Souris

860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une fibrose du foie, parfois des tumeurs hépatiques que le porteur décrit comme asymptomatiques, elles subissent une chirurgie terminale unique sous anesthésie sans réveil, pour prélever le foie et en isoler des cellules fibrogéniques. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire pour reproduire ces interactions et qu'une comparaison rigoureuse du modèle est "indispensable". Il écarte les lignées cellulaires existantes, jugées non représentatives des sous-populations visées.

Objectifs

La fibrose hépatique constitue un enjeu majeur de santé publique. Elle se caractérise par un dépôt excessif de matrice extracellulaire, synthétisée par une population de cellules hétérogènes : les myofibroblastes. Une population de myofibroblastes ayant des caractéristiques particulières a été récemment identifié. Notre postulat est que ces myofibroblastes spécifiques induisent la progression de la fibrose et qu'il serait avantageux de les détruire chez les sujets ayant une fibrose à un stade avancé, plutôt que d'autres types de myofibroblastes qui interviennent dans la réparation tissulaire. Pour produire les outils permettant le ciblage spécifique de cette population ou de tous les myofibroblastes du foie, nous devons au préalable isoler ces cellules à partir du foie sain et fibreux et identifier des marqueurs spécifiques de ces cellules par des études moléculaires. Différents vecteurs viraux dont la finalité est l’expression de gènes suicides spécifiquement dans la population de myofibroblaste cible ou dans tous les myofibroblastes hépatiques, seront générés à partir de ces données et testés sur les différents types cellulaires hépatiques.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, ce projet pourrait permettre de développer des outils thérapeutiques anti-fibrotiques. Les bénéfices attendus du projet sont : - Une meilleure caractérisation des cellules fibrogéniques du foie et de leurs précurseurs en vue de leur ablation ciblée à l’avenir par thérapie génique. Une meilleure caractérisation d'un des modèles de souris transgéniques les plus utilisés pour mimer les maladies biliaires et plus généralement de fibrose hépatique. Les travaux utilisant ce modèle ont porté sur des souris sur différents fonds génétiques. Cependant, une comparaison rigoureuse est indispensable pour une connaissance approfondie et une utilisation optimale du modèle.

Procédures

Les souris transgéniques utilisés dans ce projet développent des lésions du foie qui habituellement n’entrainent aucun symptôme jusqu’à l’âge de 12 mois, qui correspond à l’âge maximal inclus dans cette étude. Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale unique et terminale sous anesthésie générale et analgésie d’une durée maximale de 15-20 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé développe une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois chez les souris sur fonds FVB/n (d’après notre expérience) ou C57BL/6J (d’après la littérature). Des tumeurs hépatiques de type carcinome hépatocellulaire, peuvent apparaître à partir de l’âge de 9 mois mais restent asymptomatiques et n’entraînent aucune surmortalité par rapport à des souris sauvages au moins jusqu’à l’âge de 17 mois. Une injection sous-cutanée préalable à l’anesthésie afin d’administrer un anti-douleur pourrait causer une gène et un stress transitoire liés à la contention et l’introduction de l’aiguille. Par la suite, les seuls actes réalisés sur les animaux seront effectués sous anesthésie et les nuisances sont donc celles associés à l’anesthésie : hypothermie, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc. Les animaux ne se réveilleront pas à l’issue de l’anesthésie car l’euthanasie interviendra durant celle-ci.

Devenir

Le prélèvement du foie entier ou pour isolement cellulaire ne permet pas la survie des animaux. Les animaux seront donc tous euthanasiés à la fin des procédures pour perfusion ou explantation du foie qui est requis pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire 1) pour reproduire les interactions inter-cellulaires et inter-organes aboutissant dans l’organisme entier à une maladie biliaire et à la fibrose hépatique et 2) pour définir le transcriptome des cellules fibrogéniques du foie ayant été activées in vivo, dans l’organe entier. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec ses interactions inter-cellulaires et inter-organes. Par ailleurs, il existe des lignées de cellules fibrogéniques, mais celles-ci ne sont pas représentatives des sous-populations auxquelles nous faisons référence dans ce projet, et qui ne peuvent être étudiées qu'en culture primaire, qui ne peuvent être obtenues qu’à partir d’un nombre important de souris.

Réduction

Le projet impliquera un total de 860 animaux. Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les tests des vecteurs viraux seront réalisés sur des cellules primaires qui sont amplifiées en culture après isolement, mais qui ne peuvent être maintenues à long terme. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, toutes les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : L'existence d'un modèle de souris transgénique mimant la cholangite sclérosante primitive chez l'homme justifie le choix de l'espèce. Un tel modèle n'existe pas chez les autres espèces. Justification des stades de développement : Le modèle de souris transgénique utilisé développe une fibrose biliaire qui évolue avec le temps. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes dans lesquels les lésions sont déjà présentes mais à un stade débutant (4 semaines), jusqu'à un âge plus avancé pour suivre l'évolution des lésions (12 mois). Le but étant d'avoir des échantillons représentant les différents stades de la maladie. Justification du sexe : Chez la souris, comme chez l’Homme, la gravité des lésions hépatiques est variable en fonction du sexe. C’est pourquoi, il est nécessaire d’inclure dans ce projet environ 50% de souris mâles et 50% de souris femelles.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies puis soumises trois mois à un régime gras déséquilibré, elles subissent un test de tolérance au glucose puis une chirurgie d'accident vasculaire cérébral de dix à quarante minutes, qui provoque une douleur peropératoire, des pertes sensorimotrices et une perte de poids. Le porteur indique qu'une première étape sert surtout à choisir le meilleur modèle et à faire acquérir le geste chirurgical par deux personnes du laboratoire. Il écarte le remplacement en affirmant que l'étude ne peut s'envisager que dans un "organisme entier", et justifie la mise à mort par le prélèvement des tissus.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de déterminer le meilleur modèle d’étude de la maladie chez le sujet âgé. Dans un premier temps nous comparerons deux modèles classiquement utilisés et qui sont les plus proches de l’accident vasculaire cérébral chez l’homme. Dans un second temps, le modèle choisi fera l’objet d’une acquisition du geste chirurgical par deux personnes pour permettre la continuité de la compétence acquise au sein du laboratoire. Enfin, le modèle sélectionné et acquis par le personnel compétent sera appliqué dans le cadre d’une première étude dont le but est de prendre en compte le rôle de l’âge et des comorbidités associées dans l’accident vasculaire cérébral. En effet, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude permettra de choisir un modèle d'étude fiable et reproductible pour mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en place un modèle adapté et robuste pour comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Tout d’abord, nous testerons 2 différents modèles d’accident vasculaire cérébral ischémique chez des animaux de plus de 9+/- 2 mois. La chirurgie est de 40min pour le modèle semi permanent (procédure 1) et de 10 min pour le modèle permanent (procédure 2). Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo, préalablement retenu, d'ischémie cérébrale (chirurgie de 10 ou 40 min). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés à 72h après la mise en place du modèle d’accident vasculaire cérébral à l’aide de tests de comportement et de l’imagerie post mortem.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). Le test d'intolérance au glucose pourra induire une légère douleur de courte durée (1 injection intrapéritonéale de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie). Le modèle d’accident vasculaire cérébral induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire de l’imagerie

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale dans un contexte de vieillissement vasculaire et comorbidités liées à l’âge, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’accident vasculaire cérébral. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

1 722 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un agent inflammatoire est appliqué sur l'oreille sous forme de goutte, de piqûres superficielles ou d'injection, suivi de sessions d'imagerie sous anesthésie pouvant durer jusqu'à deux heures et répétées jusqu'à sept fois, pour étudier la migration des cellules immunitaires dans la peau enflammée. Le porteur compare la gêne à celle ressentie après un vaccin et l'affirme "limitée en temps et intensité". Il reconnaît l'existence de modèles in vitro mais affirme que la souris reste "indispensable" pour disposer d'un tissu et d'un système immunitaire complets.

Objectifs

La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice, maintient la température corporelle stable et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches : l’épiderme, le derme et l’hypoderme. L’épiderme, la couche externe, est principalement constitué de kératinocytes qui synthétisent la kératine, une protéine qui protège la peau contre les dommages et la déshydratation. Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. Enfin, l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique et agit comme un coussin pour les organes internes. Dans le derme et l’épiderme des tissus, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Dans les tissus, la migration des cellules immunitaires est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation ou d’infection par exemple. Notre projet vise à comprendre comment les propriétés de la peau sont modifiées par différents signaux inflammatoires, et comment cela affecte la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans ce tissu.

Bénéfices attendus

Comprendre comment l’inflammation modifie les tissus et la migration des cellules immunitaires permettra à la fois d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus, mais également de déchiffrer certains des mécanismes déterminants dans les stratégies de vaccination, où une inflammation est générée artificiellement afin de stimuler la réponse immunitaire mémoire. Nos résultats pourraient par exemple aider aux choix des composés d’un vaccin, en particulier de l’adjuvant utilisé, ou de la voie d’administration. Ces résultats permettront aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies inflammatoires chroniques comme le psoriasis.

Procédures

La première procédure vise à évaluer l’effet d’une inflammation locale aigue de la peau sur la structure du tissu et l’infiltration du tissu par les cellules immunitaires. Les souris sont anesthésiées. Un agent inflammatoire est appliqué sur une des 2 oreilles (goutte de liquide, goutte de liquide + piqures superficielles, ou injection sous cutanée), 1 seule fois par expérience. Les souris sont ensuite remises dans leurs cages pour le réveil. L’anesthésie de chaque animal dure au maximum 10 minutes. La seconde procédure vise à déterminer comment la modification de la structure du tissu par l’inflammation aigue impacte la migration des cellules immunitaires dans le tissu (derme et épiderme) au pic de l’inflammation. L’inflammation est réalisée comme dans la première procédure. 5 minutes avant la mise à mort, les souris sont anesthésiées et un marqueur des vaisseaux est injecté en intraveineuse, 1 seule fois par expérience (durée du geste inférieur à 30 secondes). La troisième procédure vise à évaluer les effets de l’inflammation aigue sur la migration des cellules immunitaires depuis l’application de l’agent jusqu’à la résolution totale de l’inflammation et le retour à l’état normal du tissu. L’inflammation est réalisée comme dans la première procédure. Pour l’imagerie, les souris sont anesthésiées, un marqueur des vaisseaux est injecté en intraveineuse, puis les souris sont placées sur le flanc dans une enceinte chauffée et l’oreille est immobilisée sous le microscope. Chaque session d’imagerie dure maximum 1h30. L’anesthésie dure maximum 2h. Chaque souris est imagée au maximum 1 jour sur 2, au plus 7 fois. Les mêmes procédures sont réalisées sur un autre groupe d’animaux, mais pour induire une inflammation chronique, l’agent inflammatoire est appliqué sous forme de crème, tous les jours pendant 5 jours (durée du geste inférieur à 30 secondes).

Impact sur les animaux

Pour cette étude, une inflammation sera induite par application d’un agent inflammatoire : - Par dose unique avec différentes posologies : goutte de liquide, goutte de liquide + piqûres superficielles ou injection sous cutanée. - Par plusieurs doses appliquées sous forme de crème. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur. Induire une inflammation artificiellement engendre ces 4 caractéristiques, qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et de faible intensité, comparable à ce qui peut être ressenti après un vaccin, et donc la gêne sera présente mais limitée en temps et intensité. Les animaux seront suivis pendant 4 semaines afin d’étudier également la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets forts pendant plus de 5 jours. Dans certaines procédures, les animaux subiront une injection intraveineuse, sous anesthésie gazeuse, dont les effets indésirables sont limités à l’intensité et la durée d’une piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à morts pour des analyses post-mortem

Remplacement

De nombreuses études in vitro ont pu montrer l’influence du microenvironnement sur la migration des cellules immunitaires. L’ajout de composant bactérien sur certaines cellules immunitaires par exemple les fait migrer plus vite in vitro. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu. Il est donc difficile d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permet d’autre part d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Cela permettra aussi de déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que l’oreille). Une procédure pilote sera réalisée afin de déterminer le meilleur temps expérimental et la dose minimale à utiliser pour observer un remodelage du tissu. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Pour chaque expérience, les ganglions lymphatiques, qui ne sont pas utilisés pour le présent projet, seront prélevés et cryopréservés afin de pouvoir être utilisés dans un potentiel second projet permettant de voir l’effet d’une inflammation locale sur le ganglion drainant. Les échantillons « oreilles inflammées » seront toujours comparés à l’autre oreille n’ayant pas subi de traitement inflammatoire local. Ceci permettra de réaliser des tests statistiques plus puissants et donc permettant de limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront mis à mort. Pour la procédure pilote visant à déterminer les meilleurs temps expérimentaux et la meilleure dose d’agent inflammatoire à utiliser, les animaux seront suivis quotidiennement pendant 5 jours après stimulation, puis tous les 2-3 jours jusqu’à résolution complète de l’inflammation (ou à la mise à mort de l’animal). Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans la procédure pilote. Les souris sont identifiées individuellement par tatouage sur les coussinets et toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart, 180 sur 196, sont soumises à un régime gras induisant une obésité, puis reçoivent des administrations orales quotidiennes pendant vingt-huit à quatre-vingt-dix-huit jours et des prélèvements sanguins, pour tester un composé contre la stéatose hépatique au bénéfice d'un client pharmaceutique. Le porteur euthanasie tous les animaux pour prélever leur foie et affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur les troubles métaboliques. Les retombées annoncées, une première molécule autorisée contre cette maladie, sont renvoyées à l'issue favorable du développement.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a permis d'identifier ces candidats-médicaments. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris atteintes de stéatose hépatique non alcoolique (NASH). Deux modalités seront abordées: - l'effet préventif du traitement sur le développement de la stéatose hépatique - l'effet curatif du traitement sur le développement de la stéatose hépatique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de première étude chez l'humain pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique, une pathologie pour laquelle il n'existe aucun médicament sur le marché à l'heure actuelle. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché de la première molécule autorisée pour le traitement de la stéatose hépatique.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée une à deux fois par semaine. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (

Impact sur les animaux

La majorité des animaux (180 sur 196) seront soumis à un régime stéatogénique pendant l'intégralité de l'étude. Ce régime induit une obésité qui peut être source d'inconfort pour les animaux. Tous les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 28 jours (Groupes de la modalité CURATIF) à 98 jours (Groupes de la modalité PREVENTIF) ce qui est une source de stress. Les animaux seront également manipulés fréquemment pour les mesures de poids corporel et de prise alimentaire e qui pourrait être source de stress. Trois mesures de composition corporelle seront pratiquées, pouvant induire du stress chez les animaux malgré la nature non-invasive et la courte durée (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'étude afin de collecter les foies. Des analyses histologiques et biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques comme la stéatose hépatique non alcoolique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, poids corporel cumulé, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, histologie du foie, dosages sanguins, dosages tissulaires sur le foie (triglycérides, acides gras libres, cholestérol total).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Afin de respecter le caractère social de l'espèce, les animaux seront hébergés par 2 ou 3 en cage individuellement ventilée. Les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique et des canules souples à usage unique et pourvues d'embout de silicone seront employés afin de s'affranchir de toute lésion du carrefour aéro-digestif. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs (100μL de sang par prélèvement). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine).

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Il est très classiquement employés dans le cadre des études précliniques dans le domaine de la stéatose. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 19 semaines au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et par le fait qu'un pré-conditionnement de 13 semaines avec une nourriture stéatogénique est nécessaire pour induire la stéatose (8 semaines de pré-conditionnement à la nourriture stéatogénique chez notre fournisseur chez des souris âgées de 6 semaines + 5 semaines de conditionnement dans notre animalerie après réception).

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras fournissant 60 % de l'énergie sous forme de graisses, elles reçoivent des administrations orales quotidiennes pendant huit à vingt-neuf jours et des prélèvements sanguins répétés, pour tester un composé anti-obésité destiné à un client pharmaceutique. Le porteur reconnaît que le régime gras "constitue une nuisance" et euthanasie tous les animaux pour prélever tissu adipeux, foie et muscle. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids corporel et que l'étude pharmacocinétique exige un "organisme entier".

Objectifs

Le présent projet vise au développement d'un composé d'intérêt thérapeutique en développement dans le domaine de l'obésité. Ce composé a fait l'objet d'études in vitro préalables ayant donné des résultats prometteurs. Ces données semblent indiquer que le composé serait capable de réduire le poids corporel chez le sujet obèse par une action augmentation des dépenses énergétiques. Le présent projet vise à vérifier cette hypothèse dans un contexte in vivo. Le projet est scindé en trois étapes indépendantes qui seront menées successivement, le succès de chacune de ces étapes conditionnant la réalisation de la suivante : - Etape 1 : étude des propriétés pharmacocinétiques du composé en conditions de traitement aigu ou chronique (7 jours) chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie fournie par les graisses). - Etape 2 : étude court terme de l'effet du composé sur les dépenses énergétiques en condition de thermoneutralité chez la souris obèse rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie fournie par les graisses). - Etape 3 : étude long terme de l'effet du composé sur le poids corporel chez la souris obèse rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie fournie par les graisses). L'objectif final est ainsi de vérifier l'efficacité du composé testé sur l'obésité avant de pousser son développement sur les étapes préclinique et clinique règlementaires nécessaires à sa mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composés anti-obésité visant l'humain. Alors que de nombreuses molécules anti-obésité ont été commercialisées puis retirées du marché en raison d’effets secondaires graves, seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l’obésité. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Procédure 1 : Les souris recevront des traitements quotidiens par voie orale pendant 8 jours. Les souris seront soumises à deux séries de 5 prélèvements sanguins. Procédure 2 : Les souris recevront des traitements quotidiens par voie orale pendant 3 jours. Les souris seront soumises à trois jours de mesures des échanges respiratoires. Procédure 3 : Les souris recevront des traitements quotidiens par voie orale pendant 29 jours.

Impact sur les animaux

Procédure 1 : Les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 8 jours. Par ailleurs des prélèvements sanguins réalisés à la pointe de la queue seront pratiqués. Les animaux seront également manipulés quotidiennement pour les mesures de poids corporel. Procédure 2 : Les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 2 jours. Par ailleurs, les animaux seront placés dans des cages couplées à de la calorimétrie indirecte. Les animaux seront également manipulés quotidiennement pour les mesures de poids corporel. Procédure 3 : Les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 29 jours. Les animaux seront également manipulés quotidiennement pour les mesures de poids corporel. Il est à noté que, pour les trois procédures, les animaux seront hébergés en conditionde thermoneutralité. Enfin, les animaux seront rendus obèse par une alimentation enrichi en graisse ce qui constitue une nuisance aux animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tissu adipeux, foie, muscle gastrocnémien) sont prévus après euthanasie pour mesures biochimiques ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques. Par ailleurs, dans le cadre de l'étude des paramètres pharmacocinétiques du composé développé, ce type de protocole ne peut être réalisés que sur organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. L'animal obèse est également employé dans la procédure 1 (étude pharmacocinétique) car il est déjà connu que le composé test est capable de se complexer avec les lipides circulants; les dyslipidémie observées chez la souris obèse seraient ainsi fortement susceptible d'induire une modification des paramètres pharmacocinétique comparatvement à l'animal sain. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique et des canules souples à usage unique et pourvues d'embout de silicone seront employés. Les animaux seront hébergés en cages collectives pour la procédure 1 (éude pharmacocinétique) mais en cages individuelles pour les procédure 2 et 3 du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus dans la procédure 1 seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultèrieurs (30µL de sang par prélèvement) et seront réalisés en bout de queue pour minimiser l'inconfort des animaux. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6 nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet.

160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié transférée vivante vers un autre établissement pour la suite du projet. Les animaux subissent des séances de course ou de marche imposées, des pesées répétées, une injection intraveineuse sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle du lactate musculaire dans le vieillissement du cerveau. Le porteur affirme que seul un protocole in vivo reproduit la complexité des interactions muscle-cerveau et juge le modèle animal "nécessaire". Il annonce des tests comportementaux d'apprentissage et de mémoire sans en préciser le détail.

Objectifs

La population mondiale vieillit de plus en plus, et a tendance à avoir un mode de vie de plus en plus sédentaire. Ces deux facteurs constituent ensemble la recette parfaite pour l'une des plus grandes menaces pour la santé dans un avenir proche : les troubles cognitifs liés à l'âge. Nos fonctions cognitives se détériorent avec l'âge. L'exercice physique pourrait ralentir l'altération métabolique du cerveau au cours du vieillissement. En effet, différents métabolites sont sécrétés par les muscles squelettiques pendant l'exercice, dont le lactate. Il a été suggéré que le lactate a un effet protecteur qui retarde le vieillissement du cerveau. Des études suggèrent que le lactate pourrait être nécessaire pour l’apprentissage et le maintien de la mémoire à plus ou moins long terme. De plus l'exercice physique pourrait avoir des effets protecteurs sur le cerveau en raison de sa capacité à générer du lactate dans les muscles et le cerveau. L'objectif est donc d’évaluer le rôle du lactate et de son transporteur musculaire durant un exercice physique d’abord sur la performance musculaire elle-même, puis sur le comportement des animaux (capacité d'apprentissage et mémoire). Des tests de comportement permettront d'examiner les fonctions cognitives et la mémoire de l'animal. L'hypothèse est que l’inhibition du transport de lactate provenant des muscles réduirait l’apport du lactate vers le cerveau, induisant des différences de comportement mesurables en raison d'une moindre disponibilité d'énergie pour les neurones du cerveau, sans réduction significative des performances à l’exercice.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus vont nous permettre de mieux comprendre la communication biologique de l’axe muscle-cerveau, dans le but d’établir des stratégies neuroprotectrices afin de limiter les troubles de la mémoire liés à l'âge. À plus long terme, cela nous permettra de mieux prévenir ou guérir les troubles cérébraux causés par différentes pathologies chez l’homme.

Procédures

Sur animaux vigiles : 14 à 16 pesées par animal, acte d’une durée de 1 minute. 4 à 7 séances d’activités physiques (course ou marche) par animal, séance d’une durée de 5 à 30 minutes. Sur les animaux sous anesthésié générale + anesthésie locale : 1 injection intraveineuse par animal, acte d’une durée de 1 minute. 0 à 2 prélèvements sanguins par animal, acte d’une durée de 1 minute.

Impact sur les animaux

L’acte de pesée sur animal vigile peut induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale et l’injection intraveineuse, l’effet indésirable attendu est un inconfort très transitoire au réveil. Suite à l’inhibition partielle du transport du lactate provenant des muscles, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une difficulté à apprendre une tâche cognitive complexe et à se remémorer cette tâche, ainsi qu’une fatigue musculaire plus précoce suite à un exercice physique prolongé et imposé. Les exercices physiques imposés aux animaux vigiles peuvent induire un léger stress ou une fatigue musculaire de l’animal lorsque soumis à un exercice physique prolongé, ces effets seront transitoires et « corrigés » par une période de repos prévue après l’exercice physique.

Devenir

La moitié des animaux seront mis à mort. Des prélèvements de tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses métaboliques, biochimiques, moléculaires et histologiques. Et la moitié des animaux seront gardés en vie pour poursuite du projet dans un autre établissement utilisateur.

Remplacement

Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des interactions entre le muscle et le cerveau et permettre l'étude du comportement. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer les interactions entre des cellules musculaires et les neurones, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire parfaitement les interactions entre le muscle et le cerveau, en effet les muscles et le cerveau ne se limitent pas simplement à des cellules musculaires et à des neurones, chacun de ces tissus est constitué de différents types cellulaires. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les tissus prélevés sur les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement). et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Les injections intraveineuses seront réalisées en asepsie stricte sous anesthésie générale et locale. Les prélèvements sanguins seront réalisés en asepsie stricte sous anesthésie locale. Durant toute la procédure, les animaux seront manipulés par la même personne afin de diminuer leur stress (personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale).

Choix des espèces

Le choix du modèle de souris est basé sur les critères suivants : 1. Les tests physiologiques musculaires et les évaluations des tests comportementaux dans cette espèce sont des procédures validées et adaptées pour répondre aux objectifs. 2. La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. La procédure débutera chez des souris mâles et femelles âgées de 2 mois minimum. Puis 4 semaines après, des tests d’activité physique/musculaire et de comportement seront réalisés chez ces mêmes animaux. Ces tests d’activité physiques et ces tests de comportement se dérouleront pendant 2 à 15 semaines. Cela correspond à un âge et un poids adulte, qui sont appropriés pour les expériences.

192 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'environ vingt minutes pour greffer des cellules tumorales sous la capsule du rein, puis des anesthésies répétées tous les deux jours pour suivre la tumeur par imagerie, la moitié recevant en plus des injections hebdomadaires d'anticorps. Le porteur décrit une chirurgie "invasive" entraînant douleur et stress, un risque de décès au réveil et des douleurs liées à la croissance tumorale et aux métastases. Il affirme que la souris humanisée est le "seul modèle pertinent" et que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer chez la souris humanisée, nous prévoyons d'implanter des lignées tumorales génétiquement modifiées dans le site primaire d'origine de la tumeur étudiée, à savoir le rein. Après greffe sous la capsule rénale, la croissance de la tumeur ainsi que son éventuelle dissémination metastatique sera mesurée par bioluminescence sur animaux anesthésiés. Ces expériences seront réalisées dans des lignées de souris immunodéficientes ou dans cette même souche de souris préalablement humanisées par transfert de cellules progénitrices humaines. Ces souris dites humanisées régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel après quelques semaines. L'objectif du projet est donc d'évaluer la croissance sous la capsule rénale de lignées tumorales génétiquement modifiées en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. La comparaison de la croissance des tumeurs exprimant ou non les molécules d'intérêt dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur le rôle intrinsèque de la molécule étudiée sur la qualité de la réponse immunitaire associée et sur l'impact de celle ci sur le contrôle de la croissance de la tumeur.

Bénéfices attendus

La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes nous renseignera sur le rôle biologique d'une molécule exprimée par la tumeur sur la qualité de la réponse immunitaire contre la tumeur dans un modèle de souris humanisées. Un anticorps monoclonal est développé pour bloquer l'interaction entre cette molécule et son récepteur pour des applications thérapeutiques chez l'homme, après la validation de son efficacité dans des souris humanisées. En cas de résultats favorables, le bénéfice attendu du projet est donc de proposer un nouveau traitement pour le cancer du rein.

Procédures

La procédure implique une chirurgie sous anesthésie générale pour implanter les tumeurs sous la capsule rénale dans 192 animaux. La durée de l'acte est de 20 minutes par souris environ. Les souris sont traitées avec un analgésique 2h avant et deux fois après la chirurgie (24 et 48h). La procédure implique aussi que les souris greffées soient anesthésiées par voie gazeuse pour mesurer la croissance de la tumeur grâce à une injection dans le péritoine d'une molécule pour visualiser les tumeurs greffées et mesurer leur volume. Cet acte est de 10 minutes par souris. Il sera répété tous les 2 jours pendant un maximum de 45 jours. Tous les animaux de la procédure seront greffés et injectés avec la molécule permettant de visualiser les tumeurs. Dans la moitié des souris, soit 96 souris, une immunothérapie sera évaluée. Pour cela, les anticorps seront injectés une fois par semaine pendant 3 semaines en commencant 7 à 10 jours après la chirurgie pour une durée maximum de 45 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant douleur et stress. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. L'anesthésie présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu'à l'arrêt cardiaque. Le réveil de l'anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs sous la capsule rénale pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien ou avant si un point limite est atteint afin de réaliser les prélèvements et analyses nécessaires dans le cadre de ce projet.

Remplacement

Ce projet étant basé sur l'observation in vivo des croissances tumorales, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par d'autres types d'expériences. Seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet sur la fonction de molécules ciblées sur la réponse immunitaire contre la tumeur et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (n=192) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous utiliserons six animaux par groupe pour toutes les procédures et on répétera l’expérience 2 fois. Les différents groupes expérimentaux seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux contrôles nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs habilités de l'équipe de recherche. Une grille de score sera remplie à chaque visite pour évaluer l'état général des souris tout au long du maintien. Tout animal atteignant un point limite défini dans la procédure sera immédiatement euthanasié. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (administration d'analgésiques, euthanasie ou arrêt du protocole). Les animaux sont anesthésiés avec des anesthésique injectables ou gazeux dans les différents actes de la procédure. Les souris sont traitées avec un analgésique vétérinaire en pré et post opératoire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales chez l'animal décrites dans le projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. La souris humanisée est le seul modèle pertinent in vivo d'une réponse immunitaire de cellules humaines contre des tumeurs humaines in vivo. A ce titre, il permet la transposition des résultats à la situation physiologique chez l'homme mais aussi d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques destinées à la clinique, ce que ne permettent pas les modèles habituels. Nous travaillons depuis de nombreuses années avec les souris humanisées, ce qui nous a permis de proposer et de valider une nouvelle combinaison d'immunothérapie et de chimiothérapie dans le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 20 et 25 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des cellules immunitaires chez la souris. Pour les animaux non humanisés, nous utiliserons des souris de 8-10 semaines.