Souris
Entretien d’une lignée de souris invalidées pour le gène codant les orexines et création et entretien d’une lignée dérivée, invalidée pour le gène codant les orexines et pour le gène du 26RFa
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet consiste à créer et entretenir une lignée génétiquement modifiée invalidée pour les gènes de deux neuropeptides, avec une biopsie de la queue sous anesthésie pour le génotypage. Les animaux au génotype "inadéquat" sont mis à mort après le génotypage, les reproducteurs trop âgés une fois qu'ils ne produisent plus de portées. Le porteur affirme que l'étude de ces neuropeptides "n'est possible que dans un système intégré" et justifie ainsi le recours à la souris, l'entretien de la lignée servant de support à de futurs projets.
Objectifs
L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi impliqués dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique, c'est à dire dans la capacité du système à maintenir un équilibre de fonctionnement (ici la glycémie) quelles que soient les contraintes extérieures. C’est notamment le cas des Orexines : neuropeptides hypothalamiques, exprimés dans l’aire hypothalamique latérale (LHA) et connues pour stimuler la prise alimentaire. Nos observations montrent que les orexines sont co-exprimées avec le 26RFa, autre neuropeptide hypothalamique de la LHA. De plus, le 26RFa a récemment été décrit comme un nouvel acteur de la régulation centrale de la glycémie. La compréhension du rôle des orexines, de ses mécanismes d’action et des interactions existant entre les deux systèmes neuropeptidergiques (Orexines et 26RFa) pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Ce projet vise à entretenir la lignée de souris invalidées (Knock-Out) pour le gène codant les orexines et à obtenir une lignée de souris invalidées à la fois pour les orexines et le 26RFa (double mutant). Ces lignées permettront de caractériser le rôle et les mécanismes d’interaction de ces neuropeptides dans la régulation de l’homéostasie glucidique en contextes physiologique et physiopathologique. L’entretien de la lignée invalidée pour le 26RFa fait l’objet d’une autorisation de projet déjà validée. Les protocoles de recherche utilisant ces souris mutantes seront détaillés dans d’autres projets de recherche spécifiques, ce projet ne concerne que l’obtention et l’entretien des lignées transgéniques.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’approches d’hybridation in situ a permis une première évaluation de l’expression des orexines et du 26RFa dans le système nerveux central. Nous avons observé que ces deux neuropeptides sont conjointement exprimés dans une population de neurones de l’hypothalamus latéral. Si le rôle des neurones à 26RFa dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique a récemment été mis en évidence, le rôle des orexines est, à l’heure actuelle, mal connu. La colocalisation de ces deux systèmes neuropeptidergiques dans les mêmes neurones suggèrent néanmoins qu’ils pourraient tous deux être impliqués et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. De fait, l’étude de ces modèles de souris invalidés soit pour les orexines seules, soit pour les orexines et le 26RFa, compléteront les études menées chez les animaux invalidés pour le 26RFa seul. Les données obtenues chez ces mutants permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides et les interactions mises en jeu entre ces deux systèmes dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes moléculaires sous-tendant leur action.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm déstiné au génotypage des animaux) sous anesthésie à l'isoflurane : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie.
Impact sur les animaux
L’élevage et la reproduction d’animaux n’induisent aucun stress ni souffrance particuliers chez les animaux. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié, pour déceler tout signe de souffrance : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante. Si 'un de ces signes ou une combinaison de signes apparait, le suivi de l'animal sera renforcé et les soins adéquats seront apportés (désinfection à la bétadine, analgésie assurée par injection de 200µg de buprénorphine, répétée après 4 heures si nécessaire). Si l'état de l'animal s'aggrave dans les heures qui suivent ou ne s'améliore pas dans les 24 heures, il sera considéré qu'un niveau de souffrance intolérable est atteint et la mise à mort sera réalisée par décapitation après anesthésie générale à l'isoflurane (5%). Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Afin de réduire une éventuelle souffrance lors d’une mise bas difficile, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. Au cours de la mise bas, les femelles seront suivies afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise bas dure en moyenne 2 heures chez la souris). En cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…), la mère sera manipulée pour aider à la mise bas.
Devenir
L'ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l'entretien de la lignée 26RFa-/- ; Or-/-. Les animaux de génotype adéquats seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissances à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquats donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude du rôle du système neuronal à Orexines et de ses interactions avec le système à 26RFa dans la régulation de l’homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation d’animaux modèles.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à obtenir dans les mêmes portées les animaux mutants et les animaux contrôles. Les cohortes d’animaux ainsi produites seront soumises à plusieurs tests physiologiques successifs, en respectant toujours un délai de repos entre chaque test, afin d’évaluer les rôles des orexines et du 26RFa dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Cela permettra de réduire le nombre de cohortes produites.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas. En cas de difficultés (temps de mise bas allongé, mise bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…), la mère sera isolée après avoir reçu 1ml de fluide tiède par voie SC pour la réhydrater. Elle sera gardée dans un endroit calme et chaud. L’abdomen de la mère sera manipulé afin de favoriser l’expulsion des petits. Si l’aide apportée n’est pas suffisante pour déclencher la mise-bas et afin d’éviter une souffrance de la mère, elle sera mise à mort par décapitation après anesthésie générale à l’isoflurane (5%). Les femelles démontrant des signes de dystocie seront mises à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existe pas chez d’autres modèles mammifères. La mutation ciblée a été créée en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) SM1 dérivées de 129S6/SvEvTac. Cette lignée a ensuite été rétrocroisée en fonds C57Bl/6J au moins 8 fois par le laboratoire donneur. Les animaux mutants pour le gène codant les orexines (lignée murine B6.129S6-Hcrttm1Ywa/J) provenant du Jackson Laboratory seront croisés avec des animaux C57Bl/6J afin d’entretenir une reproduction. La lignée 26RFa-/- (également connue sous le nom Qrfp-/-) utilisée dans ce projet fait l’objet d’une autorisation de projet déjà validée.
Exposition au tabac in utero et trajectoires pulmonaires de l’enfance à l’âge adulte : impact sur la régénération alvéolaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées à la fumée de cigarette deux heures par jour, sept jours sur sept, de l'accouplement jusqu'à la mise bas, et leurs petits, dont certains reçoivent des injections, sont mis à mort pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que les souriceaux exposés naissent avec un retard de croissance et une fonction pulmonaire diminuée, l'objectif étant d'étudier la régénération pulmonaire in vitro à partir de ces poumons. Il affirme que l'effet d'une molécule sur un organe "aussi complexe que le poumon" ne permet pas encore le recours à des méthodes de remplacement.
Objectifs
L'exposition au tabagisme actif et passif génère des coûts de santé importants à court et long terme. L'exposition au tabac perturbe la croissance globale et pulmonaire des foetus. Le tabagisme actif pendant la grossesse est un facteur de risque de certaines anomalies congénitales et est associé à un risque accru de mort foetale in utero. Le tabagisme passif pendant la grossesse est associé à un risque de prématurité avec une relation dose-effet. Le tabagisme maternel est aussi associé aux morts inattendues du nourrisson et à une diminution de la fonction respiratoire chez les enfants avec une augmentation de la susceptibilité aux infections respiratoires virales. On sait depuis quelques années que la croissance pulmonaire dans l'enfance impacte la fonction pulmonaire à l'âge adulte. Une croissance perturbée augmente le risque de bronchopneumopathie chronique obstructive à l'âge adulte. L'identification des mécanismes permettant la régénération de la structure pulmonaire chez les fœtus et nouveau-nés exposés au tabagisme passif dès la période in utero est essentielle dans un contexte où aucune thérapie n'est disponible. Nous supposons que la consommation de tabac par la mère pendant la grossesse module les différentes populations de cellules pulmonaires fœtales du micro-environnement . Les capacités du poumon à se réparer seraient altérées conduisant à un développement alvéolaire et bronchique pulmonaire anormal. Ceci serait lié à une altération du contenu en graisses et de son utilisation par les tissus pulmonaires qui contiennent des cellules souches. L'administration de médicaments stimulant ces voies métaboliques reprogrammerait ces cellules. Ceci pourrait contribuer à créer un environnement favorable à la croissance et la multiplication des cellules pulmonaires nécessaires pour induire la régénération alvéolaire chez les fœtus exposés en prénatal au tabac. L’objectif principal est donc de comparer les capacités de régénération alvéolaire des cellules pulmonaires de souris exposées ou non au tabagisme passif, en évaluant leur capacité à former du nouveau tissu pulmonaire in vitro. Dans les objectifs secondaires, nous espérons favoriser la régénération alvéolaire in vitro grâce à des traitements médicamenteux ciblés .
Bénéfices attendus
Nous espérons mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à une diminution de la construction de nouvelles alvéoles et tenter de corriger ce défaut avec des médicaments stimulant le métabolisme et l’assimilation des lipides.
Procédures
Les animaux seront exposés à la fumée de cigarettes ou à de l'air filtré. Les animaux du groupe d’exposition à la cigarette sont exposés à la fumée filtrée grand public avec une machine à fumer. Les animaux sont placés dans une boîte, et les cigarettes sont délivrées de manière cyclique afin d’imiter de près le comportement tabagique typique dans la mesure du possible. Une procédure similaire est utilisée pour les animaux témoins, sauf qu’ils sont exposés à l’air ambiant filtré plutôt qu’aux cigarettes. L’exposition aux cigarettes ou à l’air filtré est faite pendant 2 heures/jour, 7 jours/semaine, en commençant 2 semaines avant l’accouplement et sont poursuivies pendant les 3 semaines de gestation jusqu’à l’accouchement. Des souriceaux seront exposés durant leur "adolescence" aux mêmes procédures. Les souriceaux vigiles pourront recevoir dans les premiers jours de vie une injection intra-péritonéale de médicaments (durée
Impact sur les animaux
L'exposition anténatale au tabac a déjà été réalisée et a montré que la fertilité était la même chez les souris exposées ou non au au tabac. Les portées sont équivalentes en nombre. Les souriceaux dont les mères étaient exposées au tabac lors de leur gestation ont un retard de croissance intra-utérin. Le rattrapage pondéral est complet en trois semaines. Les souriceaux dont les mères ont été exposées au tabac lors de leur gestation ont une diminution de leur fonction pulmonaire sans anomalie du nombre d'alvéoles. Certains animaux vont recevoir des injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale.
Devenir
Les souris adultes seront mises à mort au moment où leurs petits seront sevrés. Les souriceaux seront mis à mort pour prélever leurs poumons qui seront étudiés en totalité pour analyse des cellules pulmonaires ou pour des analyses biochimiques.
Remplacement
Le tabagisme pendant la grossesse est associé à un risque accru de faible poids de naissance et de retard de croissance intra-utérin. L'exposition au tabac secondaire a un impact direct sur le développement pulmonaire et la morbidité respiratoire. La manière dont la fumée de cigarette affecte le développement pulmonaire et induit des conséquences à long terme reste à déterminer. Cependant, la consommation de tabac isolée induit rarement chez l’Homme une mort in utero. Le fœtus étant alors souvent porteur d’autres pathologies ce qui rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. D’autre part, les prélèvements pulmonaires humains sont difficilement accessibles dans l’enfance. Dans cette étude, le tabagisme passif chez la souris permettra d’étudier des lésions directement et uniquement liées au tabagisme passif. Les souris adultes seront exposées pendant la gestation exposant les souriceaux dès la période in utero. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation au tabac ou à un air filtré (contrôle). Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J21 ou J49 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Un seul animal sera utilisé pour répondre à plusieurs questions en utilisant diverses technologies et notamment les cultures cellulaires. A partir des poumons de souris exposées ou non au tabac, nous récupérerons des fibroblastes et des pneumocytes de type 2 pour générer des organoïdes alvéolaires en culture cellulaire. Nous prélèverons aussi des poumons pour effectuer des analyses biochimiques. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées pour ces cultures, les cellules seront congelées à chaque fois que cela sera possible, permettant ainsi de réutiliser les cellules d'une même souris à plusieurs reprises et de multiplier par ce fait les expériences sans nécessité de réaliser de nouvelles mises à morts. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour nos études immunohistochimiques et moléculaires.
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect (général et vivacité), la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect (trophique et vivacité) et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal-être, les souriceaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point d'animaux génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Les souris ont à la naissance un développement pulmonaire très immature sans alvéole,. Ainsi, l'alvéolisation chez la souris se déroule pendant les trois premières semaines de vie post-natale ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude de leurs poumons. Les souris adultes seront étudiées à partir de l’âge de deux mois. Les souriceaux seront étudiés dès la période anténatale et jusqu’à la fin de l’adolescence.
Développement d’anticorps à visée thérapeutique pour la thérapie des cancers dans un modèle de souris immunodéprimées (mus musculus).
- Recherche appliquée
- Cancers
1 500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses humaines sur le flanc, puis des injections intraveineuses répétées d'anticorps et des prélèvements sanguins, pour sélectionner un candidat destiné à des essais cliniques. Le porteur reconnaît qu'un test in vitro existe et s'est révélé "probant" sur les anticorps concernés, mais affirme que le modèle animal reste "indispensable et non substituable" avant tout passage chez les patients. Les tumeurs des groupes témoins non traités sont laissées croître jusqu'à la fin de l'expérience.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’anticorps thérapeutiques ou des anticorps bispécifiques correspondants dans un modèle de souris greffées en sous cutanée avec des cellules de cancers humains Cette possibilité de combiner les anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Les versions chimériques (= anticorps toléré chez la souris) de ces anticorps ont déjà été testés lors de précédents projets dans un modèle de souris syngénique optimisé et ont prouvé leur efficacité et leur bonne tolérance dans ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester les versions humanisées (= anticorps toléré chez l'Homme) de ces anticorps thérapeutiques sur des modèles de tumeurs xénogéniques.
Bénéfices attendus
Le meilleur anticorps thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles biothérapies (anticorps humanisés, anticorps bispécifiques) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.
Procédures
Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intraveineuse anticorps sur animal vigile (8 injections, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 24 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements, 2 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 2 jours sur environ 5 semaines (18 mesures, maximum 1 minute / animal = 18 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liés à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration de la tumeur puis des traitements (injections sous-cutanées puis intraveineuse). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation d’une tumeur sur le flanc de l’animal, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe attachée à cette demande de projet.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.
Remplacement
Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cancéreuse cible et provoquer sa destruction via des cellules effectrices. Nous avons réalisé ces tests sur les candidats anticorps humanisés notifiés dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cette étude nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation du modèle syngénique dans un précédent projet et le développement du modèle par notre partenaire, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris maximum par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe partenaire a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses. De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps.
Rôle de la protéine BIN1 et du transport vésiculaire pour le maintien des tubules T dans l’infarctus myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie du cœur par ligature coronaire d'environ une heure, avec ouverture puis fermeture du thorax, pour étudier le rôle d'une protéine dans le maintien des cellules cardiaques après un infarctus. Le porteur indique que l'anesthésie et la chirurgie peuvent provoquer hypotension, refroidissement et perte de poids, et prévoit environ 25 % de mortalité liée à l'infarctus. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de modéliser l'ischémie-reperfusion et conclut que le remplacement "ne sera pas possible".
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'éclaircir les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation de tubules T des cardiomyocytes dans l’infarctus myocardique. En particulier, nous cherchons à déterminer si BIN1 et le transport vésiculaire ont un effet protecteur sur le maintien des tubules T et la contractilité cardiaque. Nous utiliserons un modèle d'ischémie-reperfusion myocardique chez la souris nous permettant d'étudier l’organisation des tubules T, les taux de BIN1 et de ses partenaires, ainsi que l'effet de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs (dexaméthasone, DEX, et rapamycine, RAP) sur la taille de l'infarctus.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde (IM) aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Lors d’un IM, l’occlusion d’une artère coronaire irrigant le cœur prive les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) d’oxygène, entrainant une dégradation de ces cellules et une diminution de leur contractilité. En particulier, les invaginations transversales membranaires ou tubules T des cardiomyocytes, essentielles à la contraction au niveau cellulaire, sont altérées. Cependant, ces mécanismes sont pour le moment encore mal compris. En étudiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du réseau de tubules T cardiaques, notre projet permettra de mieux comprendre comment les tubules T sont générés et dégradés, et de déterminer les acteurs clés de ces processus. Il sera ainsi possible de contrecarrer la dégradation des tubules T et de restaurer la contractilité cardiaque en régulant la concentration des acteurs clés. Pendant la durée de ce projet, nous espérons pouvoir identifier les conditions permettant la maintenance des tubules T des cardiomyocytes dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion, ainsi qu’une amélioration de la contractilité cardiaque. L’étude de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs nous mettrons également sur la voie de futur traitements possibles chez les patients pour maintenir la contractilité cardiaque dans les zones les plus affectées après un IM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'ischémie/reperfusion myocardique (ligature coronaire). La durée totale de l'intervention chirurgicale est de 60 min, dont 15 min entre l'intubation oro-trachéale et l'accès au coeur, 30 min de ligature coronaire, et 15 min pour la fermeture du thorax. Un prélèvement sanguin terminal de 150 µl sera également effectué au moment du sacrifice des animaux (procédure 1).
Impact sur les animaux
Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie et la chirurgie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Avant utilisation, une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur, dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids en groupe social au sein de l’animalerie en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu par des jouets (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Avant procédure, une surveillance quotidienne des animaux (observation de l’état général) sera réalisée par le personnel de l’animalerie soignant les animaux, et leur poids sera suivi de façon hebdomadaire par le personnel réalisant les procédures chirurgicales. Après la chirurgie, les animaux seront gardés sous surveillance dans une cage sur tapis chauffant avec enrichissement, eau et nourriture gélifiée en plus de l’alimentation habituelle. Cette surveillance, où l’animal est isolé, dure approximativement 24h, puis les animaux retrouvent leur hébergement en groupe social avec enrichissement, en conservant autant que possible les groupes formés afin de maintenir la stabilité hiérarchique établie. Pendant tout le protocole expérimental, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel ayant réalisé la procédure chirurgicale grâce à la grille de score des points limites (fiche d’observation, voir annexe) qui est mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. En cas de souffrance de l’animal selon le score obtenu à l’aide de la grille d’évaluation, une nouvelle injection d’antalgique (buprénorphine 0.1mg/Kg) sera réalisée. Au cours de la procédure, la décision de garder les souris en vie sera prise par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde (kétamine/xylazine) pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette etude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible de l'ischémie-reperfusion myocardique
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 animaux + 25% de mortalité liée à l'infarctus, soir 15 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux les effets de l'ischémie reperfusion myocardique sur , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux a inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience.
Raffinement
Nous raffineros cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage d’animalier minimum 2 fois/jour). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique (cocktail kétamine 100mg/Kg /Xylazine 10mg/Kg i.p.) avant la chirurgie et d’analgésique (Buprénorphine 0.05mg/Kg) aux doses appropriées avant la chirurgie, une deuxième injection de Buprénorphine (0.05mg/Kg) est réalisée 6h après le réveil puis une troisième injection 14h après la seconde injection.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. 3 mois (jeunes adultes) pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie liée au vieillissement.
Les cellules ganglionnaires intrinsèquement photosensibles de la rétine (ipRGCs) et l’agressivité : effet direct de la lumière bleue ?
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 22
Autres rongeurs : 65
636 rongeurs, soit 549 souris, 22 rats et 65 autres rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, et tous sont mis à mort pour l'analyse de leur cerveau, après des tests comportementaux qui durent chacun de 1 à 5 minutes. Selon les groupes, ils subissent deux examens de l'œil et une injection dans l'abdomen d'une molécule qui bloque les effets de la lumière bleue, une injection dans l'œil sous anesthésie, ou une chirurgie du crâne de 45 minutes suivie de trois semaines d'injections quotidiennes dans l'abdomen. Le porteur ne nomme pas les tests et précise seulement que l'un d'eux provoque des affrontements, avec des plaies dues aux morsures et griffures. Il écrit que ces connaissances "pourraient permettre d'élaborer de nouvelles stratégies" d'éclairage, y compris dans les animaleries pour y limiter les comportements agressifs.
Objectifs
La lumière influence en profondeur la physiologie et les comportements des organismes vivants. Chez les mammifères, en plus de permettre la vision, la lumière influence de nombreuses fonctions biologiques via des cellules spécifiques sensibles à la lumière, localisées dans la rétine et activées par la lumière bleue: il s’agit des cellules mélanopsinergiques. Les cellules mélanopsinergiques projettent dans différentes régions du cerveau et permettent la régulation par la lumière de la physiologie et du comportement selon 2 mécanismes principaux : 1, la synchronisation de l’ensemble des fonctions biologiques avec le cycle jour/nuit, un effet qui implique l’horloge biologique centrale . 2, des effets directs sur de nombreux comportements via la projection des cellules mélanopsinergiques vers d’autres parties du cerveau. La société moderne vit sous une illumination quasi-permanente, en particulier à la lumière bleue (LED, smartphones, écrans d’ordinateurs). Il est connu que l’exposition excessive à ces lumières enrichies en bleu, en particulier en fin de période d’activité (soirée), peut provoquer des troubles des rythmes biologiques du sommeil, et divers effets comportementaux associés, notamment une augmentation de l’agressivité. Dans ce projet nous posons la question suivante : est-ce que la lumière bleue peut exercer un effet direct sur le comportement agressif, indépendamment d’une altération des rythmes biologiques? En effet, les projections des cellules mélanopsinergiques atteignent notamment les structures du cerveau impliquées dans le contrôle de l’agressivité. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif chez des modèles animaux 2) identifier les populations cellulaires du cerveau impliquées dans cet effet de la lumière bleue et 3) comprendre le rôle de structures spécifiques contrôlant l’agressivité dans ces effets sur le comportement agressif. Afin d’exclure un effet mettant en jeu l’horloge biologique centrale, l’exposition à la lumière bleue aura lieu spécifiquement à des créneaux de jour, auxquels elle ne peut pas entrainer de décalage de cette horloge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer de nouvelles connaissances sur les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif. Ces connaissances pourraient permettre d’élaborer de nouvelles stratégies vis-à-vis de l’éclairage/exposition à la lumière (intensité et spectre) dans les animaleries, afin de susciter au minimum les comportements agressifs. Les résultats obtenus seront aussi informatifs quant aux potentielles nuisances (facilitation d’un comportement agressif) induites par l’éclairage à dominante bleue chez l’humain. Ceci pourrait permettre de définir de nouvelles normes d’exposition lumineuse (environnements collectifs, agressivité pathologique) afin de diminuer l’expression des comportements hostiles. Enfin, en plus de renforcer les connaissances actuelles sur le comportement agressif de la souris, ce projet permettra aussi d’obtenir des informations sur le comportement d‘un modèle peu connu à ce jour le rat africain. Ce dernier pourrait donc représenter un modèle d’agressivité ainsi qu’un modèle des effets de la lumière bleue sur la physiologie et le comportement, plus représentatif de l’humain que le modèle de souris.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à un examen de l’œil d’une durée de 20 minutes. Un mois plus tard il sera soumis à trois tests comportementaux d’une durée de 1 à 5 minutes. Les animaux seront ensuite soumis à un nouvel examen de l’œil. Deux semaines plus tard ils recevront une injection dans l’abdomen d’une molécule qui empêche les effets de la lumière bleue sur l’organisme (durée injection 30 secondes). Ensuite ils seront soumis à un test comportemental d’une durée comprise entre 1 et 5 minutes. Un groupe d’animaux recevra une injection dans l’œil sous anesthésie locale et générale. Un autre groupe subit une chirurgie du crâne d’environ 45 minutes. Après 2 semaines de repos les animaux reçoivent une injection journalière dans l’abdomen pendant 3 semaines. A l’issue ils seront soumis à un test comportemental d’une durée de 1 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’impact de la lumière bleue peut changer le niveau d’anxiété et d’agressivité des animaux ce qui est l’objet de la question posée. 2) les tests comportementaux peuvent induire un stress ainsi que des blessures liées aux affrontements lors d’un des tests (plaies dues aux morsures et griffures). 3) les animaux sont soumis à différentes injections causant des désagréments communs (inflammation, douleurs, stress, risque infectieux, anxiété, perte de poids) ou spécifiques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de récupérer leurs cerveaux qui serviront pour analyse.
Remplacement
La première partie de projet consiste à obtenir des informations sur le comportement des animaux en réponse à une lumière bleue. Il n’existe pas de moyens de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour obtenir une réponse comportementale. Les deuxièmes et troisièmes parties consistent à obtenir des informations sur la chimie et le fonctionnement du cerveau animal. Or à l’heure actuelle aucun moyen alternatif (ex : logiciels informatiques) ne permet de représenter assez fidèlement le cerveau animal pour obtenir de telles informations.
Réduction
Une approche statistique a été utilisée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats fiables et robustes. Ce nombre est également appuyé par des études précédentes.
Raffinement
Les animaux ont à leur disposition du matériel pour pouvoir nidifier et ronger. Un tunnel en plexiglas est également ajouté à la cage. L’hébergement des animaux est optimisé afin de diminuer les affrontements au sein d’une cage. Les animaux isolés physiquement peuvent néanmoins se voir, s’entendre et se sentir. Avant chaque procédure les animaux participent à un entrainement afin de les habituer au contact avec l’humain et à la procédure. Toute procédure invasive potentiellement douloureuse est réalisée sous traitement antidouleur. L’'état général de l'animal ainsi que celui de chaque œil seront vérifiés quotidiennement et la souffrance éventuelle entrainée par les procédures est évaluée grâce au comportement et à l’aspect physique des animaux. En cas de souffrance, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et un traitement requis mis en place. Des points limites onté été établis permettant l'arrêt des procédures et ainsi réduire la souffra,ce animal. Une étude préliminaire est mise en place afin d’optimiser les données obtenues tout en minimisant l’impact sur les animaux.
Choix des espèces
Afin d’observer des réponses comportementales et des effets de la lumière sur l’œil et le cerveau il est indispensable d’utiliser des animaux. La connaissance approfondie de la génétique de la souris permet l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Cela donne accès à des outils indispensables pour l’étude des fonctions des structures du cerveau impliquées dans le comportement agressif. Le rat africain est un modèle animal diurne correspondant au mode d’activité de l’humain. Il possède également une rétine dont la composition est proche de la rétine humaine. Des informations comportementales complémentaires pertinentes pour l’humain seront alors collectées. L’agressivité des rongeurs semble décliner avec l’âge a l’instar des capacités motrices. Pour ces raisons nous avons choisi de jeunes adultes (2-4 mois). Cela permet d’utiliser des individus avec un comportement agressif encore développé. Nous utilisons également une tranche d’âge resserrée afin de s’affranchir des trop fortes variations d’agressivité liées l’âge.
Etude de la voie de l’hypusination dans le cancer de la prostate
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Une partie des 288 souris porte des mutations parmi les plus fréquentes du cancer de la prostate humain, et à 5 mois, après un traitement au tamoxifène à 8 semaines de vie, les souris présentent selon le porteur des lésions précancéreuses et des adénocarcinomes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, une chirurgie de 45 minutes pour implanter une mini-pompe qui diffuse pendant six semaines le composé GC7 ou une solution saline, puis une seconde chirurgie pour la retirer. Le porteur écrit avoir choisi la mini-pompe afin d'"améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes", un choix qui impose deux opérations. Toutes sont tuées par lots, de trois semaines après le début du traitement jusqu'à un mois après sa fin, pour le prélèvement d'échantillons.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie durant une période de 6 semaines une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue en maitrisant la dose délivrée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigenèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation d'isoflurane durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe puis d'une seconde intervention chirurgicale à son retrait. L'administration du composé a lieu en continu pendant 6 semaines. A la fin du traitement, les pompes seront retirées sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane (30 minutes). Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous aseptie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 1 mois après la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des échantillons et leur analyse. Par ailleurs, un temps d'observation de 1 mois est nécessaire pour laisser le temps au composé d'agir et d'avoir un effet sur la croissance des tumeurs, ce qui justifie d'attendre un mois.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques et 5 souris pour l'analyse des transcrits soit 2 génotypes x 18 souris x 2 conditions x 4 temps, donc 288 souris. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques. Nous aurons les génotypes des souris contrôle et des souris mutantes, et les 2 conditions eau saline et GC7. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec protection du cycle veille/éveil par des systèmes de lampes programmées. Une nourriture adaptée aux rongeurs ainsi que des biberons d'eau seront disponible à volonté. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. De la naissance à la mort et afin de favoriser le bien-être animal, les groupes sociaux des animaux seront respectés et aucun animal ne sera laissé seul. Nous mettrons aussi dans chaque case de la cellulose afin que les souris puissent se constituer un nid. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée sera mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés au Tamoxifène à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques et des adénocarcinomes. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, puis un lot à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.
Mesures par électromyographie de l’activité neuro-musculaire chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des électromyographies sous anesthésie tous les trois mois pendant vingt et un mois, sous régime obésogène pour une partie, avant le prélèvement de leurs muscles, pour valider un protocole de mesure de l'onde H et prendre en main un nouvel appareil. Le porteur présente ces mesures comme non invasives et vise à en faire une "prestation" ouverte à la communauté scientifique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal.
Objectifs
Examen de référence en neurologie, l’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle plantaire est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse : une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde réflexe (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. La latence et l'amplitude de ces ondes permettent de détecter une atteinte neuromusculaire. L'onde H est difficile à détecter et à mesurer car son amplitude est faible (inférieure à 1 mV) et l'onde peut être difficile à distinguer du bruit de fond. Nous avons fait l'acquisition d'un système EMG qui permet d'éliminer le bruit de fond et de visualiser l'onde H. Une équipe partenaire a mis au point et validé un protocole permettant d'observer correctement l'onde H. Nous souhaitons d'une part prendre en main ce nouvel appareil et valider notre capacité à observer une onde H en utilisant quelques animaux envoyés par cette équipe, d'autre part valider ce protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire avec les souris C57Bl6J adultes jeunes et âgées afin de déterminer si l'évolution de l'amplitude de l'onde H chez ces souris est une variable d'intérêt pour les études sur le vieillissement, et enfin, tester si un régime obésogène, entraine une diminution plus rapide de l'amplitude de l'onde H chez les souris, signant un développement précoce d'atteintes neuromusculaires liées à l'âge. Ces mesures non invasives, si nous validons nos protocoles lors de ce projet, seront proposées à la prestation dans notre plateforme d'exploration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Validation du protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire, plateforme d'exploration fonctionnelle ouverte à la communauté scientifique - Ouverture d'une nouvelle prestation répondant à des besoins exprimés par la communauté scientifique locale - Utilisation d'une variable obtenue de manière non invasive dans les études du vieillissement.
Procédures
Mesures de l'electromyogramme (EMG) sous anesthésie générale chaque 3 mois durant 21 mois maximum. Mise en régime obésognène durant 21 mois. Pour l'enregistrement de l'EMG, les souris sont anesthésiées par voie intra-péritonéale (durée de l'injection
Impact sur les animaux
La mesure de l'EMG ne présente pas de nuisance pour l'animal qui est anesthésié. Si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Les souris FXN-Pvalb ont une délétion homozygote du gène codant pour la frataxine. Ces animaux présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent dès l'âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement de différents organes d'intérêt, notamment des muscles afin de comparer les mesures EMG et des observations histologiques.
Remplacement
Les modèles murins de neuropathies présentent des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique ou du vieillissement sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.
Réduction
Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les mesures électromyographiques. Ainsi, pour une puissance d'analyse de 80% avec un risque de 5%, nous avons défini des tailles de groupes de n=12 pour pouvoir conclure sur les paramètres mesurés. Nous avons constaté que cette taille d'effectif convenait dans les études électromyographiques antérieures réalisées chez nos partenaires d'autres plateformes nationales. Dans le protocole de challenge nutritionnel qui s'étale sur 21 mois, la cohorte de départ est doublée pour garantir un nombre correct d'animaux exploitables jusqu'au dernier point de mesure. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés. En fonction de la normalité des données, la comparaison des résultats entre deux groupes sera réalisée à l'aide d'un test paramétrique ou non paramétrique. Nous utiliserons 168 souris au total pour cette étude.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement qui devrait nous permettre de préserver au maximum le bien-être des animaux tout au long des procédures. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage, ils sont hébergées par cage de 4. De l'enrichissement sera ajouté pour pour amoindrir le stress et permettre aux animaux de faire un nid, des igloos seront placés dans les cages. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours par les personnels de la zootechnie et 2 fois par semaine par une personne impliquée sur le projet, ceci permettant de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements.
Choix des espèces
Notre plateforme propose des expérimentations sur les souris de laboratoire, c'est également l'espère hébergée dans la zootechnie dans laquelle sera installé le matériel. C'est par conséquent l'espèce sur laquelle nous souhaitons travailler et nous entrainer afin de répondre aux besoin de nos utilisateurs. Les souris FXN-Pvalb sont utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich et montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 7 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer chez ces souris, puis un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez les souris FXN-Pvalb. Ces animaux seront donc utilisés au stade jeune et adulte. Les souris C57Bl6J seront utilisées du stade jeune adulte (3 mois) jusqu'au stade âgé (24 mois) pour répondre à la question de l'évolution de l'onde H au cours du vieillissement sous challenge nutritionnel ou non.
Production et implantation ectopique de sphéroïdes hépatiques dans un modèle murin de toxicité hépatique (EU2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
453 souris mâles "nude" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Rendues malades du foie par un agent toxique, elles subissent l'implantation chirurgicale de sphéroïdes hépatiques dans la graisse abdominale et six à neuf prélèvements sanguins à la queue ou au visage sous anesthésie, pour tester un dispositif de suppléance du foie. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une douleur, une éviscération et une perte de poids, et cite l'anxiété comme un effet attendu "dans toute expérimentation animale". Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire ne peut simuler l'implantation dans un organisme vivant.
Objectifs
Le fonctionnement du foie peut être altéré pour diverses raisons : toxiques, génétiques, virales, métaboliques. Le foie possède naturellement une capacite de regeneration, cependant les dommages peuvent être irréversibles nécessitant alors une greffe de foie. Or, tous les patients n’y sont pas éligibles et il existe un problème majeur de pénurie de greffon. Nous proposons une stratégie visant à retarder voire éviter la nécessité d'une greffe de foie. Pour cela, nous nous baserons sur la capacité des cellules du foie à se multiplier et à régénérer son fonctionnement. A l’heure actuelle, il existe déjà une stratégie basée sur la transplantation de cellules du foie mais les foies atteints de cirrhoses sont trop altérés pour supporter cette transplantation et plus de 70% des cellules transférés ne survivent pas. C’est pourquoi nous voulons développer une stratégie novatrice basé sur la greffe d’un dispositif composé de cellules de foie au niveau d’un autre organe non touché par la maladie. Cette structure tridimensionnelle, comportant des cellules du foie saines, doit se brancher très rapidement à la circulation sanguine du greffé. Nous avons donc opté pour un tissu très riche en vaisseaux sanguins : l’épiploon (tissu graisseux localisé entre l’estomac et l’intestin). L’objectif de ce projet est de mettre au point le dispositif composé de cellules du foie saines, de l’implanter chez l’animal présentant une maladie chronique du foie et de vérifier que ce dernier se lie à la circulation sanguine de l’animal greffé pour permettre de restaurer un fonctionnement du foie normal. A long terme ce dispositif pourrait permettre d’éviter des greffes de foie et de pallier au manque de greffons.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait établir une preuve de concept. Il permettra - De définir les conditions de fabrication d’un mini foie tridimensionnel connecté à des vaisseaux sanguins, - D’évaluer le bénéfice et la stabilité de ce mini foie chez des gens présentant une grave maladie du foie. Ce dispositif pourrait être applique dans de multiples indications pour aider le foie malade. Par exemple il serait utile pour prévenir la progression de la maladie du foie et pour éviter ou retarder la nécessité d’une greffe de foie.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. 1. Interventions chirurgicales La durée sera environ de 30 minutes. Nous implanterons dans un tissu graisseux dans le ventre de l’animal, le mini foie 3D que nous auront préalablement créé. 2. Prélèvements sanguins : seront effectués 6 à 9 prélèvements sanguins sur la queue ou sur une partie du visage couramment utilisée pour cela. Pour surveiller l’activité du foie maladie et du mini foie 3D implanté. Les prélèvements seront réalisés chez un animal endormi (sous anesthésie générale). 3. Imagerie Nous réaliserons des échographies chez les animaux ainsi qu’une imagerie fluorescente le jour de leur mise à mort. Cela dans le but de visualiser les vaisseaux sanguins.
Impact sur les animaux
1) Douleur après la chirurgie 2) Mauvaise cicatrisation de la peau, éviscération (=lâchage de la suture et sortie des organes en dehors du ventre) 3) Perte de poids due à l’administration de l’agent toxique. 4) L’anxiété est un effet indésirable attendu comme dans toute expérimentation animale.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever les structures implantées (mini foie) ainsi que le foie de la souris pour l’analyser.
Remplacement
Les méthodes de culture en laboratoire ne peuvent simuler l’action mécanique d’implantation dans un organisme vivant d’une structure 3D. Le processus d’implantation, de connexion aux vaisseaux de la souris et de l’éventuel aide au foie malade ne peut pas se passer d’un modèle animal expérimental fiable. En effet il n’est pas envisageable d’implanter ces structures chez l’être humain sans études fiables préliminaires chez l’animal. De plus l’analyse du foie nécessiterait de faire des prélèvements de foie de façon répétée au cours du temps, ce qui est trop risqué pour la santé des patients et donc difficilement concevable. La souris constitue une espèce animale dont les gènes sont proches de l’être humain, largement utilisé en science du foie et dont la taille est suffisante pour la réalisation de la chirurgie prévue.
Réduction
Dans une logique de réduction, le nombre de sujets nécessaire par groupe est proposé à partir d’un logiciel qui détermine le nombre d’animaux nécessaires pour avoir des résultats intéressants et interprétables. Nous réalisons des étapes préliminaires pour sélectionner la meilleure technique chirurgicale et technique pour rendre le foie de la souris malade pour in fine utiliser une seule technique pour chaque et donc point d’animaux. Nous prévoyons également des solutions de secours à utiliser uniquement si échec de certaines procédures. Les procédures seront réalisées par du personnel expérimenté : i) un chirurgien, formé à l’expérimentation animale en tant qu’applicateur de procédure et ii) un ingénieur en imagerie du petit animal habilitée à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Raffinement
L’environnement du rongeur est enrichi, il a un accès illimité à l’eau et la nourriture. Du personnel qualifié de l’animalerie lui rend visite quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées que 7 jours après réception des animaux pour diminuer leur stress lié au changement d’environnement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et médicaments contre la douleur. Ce médicament contre la douleur sera utilisé également après la chirurgie. Le bien-être de l’animal sera évalué par une analyse attentive du comportement de l’animal et réalisation d’un score. Ce score nous permettra de quantifier de dégré de souffrance et de mettre en place des stratégies adaptées. Nous avons déterminé différents points limites spécifiques à nos procédures basés sur une observation et une pesée quotidiennes des animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi, comme nous avons lus dans les articles scientifiques, d’étudier des souris mâles Nude (poids 20- 25g) car leur statut de mâle leur confère une susceptibilité à développer une maladie chronique du foie. Leur statut d’animal immunodéprimé nous permet de pouvoir y implanter des structures cellulaires tridimensionnelles contenant des cellules humaines sans risquer un rejet de la part de l’hôte. Les souris possèdent un patrimoine génétique très proche de l’espèce humaine. Nous également choisi des souris mâles adultes de 6-8 semaines (20-25g ) car, selon la littérature, ils ne sont pas soumis aux variations hormonales des animaux en croissance ce qui pourrait interférer avec la capacité à accepter le greffon et à y apporter des vaisseaux du fait des stades de développement différent, de vitesses de croissance différentes ou du poids trop faible. Du fait de la durée prévisible de 14 semaines pour induire une maladie du foie, les implantations seront réalisées aux alentours de 20 semaines.
Mise en évidence des effets du LSD sur l’activité comportementale et cérébrale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
1 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Issues d'un modèle de trouble obsessionnel-compulsif au toilettage poussé jusqu'à la lésion cutanée, elles sont isolées dans des cages automatisées pour apprendre des tâches jusqu'à quatre mois, reçoivent une injection de LSD et subissent pour certaines une chirurgie de deux à trois heures, pour cartographier les régions cérébrales activées par la molécule. Le porteur indique que le LSD provoque des mouvements rapides de la tête et que de rares souris peuvent montrer une souffrance prolongée. Sur le remplacement, il affirme que la neuromodulation "ne peut être remplacée" par une approche ex vivo.
Objectifs
Ce projet, qui vise à enrichir les connaissances sur les mécanismes d'action de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) grâce à un ensemble d'expériences chez la souris, comporte trois axes: 1) Caractériser l'ensemble des régions cérébrales mis en jeu lors de l'administration de l'acide lysergique diéthylamide (LSD), grâce à des approches immunohistochimiques et de clarification du cerveau. 2) Étudier l'effet de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) sur le comportement des animaux. 3) Étudier plus en détail et à long-terme les modifications d'activités au niveau du cortex orbitofrontal, en lien avec la tâche d'apprentissage et l'administration de l'acide lysergique diéthylamide (LSD).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à enrichir les connaissances sur les mécanismes généraux d'action de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) grâce à un ensemble d'expériences chez la souris. Notre objectif est de cartographier les modifications d'activités cérébrales induites par l'acide lysergique diéthylamide (LSD) et pouvant sous-tendre ses effets thérapeutiques en psychiatrie.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, nous prévoyons d'étudier un modèle murin de trouble obsessionnel-compulsif (TOC) qui ont la particularité d’engager des actions de toilettage de manière compulsive. Ce phénotype peut conduire à des lésions cutanées au niveau de la face et du corps, qui est observable à partir de l’âge de 3 mois, seulement chez certains individus. Les souris seront isolées et placer dans des cages opérantes automatisées dans laquelle elles apprendront des tâches comportementales. Ces systèmes de cages fournissent un environnement enrichi pour les animaux où ils peuvent entreprendre des tâches comportementales à leur propre rythme. Les souris resteront dans ces boîtes en fonction du temps nécessaire à l'animal pour obtenir de bonnes performances dans la tâche, pour une période pouvant aller jusqu'à 4 mois. De plus, tout animal présentant des symptômes de stress élevé ou un manque de motivation lors de la tâche comportementale sera exclu du protocole et laissé en stabulation sous observation. Dans le cadre du projet proposé, les animaux vigiles recevront une dose faible ou élevée de l'acide lysergique diéthylamide (LSD). Nous retiendrons et manipulerons les animaux de manière douce et appropriée pour une injection rapide et réussie. Nous vérifierons également la zone injectée avant de remettre l'animal dans sa cage. L'ensemble de la procédure ne dure que quelques secondes. Nous prévoyons de ne faire qu'une seule injection par animal. Cependant, en raison de son métabolisme rapide, il pourrait être nécessaire d'administrer des doses répétées pour obtenir les mêmes effets que ceux observés chez l'homme. Les animaux qui atteindront un bon niveau de performance dans la tâche envisagée auront une seule intervention chirurgicale. L'opération dure généralement 2-3 heures pendant lesquelles les animaux sont anesthésiés et sous analgésie appropriée. Comme des prélèvements et des analyses post-mortem sont nécessaires, nous devons euthanasier tous les animaux impliqués dans notre projet.
Impact sur les animaux
Étant donné que l'objectif principal de ce projet est d'étudier les effets de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) sur le comportement et l'activité cérébrale de souris, nous utilisons le modèle murin de trouble obsessionnel-compulsif (TOC) qui ont la particularité d’engager des actions de toilettage de manière compulsive. Ce phénotype peut conduire à des lésions cutanées au niveau de la face et du corps, qui est observable à partir de l’âge de 3 mois, seulement chez certains individus. Les souris seront isolées pour être entraînées à des tâches comportementales. Cependant, elles seront logées dans des boîtes opérantes homecage automatisées, qui constituent un environnement enrichi. Dans le cadre du projet proposé, les animaux recevront une dose faible ou élevée de l'acide lysergique diéthylamide (LSD), qui induit transitoirement (quelques minutes) chez les souris des mouvements rapides de la tête d'un côté à l'autre. Rarement, les animaux peuvent montrer des signes de souffrance prolongée malgré les injections d'analgésiques. Tout animal présentant de tels symptômes sera exclu du protocole et euthanasié.
Devenir
Comme des prélèvements et des analyses post-mortem sont nécessaires, nous devons euthanasier tous les animaux impliqués dans notre projet.
Remplacement
Les méthodes utilisées nécessitent l’utilisation de modèle murin, notamment pour la neuromodulation qui ne peut être remplacé par une autre approche ex vivo pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
En réalisant des tâches comportementales ciblées utilisant des boites opérantes automatisées, nous pouvons récolter des milliers d’essais par animaux en une période courte, sans intervention de l’expérimentateur. Cette méthodologie permet de diminuer la variance comportementale par animal, obtenir des résultats très constants entre animaux et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les tests statistiques que nous utiliserons nous permettront d'obtenir des résultats fiables avec un nombre réduit d'animaux. Sur la base des calculs de puissance et de notre expertise, pour obtenir des résultats fiables dans le cadre de ce projet de 5 ans, nous devrons élever 1700 animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet proposé, pour chaque mesure expérimentale, des points limites sont établis pour éviter la souffrance et garantir le bien-être de l’animal. En plus, si les animaux, n’atteignent pas de point limites définis, ils seront tous conservés jusqu’à 240 jours au maximum. Les animaux soumis aux procédures comportementales vivront dans des boîtes automatisées qui nous permettent de mieux répondre aux critères des 3R en minimisant l'inconfort des animaux et en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérience puisque nous pouvons obtenir des résultats plus fiables par animal. Ces systèmes de cages fournissent un environnement enrichi pour les animaux où ils peuvent entreprendre des tâches comportementales à leur propre rythme. Les souris resteront dans ces boîtes en fonction du temps nécessaire à l'animal pour obtenir de bonnes performances dans la tâche, pour une période pouvant aller jusqu'à 4 mois. De plus, tout animal présentant des symptômes de stress élevé ou un manque de motivation lors de la tâche comportementale sera exclu du protocole et laissé en stabulation sous observation. En plus de cela, anesthésie et analgésie seront administrées à tous les animaux soumis à des procédures chirurgicales afin de minimiser leur douleur. Nous retiendrons et manipulerons les animaux de manière douce et appropriée pour injections rapides et réussies. Nous vérifierons également la zone injectée avant de remettre l'animal dans sa cage. L'ensemble de la procédure ne dure que quelques secondes.
Choix des espèces
Nous disposons de souris qui présentent des comportements compulsifs. En effet, les comportements répétitifs sont la marque de certains troubles neuropsychiatriques apparentés, ce qui offre une occasion unique d'explorer le mécanisme neurobiologique qui sous-tend leur régulation. Dans ces pathologies, l'incapacité de réguler l'expression des comportements appris a souvent des conséquences comportementales délétères. Nous proposons d'utiliser ces conditions pathologiques chez ce modèle rongeur pour mieux comprendre la neurophysiologie des comportements répétitifs et leur rôle dans l’adaptation comportementale. Pour notre étude nous utilisons un modèle murin de troubles obsessionnels compulsifs qui a nécessité des techniques de génie génétique. La pertinence de ce modèle n’a pas d’équivalent dans d’autres espèces. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes entre 12 et 36 semaines (3 à 6 mois). L’utilisation d’animaux relativement jeunes est justifiée puisque ce modèle murin présente des lésions cutanées (perte de poils, croûte, plaies) suite au toilettage compulsif, plus fréquemment après 6 mois. Cependant, indépendamment de l'âge, tout animal présentant des lésions cutanées sera exclu du protocole et traité.
Immunorégulation de la greffe de moelle osseuse par les cellules humaines NKT invariantes EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
264 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, parfois leucémiques, et développent une réaction du greffon contre l'hôte ou des tumeurs, pour évaluer un sous-type de lymphocytes censé limiter cette réaction. Le porteur indique que les souris présentent une perte de poids d'environ 20 %, des diarrhées et une altération de l'état général, et ne seront pas conservées au-delà de 80 jours. Sur le remplacement, il affirme que ce modèle murin est "indispensable" à toute étude préclinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle.
Objectifs
Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.
Procédures
Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.
Devenir
Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage de 500 cm2, dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température (22+/-1°C), de l'humidité (55 +/-10%), du cycle jour de 7h à 19h. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.
Choix des espèces
La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Production et implantation de mini foies 3D dans un modèle de souris présentant une maladie du foie (EU3/3)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
453 souris mâles "nude" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Rendues malades du foie par un agent toxique, elles subissent l'implantation chirurgicale d'un "mini foie" tridimensionnel dans la graisse abdominale, puis six à neuf prélèvements sanguins sous anesthésie, pour tester si ce dispositif restaure la fonction hépatique. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une douleur, une mauvaise cicatrisation, une éviscération et une perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire ne peut simuler l'implantation dans un organisme vivant et que le projet ne "peut pas se passer" d'un modèle animal.
Objectifs
Le fonctionnement du foie peut être altéré pour diverses raisons : toxiques, génétiques, virales, métaboliques. Le foie possède naturellement une capacité de régénération, cependant les dommages peuvent être irréversibles nécessitant alors une greffe de foie. Or, tous les patients n’y sont pas éligibles et il existe un problème majeur de pénurie de greffon. Nous proposons une stratégie visant à retarder voire éviter la nécessité d'une greffe de foie. Pour cela, nous nous baserons sur la capacité des cellules du foie à se multiplier et à régénérer son fonctionnement. A l’heure actuelle, il existe déjà une stratégie basée sur la transplantation de cellules du foie mais les foies atteints de cirrhoses sont trop altérés pour supporter cette transplantation et plus de 70% des cellules transférés ne survivent pas. C’est pourquoi nous voulons développer une stratégie novatrice basée sur la greffe d’un dispositif composé de cellules de foie au niveau d’un autre organe non touché par la maladie. Cette structure tridimensionnelle, comportant des cellules du foie saines, doit se brancher très rapidement à la circulation sanguine du greffé. Nous avons donc opté pour un tissu très riche en vaisseaux sanguins : l’épiploon (tissu graisseux localisé entre l’estomac et l’intestin). L’objectif de ce projet est de mettre au point le dispositif composé de cellules du foie saines, de l’implanter chez l’animal présentant une maladie chronique du foie et de vérifier que ce dernier se lie à la circulation sanguine de l’animal greffé pour permettre de restaurer un fonctionnement du foie normal. A long terme ce dispositif pourrait permettre d’éviter des greffes de foie et de pallier au manque de greffons.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait établir une preuve de concept. Il permettra - De définir les conditions de fabrication d’un mini foie tridimensionnel connecté à des vaisseaux sanguins, - D’évaluer le bénéfice et la stabilité́́ de ce mini foie chez des gens présentant une grave maladie du foie. Ce dispositif pourrait être appliqué dans de multiples indications pour aider le foie malade. Par exemple il serait utile pour prévenir la progression de la maladie du foie et pour éviter ou retarder la nécessité d’une greffe de foie.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. 1. Interventions chirurgicales : La durée sera environ de 30 minutes. Nous implanterons dans un tissu graisseux dans le ventre de l’animal, le mini foie 3D que nous auront préalablement créé. 2. Prélèvements sanguins : seront effectués 6 à 9 prélèvements sanguins. Pour surveiller l’activité du foie maladie et du mini foie 3D implanté. Les prélèvements seront réalisés chez un animal endormi (sous anesthésie générale). 3. Imagerie : Nous réaliserons des échographies chez les animaux ainsi qu’une imagerie fluorescente le jour de leur mise à mort. Cela dans le but de visualiser les vaisseaux sanguins.
Impact sur les animaux
1) Douleur après la chirurgie 2) Mauvaise cicatrisation de la peau, éviscération (=lâchage de la suture et sortie des organes en dehors du ventre) 3) Perte de poids due à l’administration de l’agent toxique. 4) L’anxiété est un effet indésirable attendu comme dans toute expérimentation animale.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever les structures implantées (mini foie) ainsi que le foie de la souris pour l’analyser.
Remplacement
Les méthodes de culture en laboratoire ne peuvent simuler l’action mécanique d’implantation dans un organisme vivant d’une structure 3D. Le processus d’implantation, de connexion aux vaisseaux de la souris et de l’éventuel aide au foie malade ne peut pas se passer d’un modèle animal expérimental fiable. En effet il n’est pas envisageable d’implanter ces structures chez l’être humain sans études fiables préliminaires chez l’animal. De plus l’analyse du foie nécessiterait de faire des prélèvements de foie de façon répétée au cours du temps, ce qui est trop risqué pour la santé des patients et donc difficilement concevable. La souris constitue une espèce animale dont les gènes sont proches de l’être humain, largement utilisé en science du foie et dont la taille est suffisante pour la réalisation de la chirurgie prévue.
Réduction
Dans une logique de réduction, le nombre de sujets nécessaire par groupe est proposé à partir d’un logiciel qui détermine le nombre d’animaux nécessaires pour avoir des résultats intéressants et interprétables. Nous réalisons des étapes préliminaires pour sélectionner la meilleure technique chirurgicale et la meilleure technique pour rendre le foie de la souris malade afin d’in fine utiliser le moins d’animaux possible. Nous prévoyons également des solutions de secours à utiliser uniquement si échec de certaines procédures. Les procédures seront réalisées par du personnel expérimenté : i) un chirurgien, formé à l’expérimentation animale en tant qu’applicateur de procédure et ii) un ingénieur en imagerie du petit animal habilitée à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Raffinement
L’environnement du rongeur est enrichi, il a un accès illimité à l’eau et la nourriture. Du personnel qualifié de l’animalerie lui rend visite quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées que 7 jours après réception des animaux pour diminuer leur stress lié au changement d’environnement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et médicaments contre la douleur. Ce médicament contre la douleur sera utilisé également après la chirurgie. Le bien-être de l’animal sera évalué par une analyse attentive du comportement de l’animal et réalisation d’un score. Ce score nous permettra de quantifier de dégré de souffrance et de mettre en place des stratégies adaptées. Nous avons déterminé différents points limites spécifiques à nos procédures basés sur une observation et une pesée quotidiennes des animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi, comme nous avons lus dans les articles scientifiques, d’étudier des souris mâles Nude (poids 20-25g) car leur statut de mâle leur confère une susceptibilité à développer une maladie chronique du foie. Leur statut d’animal immunodéprimé nous permet de pouvoir y implanter des structures cellulaires tridimensionnelles contenant des cellules humaines sans risquer un rejet de la part de l’hôte. Les souris possèdent un patrimoine génétique très proche de l’espèce humaine. Nous également choisi des souris mâles adultes de 6-8 semaines (20-25g ) car, selon la littérature, ils ne sont pas soumis aux variations hormonales des animaux en croissance ce qui pourrait interférer avec la capacité à accepter le greffon et à y apporter des vaisseaux du fait des stades de développement différent, de vitesses de croissance différentes ou du poids trop faible. Du fait de la durée prévisible de 14 semaines pour induire une maladie du foie, les implantations seront réalisées aux alentours de 20 semaines.
Evaluation de peptides anti-cancéreux dans des modèles de cancer mammaire triple négatif chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
200 souris "nude" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple négatif dans le flanc et la glande mammaire, puis des injections de peptides trois fois par semaine pendant trois semaines, pour évaluer l'effet anti-tumoral de ces molécules. Le porteur indique qu'une perte de poids et une gêne à la locomotion liée au volume tumoral peuvent survenir. Sur le remplacement, il affirme n'avoir "pas d'autres choix" que le modèle animal, la culture in vitro ne recréant pas l'environnement tumoral.
Objectifs
Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu’une protéine de la matrice extracellulaire est surexprimée et sécrétée par les cellules cancéreuses au sein du microenvironnement tumoral sous une forme immature. Cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, cancer le plus fréquent chez les femmes en France, ce qui en fait une cible thérapeutique d’intérêt et notamment dans le cancer du sein triple négatif, un sous type pour lequel la plupart des stratégies thérapeutiques proposées sont déficientes. Il a été montré qu’une accumulation anormale de cette protéine stimule la prolifération des fibroblastes (cellules saines autour de la tumeur) qui vont à leur tour stimuler et entrainer la multiplication des cellules cancéreuses. C’est donc dans ce contexte que différents peptides ont été synthétisés afin de répondre à un besoin thérapeutique non satisfait notamment dans le cancer du sein triple négatif (TNBC). Ce projet permettra de déterminer l’effet anti-tumoral des différents peptides développés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus par ce traitement sont une diminution de la croissance tumorale liée à une diminution de la prolifération fibroblastique. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée aux peptides dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo.
Procédures
- Injection de cellules tumorales au niveau du flanc droit (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de traitement par voie intra-péritonéale, 3 fois par semaine pendant 3 semaines (2 min) - Identification des souris par tatouage au niveau des oreilles (durée moins d’une minute – 1 fois)
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être observée suite à l’injection des cellules tumorales et doit être prise en considération. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral ainsi qu’à la localisation de la tumeur peut être observée.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de limiter la douleur et/ou l’inconfort liés au développement des tumeurs.
Remplacement
Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des peptides « LBC ».
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.
Raffinement
Une observation à raison de trois fois par semaine des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance trois fois par semaine). En ce qui concerne les souris nude, elles seront hébergées dans des cages homologuées sur portoir ventilé, dans une litière en cellulose. Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.
Choix des espèces
Les cellules MDA-MB-231 et Hs578T sont des lignées de cancer mammaire triple négatif humain. Des souris Balb/c nude (immunité réduite) seront donc utilisées pour l’injection de ces cellules afin qu’elles ne soient pas rejetées par le système immunitaire et qu’une tumeur puisse se développer. Des travaux antérieurs ont été réalisés sur ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. La protéine étudiée est la même chez l’Homme et chez la souris. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusqu’à environ 1 an chez la souris).