Souris

295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation nasale d'adénovirus qui déclenche des tumeurs pulmonaires, puis des injections intrapéritonéales répétées de thérapie ciblée, de chimiothérapie et d'immunothérapie pendant vingt semaines, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs, invisibles de l'extérieur, peuvent provoquer une insuffisance respiratoire et une cachexie, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients atteints de ce cancer du poumon restent au conditionnel, et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'anticorps.

Objectifs

Le carcinome squameux du poumon (LUSC) est un sous-type courant de cancer du poumon. Il est la deuxième cause de décès liée au cancer du poumon, causant environ 400 000 décès par an dans le monde. La grande majorité des patients atteints de LUSC sont de gros fumeurs actuels ou anciens indiquant une forte association de la pathologie au tabagisme. Contrairement à d'autres sous-types de tumeurs du poumon, il n'existe pas encore de thérapies ciblées approuvées pour le LUSC, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise en prérequis à étudier le développement tumoral dans un modèle murin de LUSC. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie ou une immunothérapie sur le développement des tumeurs dans ce modèle murin. Nous analyserons pour cela l’incidence et la progression tumorale. La pertinence de notre thérapie ciblée sera également évaluée par ablation génétique de son gène. De manière secondaire, nous étudierons la biologie de notre cible thérapeutique dans ce même modèle à l’aide de systèmes rapporteurs d’expression.

Bénéfices attendus

Des options thérapeutiques limitées sont disponibles pour le LUSC à un stade avancé. Malgré une compréhension plus approfondie des altérations génétiques qui caractérisent les LUSC et des années de travaux d'essai ciblant ces altérations, les thérapies personnalisées restent peu satisfaisantes. Seule l'immunothérapie a marqué la première amélioration substantielle de la survie globale des patients atteints de LUSC depuis plus d'une décennie, mais moins d’un tiers des patients montrent un bénéfice au traitement. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de notre cible thérapeutique (et de son activité en association avec des chimiothérapie et des immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Prélèvement tissulaire sur animaux vigiles, de 2 mm au niveau de la queue pour génotypage à 4 semaines postpartum. 1X 5 sec. Marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. 1x 5 sec. Pour l'injection de virus: Anesthésie par injection. 1X 20 sec. Durée de l'anesthésie 5 min. Pour l'imagerie intra-vitale: Anesthésie gazeuze. 1X20 sec toutes les 4 sem de 4 à 40 sem post-infection. Durée de l'anesthésie 10 min. Instillation nasale de virus 1X 5 min. Injections intraperitonéales sur animaux vigiles : Thérapie ciblée injections 2X/sem pendant 20 sem, 20 sec. Immunothérapie 2X/sem pendant 5 sem, 20 sec. Chimiothérapie 1x/sem pendant 20 sem, 20 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux sont anesthésiés pour procéder à l’instillation nasale des adenovirus. La manipulation des souris et les diverses injections intrapéritonéales peuvent générer du stress à l’animal. L’instillation nasale des virus peut provoquer de légères lésions au niveau des narines ainsi qu’induire de la toux. Les tumeurs induites par l'adénovirus se développent au niveau pulmonaire. Elles ne sont par conséquent pas visibles de l’extérieur et peuvent occasionner une insuffisance respiratoire. Les contentions lors des pesées et des traitements peuvent générer du stress. Les méthodes d’imagerie imposent des manipulations, du transport et de l’anesthésie par inhalation qui sont autant de stress pour l’animal. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les animaux peuvent présenter des blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ce modèle de souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés pour analyse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’étude de la biologie de notre cible thérapeutique a été réalisée sur des lignées cellulaires au préalable. Des analyses d’expression ont été effectuées sur les données publiques. L’ensemble des résultats obtenus nous a conduit à la nécessité de recontextualiser les cellules tumorales dans leur environnement. La complexité des réponses thérapeutiques de certains traitements anticancéreux rend difficile leur étude sur des lignées cellulaires. Les modèles murins représentent en ce sens un modèle adapté qui intègre la dynamique des nombreux type cellulaires impliqués dans la mise en place de ces réponses. De plus, le modèle génétique utilisé récapitule parfaitement toutes les étapes de développement de ce type de cancer pulmonaire. Son utilisation est donc nécessaire pour évaluer l’effet d’une thérapie sur l’incidence et la progression de la maladie. La présence de tous les différents types cellulaires est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité dde notre traitement. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité de notre anticorps dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Les travaux actuellement publiés sur ce modèle de tumorigénèse n’indiquent pas la variabilité d’apparition des tumeurs chez les individus et ne permet donc pas une évaluation du nombre d’individus par une approche de calcul statistique. Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience sur la réponse aux traitements utilisés dans d’autres modèles et pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Les effectifs seront évalués au regard de la variabilité observée dans les premières expériences de mise en place du modèle. La stratégie de production des animaux et d’entretien la lignée génétiquement modifiée permet de réduire le nombre d’individus avec un génotype non désiré. 40 souriss seront utilisées pour réaliser un suivi longitudinal afin d’identifier l’hétérogénéité et la rapidité du développement tumoral de ce modèle de 20 à 40 semaines. Les temps de mise à mort pour le reste des proédures pourront être redéfinis au regard de ces résultats. L’autopsie des animaux sera réalisée afin de quantifier les lésions pulmonaires et détecter d’éventuelles invasions métastatiques (celles-ci n’ayant pas été décrites aux temps réalisés dans ce modèle). Certaines expérimentations seront faites 2 fois pour permettre différents types de prélèvements tissulaires. Les effectifs tiennent compte de la variabilité des effets de l’immunothérapie et de la chimiothérapie observée dans d’autres protocoles identiques. Dans un but de réduction, la répétition de ces expériences ne sera pas réalisée en cas d’absence d’effet mesuré. Les effectifs évalués prennent en compte la mise au point des protocoles de traitement des échantillons biologiques récupérés.

Raffinement

Dans ce modèle de souris, des petites lésions pulmonaires apparaissent à partir de la semaine 30 post induction avec le virus. 100% des animaux présentent des lésions entre 40 et 50 semaines. Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des expériences, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 30 semaines. Des signes d’insuffisance respiratoire, d'amaigrissement et de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu à partir de 20 semaines permettant un réchauffement des individus seront mis en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifiées utilisé est capable de générer des tumeurs pulmonaires représentatives uniquement du sous-type désiré, dans 100 % des souris et qui récapitulent les aspects génétiques, moléculaires et microenvironnementaux de la maladie humaine. L'administration nasale de virus permet la spécificité d’organe. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis pharmacologique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux, de la chimiothérapie ou de l'immunothérapie. Par ailleurs la posologie des drogues utilisées est bien standardisée (voie, doses, volumes, etc...) contrairement à d'autres modèles tels que le poisson zèbre. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris jeunes adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi. Le développement tumoral pulmonaire commence à partir de 20 semaines suivant l'administration nasale de virus.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est induite par la cuprizone, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant six semaines, des séances d'IRM sous anesthésie et, pour la mise à mort, une perfusion ou une ponction intracardiaque, afin de tester une molécule ciblant le récepteur 5-HT7 dans la sclérose en plaques. Le porteur indique n'attendre pas de douleur liée à la cuprizone mais reconnaît que les injections quotidiennes peuvent stresser les animaux. Il affirme que l'évaluation de ces ligands "nécessite l'utilisation de l'animal" pour considérer un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser le rôle du récepteur 5HT7 dans les processus de démyélinisation/remyélinisation, la réponse inflammatoire en particulier son rôle sur la microglie, macrophages résidents du système nerveux central. Nous déterminerons si l’activation de ce récepteur avec une molécule que nous venons de caractériser et qui cible ce récepteur permettra de ralentir les signes pathologiques dans la sclérose en plaques. Nous comparerons son efficacité par rapport à une molécule de référence ciblant également le récepteur 5-HT7 mais qui possède des propriétés pharmacologiques différentes comparées à la molécule à tester. Nous utiliserons un modèle animal de la maladie après traitement cuprizone chez des animaux sauvages et des animaux dont le gène codant pour le récepteur 5-HT7 est non fonctionnel, ceci afin d'explorer le rôle du récepteur dans le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable d'induire la remyélinisation. L'efficacité du traitement sera évaluée après analyse des images IRM obtenues et la quantification des immunomarquages qui seront réalisés après mise à mort à 6 semaines et 12 semaines pour suivre les paramètres inflammatoires et le niveau de myélinisation.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention impliquant des procédures chirurgicales. Des injections par voie orale (15sec/gavage/jour) seront réalisées tous les jours pendant 6 semaines sur 220 animaux vigiles. Une partie des animaux (160 animaux) sera utilisée pour l'imagerie IRM (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). Pour se faire les animaux seront anesthésiés et placés dans l'imageur IRM pendant maximum 45 minutes pour l'acquisition des images. 80 animaux recevront un agent de contraste par voie intraveineuse sous anesthésie générale (5min/injection/animal) avant de réaliser les acquisitions IRM sous anesthésie (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). La moitié des animaux (360 animaux) recevront une dose sublétale d'anesthésique (15 sec/injection intrapéritonéale) avant perfusion intracardiaque. L'autre motié des animaux (360 animaux) sera anesthésiée sous isoflurane avant prélèvement sanguin intracardiaque (5 min/souris) et récupération des tissus.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajoutée dans la nourriture. De même, le suivi par IRM n'est pas connu pour induire de la souffarnce. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après adminisstration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des mesures biochimiques et histologiques (prélèvement sanguin et cerveau).

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’actions et les voies de signalisation impliquées. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation /remyélinisation induite par la cuprizone.

Réduction

Les approches décrites nécessitent des cohortes de 10 animaux minimum par groupe. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats

Raffinement

Les souris seront hébergées en portoirs ventilés dans des cages disposant d'un environnement enrichi dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture. Les animaux seront observés tous les jours durant la durée de chaque procédure pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter d'éventuels signes de souffrance, en plus des pesées (2 fois/semaine). La cuprizone, contrairement aux modèles animaux d’Encephalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), mimant la sclérose en plaques chez la souris, n’induit pas de paralysie de l’animal. Le suivi IRM sera effectué sous anesthésie gazeuse et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant à 37°C. Une grille de score, l'utilisation de points limites, d'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance seont utilisés. Ainsi, si un animal présente un signe de souffrance lors des observations quotidiennes, l'utilisation d'analgésique ou la décision de mise à mort sera prise en concertation avec le responsable du bien- être des animaux du projet.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons également des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO), afin de discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne avec fixation d'une pièce sur la tête, puis une dizaine de séances d'enregistrement du mouvement, d'imagerie calcique et d'électrophysiologie, pour étudier l'adaptation motrice. Le porteur reconnaît des dommages osseux et tissulaires liés à la chirurgie et une restriction en eau imposée aux souris pour les motiver pendant les tests. Il affirme que ce projet de neurophysiologie "ne peut être conduit que sur animal vivant" et libre de ses mouvements.

Objectifs

La capacité d'apprendre des programmes moteurs précis et coordonnés et de les adapter à un environnement changeant est essentielle à la survie de tous les animaux. Élucider les interactions cellulaires et réseau au cours de l'adaptation motrice nécessite un paradigme comportemental qui permet l'observation simultanée de l'adaptation neuronale et comportementale aux changements entre la réafférence perçue et attendue. Dans une expérience classique chez l'homme, la réafférence perçue est découplée de la réafférence attendue à l'aide de lunettes à prisme qui déplacent le champ visuel de plusieurs degrés tandis que les gens utilisent des mouvements balistiques pour localiser une cible dans l'espace. Chez les sujets en bonne santé, l'échec initial à localiser une cible informe les tentatives futures, et les sujets adaptent les programmes moteurs pour localiser de manière fiable les cibles extrêmement rapidement. Cependant, les patients présentant des déficits cérébelleux ne parviennent pas à adapter les programmes moteurs à la nouvelle réafférence sensorielle produite par les lunettes, vraisemblablement parce que la comparaison entre la réafférence perçue et attendue ne peut être réalisée sans le cervelet. Nous avons récemment développé une nouvelle tâche comportementale chez des souris à tête fixe qui nous permet d'utiliser l'électrophysiologie et l'imagerie pour observer l'activité de cellules individuelles dans le cerveau, et récapitule les composants essentiels de l'expérience des lunettes à prisme chez l'homme : les souris à tête fixe utilisent un membre antérieur pour contrôler un joystick qui déplace un distributeur d'eau. Nous utiliserons des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie pour observer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent la réafférence attendue générée par des perturbations de la réafférence attendue.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau d'effectuer des tâches motrices. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent des mémoires nécessaires pour adapter nos mouvements dans un environnement qui change. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre de diagnostiquer et traiter des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs.

Procédures

Les souris de cette étude subiront 4 procédures. Les animaux subiront 1 chirurgie de < 1 heure et environ 10 séances (< 2 heures chacune) de comportement couplé à des enregistrements de mouvement d'un membre anterieur, d'imagerie calcique, et d'electrophysiologie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation crânienne sur la tête va initialement induire un stress chez l'animal et réduire très légèrement sa mobilité. Après que l'animal se soit habitué et afin de s’assurer que les souris boivent au cours des expériences de comportement, les souris seront restreintes en eau. Si il y a une réduction du poids corporel qui dépasse 15 % par rapport au poids initial, le souris est donné de l’eau tout de suite.

Devenir

Tous les animaux sont mises à mort après anaesthésie pour prélèvement d'organes et analyses microscopique des cerveaux. L'étude des cellules post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones qui ont été enregistrés pendant les expériences.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant les perturbations sensorielles implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

A fin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible.

Raffinement

Les animaux sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.

Choix des espèces

La souris a été choisie car nous pouvons utiliser des techniques génétiques qui ne sont pas possible avec d'autres espèces. Nous serons en mésure de mésurer et perturber l’activité dans le cerveau pendant une tâche motrice. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où structures cérébrales impliquées dans le mouvement sont maturées, au-déla de 30 jours après la naissance.

320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.

Bénéfices attendus

L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.

Devenir

Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.

Raffinement

La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.

Choix des espèces

Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée Harlequin utilisée présente d'elle-même un retard de croissance, une ataxie, une perte de vision et, pour une partie des animaux, hydrocéphalie, prolapsus pénien ou dermatite ulcéreuse, avant même le protocole d'injection intraveineuse d'un gène-médicament et les neuf tests comportementaux. Le porteur indique que 20 souris seront écartées pour anomalies et que la mise à mort sert à prélever cervelet et cerveau. Il affirme que la preuve d'efficacité "ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l'animal", les approches in vitro restant selon lui insuffisantes.

Objectifs

Les maladies neurologiques liés à un gène défectueux sont incurables malgré les progrès de la génétique de ces 35 dernières années. Il a été démontré que des anomalies mitochondriales sont très souvent impliquées dans ces maladies. Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Les pathologies mitochondriales affectent un adulte sur 5000 ; le système nerveux central est atteint dans la grande majorité des patients et à ce jour aucune thérapie efficace n’existe pour améliorer leur qualité de vie. Nous avons pour objectif de développer un traitement conduisant à la surexpression du gène qui code une protéine mitochondriale sur laquelle nous travaillons depuis 12 ans et qui possède des propriétés protectrices de la fonction des neurones. Ce traitement va consister à injecter, grâce à un vecteur approprié, le gène dont nous comptons augmenter l’abondance de notre protéine d’intérêt par voie intraveineuse chez un modèle de souris souffrant d’une maladie mitochondriale qui entraine, entre autres, une ataxie cérébelleuse (trouble de l'équilibre et de la coordination). Le but de notre projet de recherche est donc de démontrer qu’en augmentant la quantité de notre protéine d’intérêt dans le cerveau et cervelet, nous pourrions améliorer l’état de santé générale de nos animaux grâce à la diminution de leurs troubles moteurs. Ainsi, une étude clinique pourrait être développée pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant d'un éventail de maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Toute anomalie des mitochondries est responsable des pathologies graves qui affectent des tissus à forte demande énergétique (cerveau, cœur, muscle, foie) nommées « maladies mitochondriales ». Ces maladies sont très fréquentes (1 adulte sur 5000) et aucun traitement n’existe permettant de les soigner efficacement et de façon pérenne les patients. L'objectif de notre projet de recherche est de développer un traitement conduisant à une expression élevée du gène de notre protéine d’intérêt. Cette protéine se localise dans les mitochondries et possède des propriétés neuroprotectrices ; le traitement vise à augmenter son abondance dans les neurones. Si nous parvenons à montrer le rôle bénéfique de cette protéine pour la survie des neurones chez les souris Harlequin, nous pourrons ensuite montrer son efficacité dans d’autre modèle de maladies mitochondriales et ainsi une étude clinique chez l’Homme pourrait être initiée dans le cadre d’une grande variété de maladies neurologiques. Elle visera à améliorer les conditions de vie de patients pour lesquelles aucune thérapie n’a démontré son efficacité à ce jour.

Procédures

Le modèle expérimental utilisé présente des signes cliniques dommageables de par sa modification génétique : retard de croissance, perte de poids, atrophie musculaire, déficits moteurs, perte de la vision, troubles de l’équilibre et de la coordination. Ils sont dus à la perte des neurones dans le cerveau et le cervelet car ils ne produisent pas l’énergie requise pour assurer leur bon fonctionnement. Le gène médicament que nous testerons sera administré aux souris par voie intraveineuse. Cette injection se fera sous anesthésie générale et ne durera au maximum que 4-5 minutes. Chez certains animaux, un prélèvement de sang, sur l’œil non injecté, sera réalisé deux mois après le traitement pour vérifier l’absence du médicament dans le sang périphérique et permettre la sortie des souris traitées de la zone de confinement. Ce prélèvement se fera sous anesthésie gazeuse et durera 2 à 3 minutes. Des tests comportementaux seront réalisés 2 et 5 mois après la thérapie génique ainsi que sur un groupe d’animaux non traités. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et seront répartis sur 10 jours à raison de 1 ou au maximum 2 tests par jour. Un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test.

Impact sur les animaux

Effets indésirable liés au modèle animal : Dès leur plus jeune âge, les souris étudiées présentent un retard de croissance avec un poids corporel plus faible que la normal et une alopécie importante avec des zones des poils irrégulièrement reparties dans le corps. À partir de 4 mois d’âge, ces souris développent une ataxie qui se caractérise par des troubles de locomotion, des pertes d’équilibre, de l’incoordination des mouvements et la réduction de la force musculaire. En géneral, une perte de la vision survient chez les souris entre 6 à 8 mois d’âge. Un petit pourcentage de ces souris souffre également de : - Hydrocéphalie, excès de liquide céphalo-rachidien dans le cerveau pouvant entraîner des troubles neurologiques (2 souris /100). - Microphtalmie, réduction de la taille du globe oculaire pouvant compromettre la fonction visuelle (2 souris/100). - Prolapsus pénien, gonflement des organes génitaux qui pourrait être douloureux et empêcher l’animal d’uriner normalement (4 souris/100). - Dermatite ulcéreuse, inflammation cutanée avec démangeaison ; elle est fréquente chez la souris Harlequin à cause de leur alopécie. Effets indésirables liés au projet : Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse ; cette dernière pourrait produire de l’hypothermie ou un arrêt respiratoire. Malgré sa rapidité, l’intervention pourrait entraîner du stress chez l’animal enfin dans de rares cas un petit saignement à l’œil pourrait se produire. Huit tests comportementaux seront réalisés, pendant 10 jours puis un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test. Cette série de tests sera effectuée 2 mois après l’injection et avant l’euthanasie, 3 mois plus tard. La réalisation de ces tests pourrait augmenter le stress chez l’animal de par leur fréquente manipulation mais aussi de la fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés lorsque le projet sera terminé pour pouvoir utiliser les cervelets / cerveaux pour les études histologiques, biochimiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

La démonstration de l’efficacité biologique de la thérapie génique avec notre protéine d’intérêt dans le modèle expérimental d’ataxie cérébelleuse ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l’animal. Elle combinera des évaluations morphologiques et fonctionnelles du cervelet mais aussi l’étude des capacités motrices et cognitives des souris traitées pour établir une amélioration de celles-ci suite à la thérapie, amélioration qui indiquera que leur cervelet fonctionne mieux. Les études in vitro ou ex vivo (cultures de neurones cérébelleux ou tranches de cervelet) pourraient être effectuées pour compléter les études histologiques. Cependant, les données récoltées in vitro resteront insuffisantes et ne permettront pas d’aboutir à une preuve de concept robuste dans le cadre de cette étude préclinique pour rédiger une demande d’autorisation d’un essai clinique chez l’homme.

Réduction

Pour ce projet nous allons utiliser au total 560 souris dont 310 souris souffrant de la pathologie : 250 entre elles recevront les différents traitements, 40 ne seront pas traitées pour nous servir de référence et 20 seront exclues car présentant des anomalies. Pour comparer les effets de nos traitements, 250 souris en bonne santé seront également utilisées : 220 recevront les différents traitements et 40 autres ne seront pas traitées. Ces nombres ont été rigoureusement définis en fonction de notre expérience sur le modèle des souris utilisées et grâce à un calcul de puissance et du nombre des souris nécessaires. Ainsi, la taille de chaque groupe de souris incluses dans les procédures a été définie afin de récolter suffisamment de données expérimentales pour appliquer des tests statistiquement robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées entre 2 et 4 par cage dans des portoirs ventilés, nourries et abreuvées ad libitum. Chaque cage comportera un environnement enrichi (maisonnette en plastique ou cellulose et coton). Les pièces de l’animalerie sont maintenues à 20-22 °C avec contrôle d’humidité et un cycle jour/nuit de 12 heures. Les injections intraveineuses de chacun des vecteurs chez les souris seront réalisées sous anesthésie volatile. Si une détresse respiratoire est observée pendant l’anesthésie, la quantité d’anesthésiant sera diminuée pour entraîner ainsi une meilleure oxygénation des souris. Le site d'injection sera examiné pour rechercher un saignement ou autre traumatisme. Chaque animal sera évalué les 2 jours qui suivent l’injection pour confirmer l’absence de blessure / inflammation ou signe de souffrance dans l’œil injecté et la grille d’évaluation sera renseignée. Les souris traitées seront évaluées à deux reprises (2 et 5 mois après la thérapie génique) pour établir leurs capacités motrices et cognitives en les faisant réaliser 9 tests comportementaux. Avant ces séances, les souris auront une semaine pour s’habituer à l’expérimentateur. Le jour du test, les souris seront installées dans la pièce 30 minutes avant celui-ci pour minimiser leur stress et assurer la fiabilité des données obtenues. Huit de ces tests seront répartis sur 10 jours, puis la semaine suivante le dernier test sera réalisé afin d’éviter l’angoisse, la fatigue ou le stress des animaux ; l’ordre de réalisation de tests sera également choisi pour réduire au minimum les nuisances chez les souris testées. Par ailleurs, tous les 2 jours pendant ces séances la grille d’évaluation sera remplie de manière détaillée et avec soin pour chaque souris ; des mesures adaptées seront prises si le bien-être des souris venait à être compromis suite à ces tests.

Choix des espèces

Le modèle de souris sur lequel nous travaillons est particulièrement adapté à notre projet de recherche puisqu’il reproduit fidèlement une maladie neurologique chez l’Homme dont la cause génétique est le dysfonctionnement des structures cellulaires responsables de la production d’énergie, les mitochondries. Comme l’anomalie génétique responsable de la pathologice chez ces souris se localise dans le chromosome X, les souris mâles présentent des symptômes plus graves que les souris femelles. En effet, ces dernières accumulent deux fois plus de la protéine déficitaire chez les mâles ; ceci réduit significativement la gravité de leurs symptômes. Ainsi, des souris mâles âgées de 26-28 jours recevront le traitement par voie intraveineuse. Les souris seront soumises à un ensemble de tests comportementaux et seront euthanasiées cinq mois après le traitement ; les cervelets seront récoltés pour des évaluations morphologiques et fonctionnelles.

232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras de douze semaines, elles subissent une constriction chirurgicale de l'aorte pour provoquer un stress cardiaque, puis des échocardiographies et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, afin d'étudier le rôle de l'enzyme PIKfyve. Le porteur indique que cette chirurgie a déjà entraîné 10 % de mortalité post-opératoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de se passer du modèle animal en physiopathologie cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est un problème majeur de santé publique, dont la prévalence augmente fortement, principalement à cause de l’obésité et du diabète de type 2. Nos études précédentes ont montré que l’enzyme PIKfyve est un acteur majeur dans la progression de l’insuffisance cardiaque chronique. Cependant, son rôle exact reste à élucider, notamment dans le contexte de l’insuffisance cardiaque liée à l’obésité. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque liée au diabète en utilisant un modèle de souris dont le gène PIKfyve est non-fonctionnel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque en lien avec l'obésité et le diabète de type 2, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2 (n=96, pendant 12 semaines); 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque (n=96, durée de l’intervention : 1h); 3/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux (n=192, durée de l’intervention 15min); 4/ une mesure de la composition corporelle (n=192, durée de la procédure : 2min); 5/ un test de tolérance au glucose afin de mesurer le métabolisme glucidique (n=192, durée de l’intervention : 3h); 6/ un test de tolérance à l'insuline afin d'étudier la sensibilité des animaux à l'insuline (n=192, durée de l’intervention : 3h).

Impact sur les animaux

Le régime riche en gras induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche en gras auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La procédure chirurgicale de constriction transverse de l'aorte (TAC, ou aortic banding) peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Afin de limiter la douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. La lignée invalidée pour PIKfyve dans le cœur est une lignée déjà établie et qui a fait l'objet d’une étude rétrospective démontrant aucun effet néfaste chez la souris. L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale afin de limiter la douleur occasionnée à l'animal, à 2 semaines d'intervalle afin de garantir un repos suffisants aux animaux. Les volumes prélevés conformes aux BPL. Une surveillance sera assurée par un zootechnicien afin de s'assurer de l'absence de saignements après réintroduction des animaux dans les salles d'hébergement.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements d'organes nécessaires.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s’affranchir du modèle animal pour les études de physiopathologie cardiaque.

Réduction

Le critère principal de jugement de la fonction cardiaque sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal, traitement analgésique après réveil et 24h après l'opération. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux obèses et diabétiques dont un gène a été rendu non-fonctionnel. A ce jour, seul le modèle de souris (Mus musculus) permet de réaliser ces études. Les animaux utilisés seront âgés de 2 mois, correspondant au stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature car ils sont les plus réceptifs à la procédure chirurgicale et au régime riche en gras.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par un paludisme murin, elles subissent des prélèvements sanguins à la queue tous les deux jours pendant un mois, une injection de bleu Evans puis une dislocation cervicale sous anesthésie, pour tester comme antipaludiques des molécules déjà employées contre d'autres maladies. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut entraîner une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids, la souche étant retenue justement parce que ces souris resistent bien à ces parasitémies. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit la complexité de l'infection et conclut à l'absence de "solution viable de remplacement".

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un repositionnement médicamenteux. Il vise à déterminer l'efficacité de molécules initialement utilisées pour traiter la tuberculose, des fascioloses ou bien encore des helminthiases, en tant qu'antipaludiques. Lesdites molécules ont préalablement été testées in vitro et sont issues des dernières générations de molécules produites pour les infections précédemment mentionnées. Elles présentent un intérêt chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà utilisées. L’injection au niveau abdominale de bleu evans permet, 1H avant la mort des souris, de marquer les tissus ayant subi des dommages et de les quantifier. Ces tissus sont récupérés après l’euthanasie et soigneusement conservés dans du formamide.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique

Procédures

Un premier lot de 2 souris subit un prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours et à partir de 7% de parasitémie, une anesthésie et un prélèvement rétro orbitaire seront réalisés - la totalité du sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées (durée 30 minutes) et décapitées pour récupérer les cerveaux intacts. Un autre lot de 40 souris subiront des prélèvements veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours accompagnés de pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale permettant de collecter le cerveau, le sang et les autres organes. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g ; tel que : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine.

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des rongeurs ou lagomorphes pour la cytotoxicité et la reprotoxicité et ayant conduit à leur autorisation de mise sur le marché dans le cadre de traitement humain (sutézolide) et vétérinaire (triclabendazole). Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité décrits dans la littérature. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’injection de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux elevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées. L’euthanasie se justifie par le prélèvement de la totalité du sang infecté pour le premier lot de 2 souris - il est également justifié pour le second lot de 40 souris ce qui permet de récupérer rapidement les organes vitaux des souris et le sang pour dosage médicamenteux. Les souris ne peuvent plus être infectée en raison des restes de médicaments et de la prise de poids

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% Nous prenons 8 souris, tq 4 mâles + 4 femelles par groupe afin de prévenir toute perte d'effectif qui rendrait statistiquement nulle l'expérience.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’Etablissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. La Kétamine (100 mg/Kg) et la Xylazine (10 mg/Kg) avec une injection de 100µL pour 20 grammes de masse corporelle seront utilisés afin de limiter la douleur, notamment pour le retro orbitaire (procédure 1) et les anesthésies avant dislocations cérébrales en fin de procédure 2. De façon générale, Des aiguilles plus fines 29 gauge pourront être utilisées en complément d’une pommade (lidocaine) si les sites d’injection en intrapéritonéal deviennent sensibles pour les souris. En cas de difficulté d'alimentation des croquettes imbibées et des biberons aux tétines plus faciles d'accès peuvent etre également mis en place.

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus muculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. la simplicité et l'efficacité du modèle {BALB/c+Plasmodium berghei} en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées d'hydrogels chargés d'anticorps puis des séances d'imagerie en fluorescence sous anesthésie, trois fois par semaine pendant 21 jours, pour comparer ce relargage continu aux injections classiques. Le porteur reconnaît que ces injections peuvent provoquer une inflammation locale, accentuée par les frottements sur le gel. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la complexité d'un environnement sous-cutané et conclut que la souris est "nécessaire", l'intérêt annoncé étant une administration moins coûteuse.

Objectifs

L’objectif du projet est de démontrer une équivalence ou une amélioration à l'administration d’anticorps thérapeutique en utilisant une formulation à base d’hydrogels comme une alternative aux méthodes d’injections sous-cutanées actuellement utilisée en routine clinique.

Bénéfices attendus

A la fin de ces expériences, nous espérons pouvoir déterminer une méthode de relargage continue d’anticorps améliorée par rapport aux injections cumulées, offrant une nouvelle alternative moins couteuse.

Procédures

Injections sous cutanée des composées sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris. 3x/semaine pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection sous cutanée des composées pourrait engendrer une inflammation locale. De plus les frottements et pressions sur les hydrogels pourraient accentuer potentiellement cette inflammation. Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé, une baisse de la pression artérielle et une augmentation de la fréquence cardiaque. Ces effets potentiels ont été pris en compte dans l'établissement des points limites.

Devenir

Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire les conditions permettant de récapituler la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler le relargage sous-cutané des anticorps piégés dans des hydrogels.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.

Raffinement

Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris sont maintenues en groupe de 5 par cage pour maintenir une interaction sociale entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) un traitement par un analgésique sera effectué. Des points limites ont été établis pour anticiper toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les réplications de mouvement, frottements, pressions sur le gel qu’un humain pourrait avoir ne sont réplicables que sur un organisme vivant. La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude. De plus la souris est le modèle adéquat pour les raisons suivantes : - nombreux protocoles bien établis pour cette espèce - possibilité de comparaison de nos résultats avec ceux d’autres groupes utilisant des hydrogels de formulations différentes Des souris adultes seront utilisées car le système d'hydrogel s'adresse à ce type de populations.