des collaborateurs sur le microbiote nous permet d’anticiper et optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous effectuerons l’analyse sur un nombre total de 1560 souris sur une période de 3 ans avec 10 souris par groupe et par condition. Les expériences qui seront réalisées ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombres déterminés sur la base de la littérature et de l’expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, pour des tests statistiques de type Mann Whitney ou test-t non appariés pour la comparaison de deux moyennes, ou de type ANOVA à deux facteurs avec post test de type Bonferoni pour l’analyse de données à deux variables.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons divers paramètres de manière quotidienne (1 fois par jour) : poids, température et signes extérieurs de stress afin de s'assurer du bien-être des animaux. La surveillance des fèces sera notamment mise en place lors de l'administration du polyéthylène glycol pendant les 48 heures suivant l'administration.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains. L’organisation du microbiote intestinal de la souris, qui nous intéresse dans le cadre de ce projet, est similaire à celle chez l’Homme avec une forte concentration au niveau des parties intestinales basses. Tout comme chez l’Homme, l’antibiothérapie a été largement démontrée comme impactant la flore intestinale de ces animaux et est largement utilisée par la communauté scientifique comme outil de déplétion du microbiote. La moitié des animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les souris restantes seront, elles, utilisées entre 2 et 8 semaines post-naissance afin d'évaluer la fenêtre temporelle durant laquelle le microbiote jouerait un rôle dans le développement des mastocytes muqueux.
Comparaison de l’efficacité thérapeutique d’approches de radiothérapie chez des modèles sous-cutanés dérivés de patients
- Recherche fondamentale
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un fragment de tumeur de patient est implanté sous la peau du flanc par incision chirurgicale, puis les animaux reçoivent des injections et une irradiation ciblée de la tumeur, pour comparer deux approches de radiothérapie interne à la radiothérapie externe dans des cancers du pancréas et de l'ovaire. Le porteur décrit des douleurs aux points d'injection et une mise à mort dès une perte de poids de 20 % ou une tumeur dépassant 1 500 mm³. Les bénéfices pour les patients sont rattachés à un "transfert clinique" envisagé avec un industriel à l'issue de l'étude.
Objectifs
Les cancers pancréatiques et ovariens souffrent aujourd'hui de mauvais prognostics liés à un diagnostique tardif et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer deux approches de radiothérapie interne vectorisée établies au sein de l'équipe porteuse du projet dans des modèles dérivés de patient de cancer pancréatique et ovarien greffés chez des souris pour mimer au plus près ces cancers. Nous comparerons ces nouvelles approches thérapeutiques à la radiothérapie externe conventionellement appliquée pour le traitement de ces cancers. Nous souhaitons in fine démontrer les bénéfices des approches de radiothérapie interne vectorisée par rapport à la radiothérapie externe pour envisager le transfert clinique de nos approches.
Bénéfices attendus
La validation de l'efficacité thérapeutique de ces approches à fort potentiel de transfert clinique pourrait apporter une option de thérapie ciblée pour les 14’000 et 5'320 patients atteints de cancers pancréatiques et ovariens diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel.
Procédures
-injection en sous-cutanée via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (30 sec/animal) -anesthésie de l’animal à l’isoflurane (4% pour l’induction puis 2% pour le maintien) (3 min/animal) - incision de 0.3 à 0.8 cm avec un ciseau stérile sur le flanc gauche de l'animal (30 sec/animal) - création d'un tunnel sous cutané avec une pince fermée (30 sec/animal) - insertion d'un fragment de tumeur d’environ 30 mm3 à l’aide de pinces dans l’incision au fond du tunnel (1 minute/animal). - fermeture de l’incision à l’aide de 1 ou 2 points fil de chirurgie 6.0 non-résorbable (1 minute/animal) - acquistion scanner + tomographie par emission de positrion (15-35 minutes/animal) - injection par voie intraveineuse (veine caudale) via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (1 min/animal) - injection intrapéritonéale via une seringue de 1 mL montée avec une aiguille 25 G avec contention de l'animal (1 min/animal) - irradiation de la zone tumorale 1x1cm avec un irradiateur XenX (Xstrahl) sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une implantation d'un fragment tumoral sous-cutané. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adaptée pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).
Remplacement
Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution et l'efficacité thérapeutique d’un radiopharmaceutique tout en considérant l'accumulation et la toxicité au niveau des tissus sains.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivi par une technique d’imagerie non invasive (tomographie par emission de positron) couplé à la tomodensitométrie pour définir le meilleur modèle vivo pour les approches de radiothérapie, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie. La taille des différents groupes de cette étude a été défini avec l'aide de biostatisticiens pour fournir une puissance suffisante sur la base de l'analyse de nos résultats préliminaires. Les résultats de cette étude seront analysés en collaboration avec une équipe de biostatistique.
Raffinement
L'environnement des animaux est stable et contrôlé (air ambiant, température, humidité, luminosité). L'hébergement est enrichi d’accessoires permettant l'expression de certains comportements naturels par l'animal et participant ainsi à leur bien-être. Une alimentation et de l'eau mis à disposition des animaux. Les animaux sont hébergés en groupes restreints (n=5). Une surveillance sanitaire trimestrielle permet de s'assurer de l'absence de pathogène et d'agent pathogène opportunistique, assurant ainsi la bonne santé des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Les signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique seront classés et rapportés selon la fiche de suivi clinique. Tout score ≥ 6 conduira au sacrifice de l’animal. De manière plus spécifique, les points limites pour ce protocole sont : - une perte de poids supérieure à 20% du poids initial - un volume tumoral > 1500 mm3. Ces points limites ont été établis lors d'expérimentations préliminaires afin de prévenir une dégradation de l'état général des animaux (e.g. perte de poids, réduction de la consommation alimentaire, déshydratation). L’utilisation de produits anesthésiques et analgésiques permettra de réduire ou supprimer la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle murin est particulièrement adapté pour ces expérimentations puisqu'il possède des mécanismes d'absorption, de métabolisme et d'élimination très proche de l'homme. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques et ovariens étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en âge adulte. Le sexe femelle est nécessaire pour les cancers ovariens.
Étude de l’impact du biallélisme Tlr7 sur l’immunité humorale protectrice lors de la vaccination contre la grippe H1N1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.
Objectifs
La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.
Bénéfices attendus
Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.
Procédures
prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure
Impact sur les animaux
Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure
Remplacement
Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)
Réduction
Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).
Raffinement
Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).
Choix des espèces
Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance