Souris

300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des animaux sains, soumis à des examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer jusqu'à trois heures avec injection d'un agent de contraste, uniquement pour mettre au point des séquences d'imagerie. Le porteur indique que l'anesthésie provoque hypothermie, dépression respiratoire et cardiovasculaire, et présente pourtant l'IRM comme "en parfaite adéquation avec les 3R". Ces animaux sains sont tués à l'issue, jugés non réutilisables du fait de leur âge et des anesthésies répétées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point, optimiser et développer de nouvelles méthodes d’imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'offrir le plus grand panel d'outil pour la caractérisation, la recherche de biomarqueurs de pathologies. L’IRM, technique d’imagerie biomédicale en perpétuelle évolution, est extrêmement attractive pour les études précliniques et cliniques. Elle est non invasive et non irradiante en parfaite adéquation avec les 3Rs. Elle permet : 1) de remplacer l’utilisation de techniques plus invasives pour l’obtention d’information similaire ; 2) d’avoir des informations anatomo-fonctionnelles complémentaires et/ou inaccessibles par d’autres techniques dans des conditions de bien-être animal sans comparaison. Ces nouvelles informations peuvent être intégrées dans une étude pour la raffiner comme nouveau critère d’inclusion ou d’exclusion. Cela permet d’obtenir une meilleure qualité des résultats qui n’auront pas besoins d’être répétés, réduisant ainsi le nombre d’animaux; 3) un suivi longitudinal individuel des modifications anatomo-fonctionnelles permettant ainsi de réduire très significativement le nombre d’animaux nécessaires ; 4) d’avoir accès à des informations déjà utilisées chez l’homme quotidiennement dans les services hospitaliers, permettant de développer des projets de recherche translationnelle.

Bénéfices attendus

L’IRM est une technique d’imagerie biomédicale non-invasive et non irradiante largement utilisée chez l’Homme. Son utilisation dans les projets précliniques permet de remplacer des techniques plus invasives, de réduire le nombre d’animaux avec des suivis longitudinaux, de raffiner en donnant accès à de nouveaux points limites précoces.

Procédures

Examen IRM sous anesthésie d'une durée maximum de 3h. Injection d'agent de contraste sous anesthésie (durée du geste 1 min max.).

Impact sur les animaux

L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire.

Devenir

Dans la mesure du possible, afin de respecter la règle des 3Rs, les animaux de ce projet seront des animaux sains de réforme non au-préalable utilisés dans un autre projet. Ne pouvant pas être réutilisés au-delà de ce projet du fait souvent de leur âge (animaux de réforme), la répétition de l'anesthésie et surtout la présence d'agent de contraste, ils seront mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Des objets tests seront utilisés autant que possible pour limiter l’utilisation des animaux vivants. Malheureusement, à l’heure actuelle, aucun ne reproduit le tissu vivant et les contraintes pour l’IRM de ce dernier (mouvement respiratoire, cardiovasculaire, flux sanguin, hétérogénéité des tissus…). De ce fait, nous sommes contraints de valider nos paramètres sur des animaux vivants.

Réduction

Plusieurs stratégies vont être utilisées pour limiter au maximum le nombre d’animaux dans ce projet consistant à la mise au point de protocole : l’utilisation d’objet test, le passage à l’IRM à plusieurs reprises du même animal et, dans la mesure du possible, nous utiliserons des animaux de réformes.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et monitorés durant les examens IRM et pour les injections limitant ainsi la douleur. Ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, élément pour nidification, baton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation. Des points limites ont été définis et adaptés par procédure.

Choix des espèces

L’IRM préclinique est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. Le rongeur (souris, rat) est depuis toujours le modèle de prédilection pour la recherche biomédicale, par sa taille, son coût, sa manipulation aisée et son taux élevé de reproduction. Il est utilisé comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Les organes ayant des tailles et des caractéristiques à l’IRM différentes au cours du développement, les animaux sains utilisés seront à différents stade de développement allant de quelques jours après la naissance à l’état adulte.

1 040 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules de cancers du sang humains par la veine ou sous la peau, puis des injections dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant trois à six semaines, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids, et que les injections répétées peuvent irriter le site et y provoquer une douleur. Il affirme l'animal "indispensable" pour étudier l'effet des molécules sur un organisme entier, quatre peptides ayant d'abord été sélectionnés in vitro.

Objectifs

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par leur capacité à échapper au processus de mort cellulaire programmé. Pour résister à la mort cellulaire, elles inhibent les mécanismes de mort, augmentent l'action des facteurs de survie ou effectuent ces deux actions simultanément. Nos travaux ont montré que la protéine de survie AAC-11, conférait aux cellules cancéreuses une résistance aux agents thérapeutiques. Cette protéine pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante, en particulier dans les cancers du sang, dans lesquels AAC-11 est fortement exprimée. Nous avons développé et optimisé une série de petites molécules capables d’empêcher l’action protectrice de cette protéine in vitro. Il est maintenant nécessaire de poursuivre l’évaluation de ces petites molécules en tant qu’agents thérapeutiques à l’aide de modèles animaux pour différents types de cancer du sang. Nous utiliserons en particulier des modèles de lymphome de Burkitt, myélome multiple et leucémie lymphoïde chronique, qui sont des modèles de cancers du sang dans lesquelles nos petites molécules semblent particulièrement efficaces dans nos tests in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre l’évaluation de petites molécules ayant un potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers du sang. En raison de la stratégie originale mise en place pour développer ces molécules et sur leur mode d’action, les bénéfices de ce projet à long terme seraient de proposer une alternative thérapeutique efficace et mieux tolérée par les patients les plus fragiles car ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons dans un premier temps une étape de mise en place des modèles en injectant les cellules tumorales soit dans la veine de la queue soit sous la peau (au niveau d'un flanc) dans deux types de souris présentant un système immunitaire défectueux (l'absence de système immunitaire chez ces souris leur permet d'accepter la greffe de cellules d'origine humaine). L'injection dans la veine de la queue est réalisée sur souris éveillées et dure 30 secondes. L'injection sous la peau se fait sous anesthésie généralegazeuse et dure environ 2 min. Le développement de la tumeur sera suivi soit par prélèvement sanguin à la veine de la joue (une fois par semaine sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes) soit par la mesure de la tumeur lorsque celle-ci est apparente (mesure au pied à coulisse sur souris éveillée, d’une durée de 30 secondes, ou par imagerie in vivo par bioluminescence lorsque les lignées tumorales expriment le gène de la luciférase seront utilisées. L'acquisition par IVIS sera réalisée sur des souris placées dans une chambre d’analyse équipée d’un plateau chauffant (37°C), d’un système d’anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pour l’induction puis 1,5-2% pour la suite de la procédure) et d’une caméra permettant la mesure de la bioluminescence émise par les cellules tumorales. La durée maximale d’acquisition des données de bioluminescence sera de 20 min. Après avoir déterminer la meilleure lignée de souris pour les différents types de cancer, nous évaluerons l'effet thérapeutique de nos petites molécules. Quel que soit le modèle de cancer utilisé (injection des cellules tumorales dans la veine de la queue ou sous la peau), le protocole thérapeutique consistera à injecter les petites molécules dans l’abdomen des souris éveillées 5 jours par semaine pendant 3 à 6 semaines. Le suivi impliquera des prélèvements de sang hebdomadaire sur toute la durée du protocole (modèles avec injection des cellules dans le sang) ou une mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse ou par imagerie in vivo par bioluminescence lorsque celle-ci est apparente.

Impact sur les animaux

L’injection des petites molécules thérapeutiques dans l'abdomen peut entrainer un stress une douleur avec possible risque d'irritation au site d’injection en particulier lorsque celle-ci sera répétée dans le temps (1 fois par jour, 5 jours/semaine, pendant 3 à 6 semaines). Comme tous les médicaments qui doivent entrainer la mort de certaines cellules, ils sont susceptibles d’avoir des effets indésirables sur le bien-être (perte de poids, diarrhée). La mise en place des différents modèles de cancer implique des injections. Dans le cas des injections sous la peau au niveau du flanc, nous pourrons observer dans le temps un inconfort lié à la croissance de la tumeur (gène dans la locomotion des souris). L’injection dans le sang des cellules tumorales pourra également conduire à une douleur de l’animal au cours du temps (développement de la pathologie) avec apparition d’une paralysie des membres inférieurs notamment et/ou perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront générer un stress transitoire de l’animal lié à sa manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser de manière la plus exhaustive possible l’effet thérapeutiques des petites molécules (prélèvement du sang, des organes et des tissus cancéreux). Dans tous les cas, l’euthanasie se fera au bout de 6 mois maximum ou de manière anticipée en cas d'atteinte de points limites prédictifs et précoces.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Il est a noté que les 4 peptides testés ont été sélectionnés par des études in vitro préalables.

Réduction

Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Deux fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi en cas dès les premiers signes de soufffrance suivi par l'euthanasie des animaux.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère pour laquelle de nombreux modèles de cancer sont déjà bien caractérisés. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes car les modèles de cancers sont bien établis dans ces conditions.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales sur le flanc et deux à trois injections sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leurs tissus. Le porteur indique que les injections causent un inconfort transitoire et que la tumeur peut provoquer une gêne modérée. Il cherche à confirmer in vivo l'effet du Déruxtécan sur le système immunitaire, jugeant l'étude impossible autrement que dans un "organisme entier", pour élargir l'usage de deux anticorps déjà en essai clinique.

Objectifs

La recherche et l’innovation évoluant constamment, nous arrivons à développer des traitements contre les cancers de plus en plus performants. C’est dans ce cadre-là que notre projet s’inscrit. Nous travaillons sur un type de traitement en particulier : les anticorps conjugués aux médicaments. Ce sont des traitements anticancéreux ciblés qui délivrent une chimiothérapie cytotoxique aux cellules cancéreuses via un agent de liaison attaché à un anticorps qui se lie à une cible spécifique exprimée sur les cellules cancéreuses. Il a été montré in vitro que les traitements que nous souhaitons tester, activaient la mort cellulaire immunogène. Nous souhaitons, à présent, vérifier in vivo que l’agent cytotoxique est responsable de cette activation de la mort immunogène et voir ses effets sur la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations nous permettront de confirmer dans un modèle préclinique les effets anti-tumoraux du Déruxtécan via l’activation du système immunitaire , ce qui permettra d’élargir le champ d’action de deux nouveaux anticorps conjugués aux médicaments, en cours d’essai clinique.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront 2 ou 3 injections, d'une durée d'1 minute chacune, sous anesthésie générale ou locale suivant les injections.

Impact sur les animaux

Les injections entraineront des inconforts transitoires et limités. Les animaux recevront des cellules tumorales qui pourront croître et provoquer une gêne modérée sur le flanc.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les laisser en vie à la fin de la procédure. De plus, des tissus et cellules seront analysées post-mortem.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’existe pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’effet anti-tumoral d’anticorps conjugués au médicament via l’activation du système immunitaire. En effet, cette étude qui implique le système immunitaire nécessite un oganisme entier (cellules et cytokines circulantes).

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale dépendamment de l'intervention à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués

Choix des espèces

La souris possède un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à l’homme. En outre, sa petite taille permet d’héberger un grand nombre d’animaux en même temps et permet donc de réaliser des analyses statistiques valables des résultats obtenus. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux sont utilisés au stade adulte (environ 7-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire complet et fonctionnel.

23 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale, pour certaines une prodrogue par voie veineuse et un prélèvement à la jugulaire, puis un suivi par imagerie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les mouvements et provoquer un amaigrissement, l'étude devant s'arrêter au seuil de taille tumorale fixé. Il précise que les molécules ont d'abord été testées in vitro mais juge ces données insuffisantes pour prédire leur distribution dans un organisme.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les propriétés pharmacocinétiques d'un nouvel agent thérapeutique dans le domaine de l'oncologie préclinique. Cet agent se compose de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=6 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=6 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsqusie les tumeurs auront atteignent la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués. En cas d’observation d’effet secondaire lié à l’administration du traceur ou de la prodrogue, l’étude sera stoppée.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de différents tests statistiques. Cela donne un total de 18 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus, des animaux résiduels seront également ajoutés comme décrit dans le paragraphe 3.4.10.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux avec de petits volumes tumoraux. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

5 236 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent neuf tests comportementaux moteurs (activité locomotrice, coordination, force d'agrippement, anxiété), jusqu'à quatre injections et une chirurgie cérébrale sous anesthésie, certaines lignées mutantes voyant environ 30 % des souriceaux mourir avant l'âge adulte. Le porteur étudie des formes génétiques de dystonie qu'il qualifie lui-même de rares, tout en mobilisant plus de cinq mille souris. Il reconnaît l'existence de modèles cellulaires et informatiques mais affirme qu'ils ne peuvent "pas encore se passer" de l'expérimentation animale, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La dystonie est un trouble moteur caractérisé par des contractions musculaires pathologiques, provoquant des postures et/ou des mouvements anormaux, qui sont très handicapants et douloureux dans les formes graves. Les possibilités de traitements médicaux restent limitées, parce que les mécanismes physiopathologiques de cette maladie sont encore mal connus. Des altérations des voies de signalisation impliquant l’adénosine monophosphate (AMP) cyclique dans les neurones du striatum sont associées à différentes formes génétiques de dystonies. Le but de notre travail est d’utiliser des modèles de souris porteuses de mutations dans les mêmes gènes que ceux impliqués dans certaines formes de dystonies. L’objectif scientifique est de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de ces maladies. Le projet consiste à caractériser les déficits moteurs et comportementaux ainsi que les altérations du fonctionnement neuronal chez les souris mutantes. De plus, nous étudierons les effets de certaines molécules pharmacologiques chez les souris mutantes, notamment dans l’espoir de trouver des médicaments capables de réduire des déficits moteurs à l’origine de la dystonie. Bien que les formes de maladies étudiées soient rares, notre étude pourrait suggérer des pistes pour améliorer les traitements des dystonies en général et d’autres troubles des mouvements.

Bénéfices attendus

Le projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie des dystonies. Nous chercherons à trouver des traitements pharmacologiques susceptibles de réduire les troubles moteurs détectés dans les souris mutantes. En cas d’effets bénéfiques, les molécules actives constitueraient de nouvelles pistes thérapeutiques pour soigner les dystonies avec des retombées à long terme en médecine humaine.

Procédures

- 9 tests du comportement moteur : activité locomotrice (sessions de 5 min à 32 h, au maximum 11 sessions espacées d’au moins 24 h pour un animal), coordination motrice et son apprentissage (sessions de 5 min en général, au maximum 7 sessions espacées de 5 min par jour, pendant 7 jours), force d’agrippement (maximum 6 tests de quelques secondes, espacés de 30 min), et anxiété (session journalière de 30 min à 5 min selon les tests, durant au maximum 7 jours) - Au maximum 4 injections intra-péritonéales (30 s) ou orales (30 s) d’agents pharmacologiques et même nombre d’injections des solvants utilisés pour dissoudre les agents - 1 chirurgie cérébrale sur animal sous anesthésie et analgésie pendant 30 min - Elevage de souris mutantes avec un phénotype dommageable (maximum pendant 6 mois) - En fin de procédure, euthanasie de tous les animaux par différentes méthodes en fonction du type de prélèvements et d’analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

L’étude du comportement moteur des souris correspond à des tests assez simples (procédures d’une durée variant entre 32 h et 10 s) qui n’induisent aucune douleur, seulement un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test. Le projet comprend plusieurs injections d’agents pharmacologiques, espacées dans le temps, sur le même animal. Les agents pharmacologiques utilisés provoquent des changements comportementaux marqués pendant un temps limité (1 à 2 h), mais ne stimulent pas directement la douleur. Certaines nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Dans une lignée de souris mutantes nécessaire au projet, une létalité anormale a été observée dans environ 30% des souriceaux présentant un type de mutations particulières, entre 10 et 30 jours après la naissance. Ils présentaient un arrêt de la croissance alors que les autres souriceaux avec les mêmes mutations atteignaient l’âge adulte après un développement apparemment normal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des analyses biochimiques, histologiques et physiologiques

Remplacement

Nous étudions des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles et donc l’expérimentation sur l’animal. Notre projet propose de disséquer les conséquences des mutations d’ADCY5 et de GNAL sur le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le projet utilisera des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et des études comportementales sur l’animal vivant. Certains mécanismes cellulaires peuvent cependant être étudiés sur des cellules en culture. Des modèles mathématiques et computationnels ont été développés pour comprendre les mécanismes neuronaux que nous étudions. Cependant, nos connaissances sur les processus neurobiologiques sont limitées et les modèles in silico ne peuvent pas encore se passer de validations avec de l’expérimentation animale. Cependant, nous nous efforçons, autant que possible, d’évaluer nos approches et d’adapter nos expériences en fonction du développement des modèles computationnels ou en culture cellulaire.

Réduction

Nous chercherons à réduire le plus possible la variabilité expérimentale par des protocoles expérimentaux rigoureux et par l’utilisation de groupes d’animaux le plus stables possibles en termes génétiques et d’hébergement. Le fond génétique des souris correspondra à des lignées consanguines, et donc par définition présentant une variabilité génétique minime. De plus les groupes de souris avec les différents génotypes seront issus des mêmes portées. Au cas où les différences de genre s’avéraient ne pas présenter d’interactions significatives avec les effets des différentes mutations, nous utiliserions dans la suite de l’étude des groupes mixtes, permettant de limiter le nombre de souris d’un sexe non utilisables pour les expériences. Le nombre total d’animaux impliqués dans le projet est de 5236 souris au maximum dont 5058 dans les procédures expérimentales proprement dites et 178 souris avec un phénotype dommageable qui mourront avant leur utilisation dans les expériences. En effet, dans une lignée, au maximum 712 souris avec un génotype potentiellement dommageable seront produites, 534 incluses dans les procédures expérimentales et 178 non utilisables. D’une façon générale, les résultats seront analysés et interprétés grâce à des méthodes statistiques rigoureuses et éprouvées. La taille des groupes d’animaux inclus dans les expériences est estimée en se basant des travaux précédents. 10 animaux par groupe seront en général suffisants pour dégager des effets significatifs du point de vue statistique dans les tests comportementaux envisagés.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus au maximum et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement. Pour ces études, il existe de nombreux tests comportementaux qui sont développés chez la souris. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et elle est déjà utilisée dans des modèles de mouvements anormaux hyperkinétiques, particulièrement pertinents dans l’étude des pathologies étudiées ici. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et des humains. Cela en fait ainsi un modèle particulièrement utile à l’étude d’une maladie striatale, telle que les mouvements anormaux liés aux mutations des gènes que nous étudierons. Expériences chez des animaux adultes femelles et mâles. Les animaux utilisés seront adultes avec un âge supérieur à 8 semaines. Le projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux qui sont observés à l’âge adulte même si les symptômes apparaissent très souvent dès le plus jeune âge. C’est pourquoi, nous n’étudierons que des animaux adultes dans le cadre de ce projet. De plus, les femmes et les hommes peuvent être affectés par les maladies étudiées et c’est la raison pour laquelle des souris femelles et mâles seront incluses dans l’étude.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras pendant dix semaines pour provoquer obésité et diabète, et toutes reçoivent jusqu'à vingt-deux injections sous anesthésie locale et une dizaine de prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur cherche à neutraliser une protéine pour traiter la prise de poids provoquée par un médicament de la schizophrénie. Il affirme l'usage d'animaux vivants "indispensable", l'appétit et le comportement alimentaire étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Le médicament étudié est utilisé pour le traitement de la schizophrénie. Contrairement à d’autres molécules, ce produit ne provoque pas d'effets secondaires notables. Cependant, le traitement par ce médicament a été associé à des augmentations de poids cliniquement significatives et à l’induction du diabète. Il a récemment été découvert qu'une protéine libérée par les cellules et les organes agit comme un stimulateur. L'augmentation systémique de cette protéine augmente de manière extracellulaire l'apport alimentaire, réduit la glycémie et favorise la génération de graisses au niveau systémique. La neutralisation de cette protéine apparaît comme une cible d'intérêt dans la lutte contre l'obésité, du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de cette étude expérimentale est de déterminer si la neutralisation de cette protéine peut traiter l'obésité induite par le médicament étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie thérapeutique dans des modèles précliniques pour prévenir ou traiter l'obésité induite par certains médicaments.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections (pour un groupe 22 injections (sur 11 semaines), pour un un groupe 4, et pour un groupe 5 injections, durée 1 minute, sous anesthésie locale). La moitié des souris sera soumise à des régimes riches en gras pendant 10 semaines. Tous les animaux seront soumis à 10 micro-prélèvements de sang (durée 1min) et à 1 prélèvement de sang plus important en fin de procédure (durée 2min, sous anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les régimes riches en gras induisent une prise de poids et peuvent être obésogènes et induire le diabète. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort local et transitoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, leur score sera déterminé, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antiinflammatoire non stéroïdien (metacam). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour le projet proposé, la physiologie et la génétique de la souris sont suffisament proches de celles de l'être humain pour pouvoir tirer des conclusions valides des procédures envisagées. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales puis un transfert de cellules par voie rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyser les cellules immunitaires de la tumeur. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les mouvements, réduire le toilettage et modifier le comportement social des souris. Il annonce une "ambition" de thérapie innovante ciblant une protéine des cellules immunitaires, en reconnaissant que l'effet anti-tumoral reste une hypothèse à valider.

Objectifs

La prise en charge thérapeutique des maladies cancéreuses reste un problème majeur de santé. Malgré des progrès significatifs dont des stratégies de détection précoce, les traitements afin d’améliorer la qualité et l’espérance de vie reste globalement en dessous des attentes. Les protocoles thérapeutiques ciblant les cellules tumorales consistent pour la plupart à l’utilisation de la chimiothérapie intervenant sur la prolifération cellulaire incontrôlée. Il en résulte une importante exposition des cellules saines à ces substances cytotoxiques, avec pour conséquence une toxicité importante à court terme et une réelle implication à moyen terme dans le développement d'autres tumeurs ou "récidives". Les récentes études ciblant de nouvelles approches thérapeutiques se sont intéressées au microenvironnement tumoral. La compréhension des processus immunitaires du microenvironnement tumoral permet l'identification de nouveaux acteurs jouant un rôle fondamental dans la genèse, la communication (interactions cellules-cellules) , le développement et la possibilité de récidive de la tumeur. Les tétraspanines (Tspans) font partie de ces nouveaux acteurs. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux tels que la migration, la communication, l'adhésion, la fusion ainsi que la formation de vésicules extracellulaires(EVs). Ce sont des marqueurs significatifs dans un grand nombre de cancers, tels que les cancers du sein, des ovaires ou de la prostate, ce qui en font de potentielles cibles thérapeutiques. La tétraspanine 29 ( Tspan29) ou CD9 est une molécule largement présente sur lescellules B régulatrices (Bregs), dont le rôle fondamental a été démontré dans le développement et la propagation du processus tumoral. Bloquer spécifiquement cette cible sur ces cellules devrait permettre de bloquer le processus tumoral à plusieurs niveaux. L’objectif de ce projet est d’étudier la tétraspanine 29 (Tspan29) ou CD9 comme cible potentielle sur les Bregs en émettant l’hypothèse qu’une action ciblée conduirait à une réduction de la progression tumorale.Plusieurs molécules visant spécifiquement le CD9 ont été identifiées en amont et seront testés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de contribuer à mieux caractériser le rôle des Bregs dans le cancer et l’intérêt de l’utilisation de bloqueurs des Tspans dans la genèse, la prolifération, la dissémination et la communication des cellules tumorales. Nous supposons qu’une action ciblée sur la molécule CD9 permettra de bloquer ou modifier les fonctions suppressives des Bregs CD9 et de leurs vésicules ce qui aura un effet bénéfique sur le cancer. Ainsi notre étude permettra d’aboutir à la sélection du ou des candidats permettant la meilleur inhibition de la molécule CD9 avec un effet anti-tumoral francs. Notre ambition est de développer et de proposer une approche innovante de la thérapie du cancer qui prenne en compte le microenvironnement de la cellule cancéreuse, notamment les Bregs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une phase d'induction du modèle tumoral par injection en sous-cutané de cellules tumorales une seule fois. Puis une semaine après l'injection des cellules tumorales, un transfert adoptif de cellules par voie retro-orbitaire sera effectué une seule fois pour chaque souris. Les animaux ne seront pas soumis à d'autres actes, ni de prélèvements durant la phase d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Pour tous protocoles avec un modèle tumoral, les animaux peuvent éprouver des effets indésirables : Un effet sur la mobilité de la souris ou une gêne dûe aux tumeurs sous-cutanées. Une diminution du toilettage avec l’apparition des tumeurs. Une perte de poids. Une modification du comportement social avec l’apparition des tumeurs.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure seront euthanasiés à la fin de celle-ci afin d'identifier les cellules immunitaires infiltrants les tumeurs et analyser les cellules spléniques en complément des données des mesures tumorales.

Remplacement

Dans nos premières phases de tests de caractérisation, les tests sur les animaux seront remplacés par des tests in-vitro sur cellules humaines. Néanmoins pour la suite du projet, l’animal reste essentiel afin de prendre en compte les interactions dans le microenvironnement et valider l’effet anti-tumoral in-vivo.

Réduction

Notre projet s’inscrit dans une démarche de la réduction du nombre d’animaux au cours des différentes phases. Nos collaborateurs synthétiseront de nombreux inhibiteurs qui pourraient nécessiter un nombre conséquent d’animaux. Néanmoins nous avons fait le choix de sélectionner que 8 inhibiteurs présentant l’interaction la plus efficace avec le CD9. De plus les molécules sélectionnées poursuivront une phase de caractérisation et validation in-vitro qui pourrait conduire en fonction des résultats à une diminution du nombre de molécules à tester in-vivo et donc du nombre d’animaux nécessaires. Les groupes seront constitués de 6 animaux par conditions (cf tableau) permettant une approche statistique pertinente. Nous opterons pour une répétabilité (triplicate) par expérimentation afin d’éliminer des biais potentiels, néanmoins celle-ci pourrait être réduite à 2 en l’absence de biais.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnant à base de frisure de papier kraft sera mis dans les cages des animaux. Si des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation des souris pourraient être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme pour les souris isolés ou en binôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les animaux associeront ce stimulus sonore à une manipulation à venir. Notre expérimentation sera basée sur des études préliminaires afin de déterminer le nombre de cellules à injecter permettant un développement tumoral avec un moindre impact sur le bien-être des souris. Des points limites seront définis afin d’éviter la détresse et la douleur lors de l’expérimentation. Un système de suivi avec un score sera mis en place (cf annexe). Celui-ci tiendra compte de différents signes cliniques. La mesure tumorale sera effectuée tous les deux jours 1 semaine après l’injection des cellules tumorale et le critère du volume tumoral sera un point limite permettant l’arrêt de l’expérimentation si celui-ci dépasse la valeur définie.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés avec de nombreuses données dans la littérature. Ce modèle tumoral étant déjà utilisé et référencé chez le rongeur, la mise au point n’est pas nécessaire. Le choix des espèces et souches est basé sur les études existantes. Les souris seront utilisées entre 6 semaines-8 semaines de vie en conformité aux articles de référence.