Souris

1 200 rongeurs, 1 080 souris et 120 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections de molécules et des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour analyser la distribution des produits dans leurs organes. Le porteur présente ces actes comme des prestations de service facturées à des clients, qui définissent eux-mêmes le protocole et l'espèce, la plateforme réalisant l'imagerie sur les modèles fournis. Il affirme que les études in vitro ne peuvent représenter à elles seules "la complexité du vivant" et justifie ainsi le recours à l'animal pour valider les molécules de ses partenaires.

Objectifs

De nos jours, de nombreux laboratoires de recherche publics et privés sont fortement intéressés par des prestations en imagerie chez le rongeur dans le domaine de l’oncologie afin de développer des nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie in vivo qui permettraient d’améliorer le diagnostic ou le suivi de la réponse thérapeutique à terme chez des patients atteints de cancers. Notre plateforme spécialisée dans l’imagerie in vivo propose la réalisation de ce type prestations grâce à des équipements dédiés à l’imagerie du petit animal : scanner à rayons X, imageur optique (bioluminescence et fluorescence in vivo), imagerie radioactive en tomographie par émission de positions (TEP) et tomographie par émission mono-photonique (TEMP), ceci sur des animaux sains et des modèles animaux de diverses pathologies, dont les cancers.

Bénéfices attendus

La réalisation des prestations de service permet de faire avancer la recherche de nos partenaires et clients dans le domaine de l’imagerie et de l’oncologie. Il s’agit notamment de valider l’utilisation molécules capable de mettre en évidence, de façon non invasive par imagerie in vivo, certaines caractéristiques des tumeurs ; ceci dans le but de mieux identifier les cancers et pouvoir suivre leurs réponses à la thérapie.

Procédures

Les animaux seront soumis : - à une injection de cellules tumorales en sous-cutané réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats et souris) - durée environ 5 min. - à une injection d'une molécule d'intéret en imagerie in vivo en intraveineuse, intrapéritonéal ou intra-tumoral - réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats) ou sur animaux vigiles (souris) - durée environ 1-2min. Si besoin les injections pourront être répétées dans le temps à raison d'une injection/j maximum. - ou à une injection d'une molécule d'intéret en imagerie in vivo en intraveineuse via un cathéter inséré dans la veine caudale- réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats et souris) - durée environ 5 min. - éventuellement (si cela est nécessaire et demandé par le client) à un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (rats) ou en rétro-orbitaire (souris) - réalisé sous anesthésie gazeuse - durée environ 1-2min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux différentes séries d’injections et de prélèvement réalisées sur les animaux vigiles ainsi que le stress pouvant survenir lors de l'anesthésie pour les imageries.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études de biodistribution ex vivo.

Remplacement

Les études ex vivo ou in vitro ne peuvent représenter à elles-seules la complexité du vivant. Pour l’étude du devenir de molécules à visées diagnostique et/ou thérapeutique, la physiologie globale de l’individu, son métabolisme entrent en jeu. La biodistribution de radiotraceurs ou d’agents de contraste requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés et l’imagerie fonctionnelle de tumeurs ou d’un organe particulier requiert leur fonctionnement à l’échelle de l’individu.

Réduction

Pour chaque projet, le design de l’étude est discuté et mis en place conjointement par le client et le personnel en charge en charge de la prestation dont plusieurs membres font partie du comité d’éthique local et de la Structure Bien Etre Animal de l’établissement et apportent un regard expert sur l’étude. Cet échange permet d’identifier les points pouvant être raffinés tels que le double emploi injustifié d’animaux, des procédures répétées injustifiées ou un nombre d’animaux inapproprié. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Leur nombre est calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Les procédures d’imagerie présentent l’avantage de permettre le suivi d’un même animal dans le temps et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la validation d’une étude.

Raffinement

Les modèles animaux choisis par nos clients sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine ou pour l’expression d’une cible donnée. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela, les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale est déterminé par le client compétent dans le domaine et après une étude de la littérature scientifique sur le sujet afin de modéliser au mieux la pathologie à étudier. 90% des études réalisées sur notre plateforme sont réalisées sur des souris (modèles syngéniques ou xénogreffes de cellules cancéreuses). Les 10% restant sur des rats (modèles syngéniques). En accord avec la littérature scientifique dans le domaine, les animaux utilisés seront à l’âge adulte.

539 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de greffe tumorale sous-cutanée, trois injections et trois prélèvements sanguins sous anesthésie, avec un suivi par imagerie, pour étudier la distribution de nanoparticules lipidiques censées cibler les cellules cancéreuses. Le porteur signale un inconfort modéré après la chirurgie et un risque de nécrose des tumeurs. Les retombées annoncées, une avancée majeure contre le cancer, restent renvoyées à la recherche clinique future, et le porteur juge le recours à l'animal "incontournable" pour reproduire la complexité de l'organisme entier.

Objectifs

On observe depuis une dizaine d’années un nombre croissant d’applications médicales utilisant des médicaments à base d’acides nucléique. Ces petits fragments d’ADN ou d’ARN ont la capacité de moduler l’expression des gènes et offrent de nouvelles perspectives pour le traitement de certaines pathologies comme le cancer. Malheureusement, à ce jour les champs d’applications sont encore restreints du fait de la difficulté à transporter ces acides nucléiques jusqu’à leur cible cellulaire. Leur faible capacité à circuler dans l’organisme et à atteindre leur cible sans subir de dégradation est un frein majeur à leur développement. Les nanoparticules lipidiques sont l’un des systèmes d’administration pharmaceutique les plus utilisés dans le secteur pharmaceutique. Ce sont des vecteurs efficaces pour transporter différents types de traitements, notamment les acides nucléiques. L’application la plus récente est celle de la vaccination avec les vaccins anti COVID 19 à base d’ARN messager. Cependant, les LNP administrées par voie sanguine vont se stocker majoritairement dans le foie. Notre objectif est de développer de nouvelles particules lipidiques capable de cibler les cellules cancéreuses où elles pourront délivrer leur chargement thérapeutique en acides nucléiques.

Bénéfices attendus

La mise au point de nanoparticules lipidiques chargées en acides nucléiques ciblant les cellules cancéreuses serait une avancée majeure dans le traitement des cancers car elle permettrait d’exploiter le formidable potentiel thérapeutique de cette classe thérapeutique. Les applications des acides nucléiques sont encore limitées au traitement des maladies hépatiques et en vaccination et trouver le moyen de les transporter jusqu’aux tumeurs permettrait d’ouvrir un nouveau pan de recherche clinique.

Procédures

Les souris subiront sous anesthésie générale une petite chirurgie sous-cutanée pour induire une tumeur qui durera 10 minutes. et 3 injections d’une durée de 2 minutes. Trois prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale d’une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort modéré et transitoire après la chirurgie (pendant 1 à 2 jours). Un risque de nécrose des tumeurs est possible et à surveiller.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à l’issue des procédures pour des analyses complémentaires sur les tisssus et les cellules.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le devenir in vivo de nos nanoparticules lipidiques et plus particulièrement le ciblage des cellules cancéreuses. Les interactions multiples entre les nanoparticules lipidiques, les protéines plasmatiques, le passage dans les différents organes (notamment le foie) et l’action du système immunitaire ne sont pas encore modélisables in silico. Le recours à l’animal est donc incontournable pour reproduire cette complexité et évaluer correctement la distribution des nanoparticules lipidiques dans l’organisme entier.

Réduction

Nous avons privilégié une étude longitudinale en imagerie qui contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés et à optimiser la quantité de données obtenues sur chaque animal. Chaque animal sera son propre témoin. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience sera construit afin d’éviter les biais expérimentaux. Une étude pilote sur quelques animaux nous permettra de mettre au point la technique.

Raffinement

Les procédures expérimentales s’effectueront sous anesthésie générale afin de réduire la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Un protocole analgésique adapté sera mis en place en cas de besoin pour la gestion de la douleur. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de suivre leur bien-être. Une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites adaptés au-delà desquels la procédure sera arrêtée. La technique d’imagerie utilisée dans ce projet est une technique non invasive qui favorise le bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi afin de favoriser les comportements naturels.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour notre modèle de cancer car c’est une espèce pour laquelle les modèles sont bien documentés dans la littérature et pour laquelle nous avons une expertise. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à des souris adultes.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chimiquement, entraînant perte de poids et diarrhées pouvant contenir du sang, puis les souris reçoivent un traitement par voie orale pendant quatorze jours avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur cherche à identifier le rôle d'un gène dans l'action d'une molécule anti-inflammatoire déjà testée en essai clinique de phase 2. Il justifie le recours à la souris par l'échec des modèles cellulaires à "conclure" et par la "complexité d'un organisme vivant entier", et cite parmi les mesures de raffinement un fond musical dans les locaux.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin affectant 1 personne sur 1000. Elle se manifeste généralement par poussées plus ou moins sévères caractérisées par des diarrhées, des douleurs abdominales et un amaigrissement pouvant amener à des complications comme une péritonite. Sur le long terme, les patients sont exposés à un risque plus élevé de cancer du côlon. Des traitements existent et permettent de réduire cette inflammation mais ne fonctionnent pas chez un grand nombre de patients. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, il est important de connaître son mode d’action afin de cibler les patients pour lesquels ce nouveau traitement serait bénéfique. Lors des études in vitro sur cellules et chez le patient, nous avons ciblé un gène qui pourrait être responsable de l'effet anti-inflammatoire de notre molécule. Pour valider notre hypothèse, nous utiliserons des souris chez lesquelles ce gène est non fonctionnel pour tester si l'effet anti-inflammatoire de notre composé est maintenu.

Bénéfices attendus

La mise sur le marché de ce composé permettra d'améliorer la prise en charge des patients pour qui les traitements actuels ne fonctionnent pas, et par la suite, de pouvoir travailler sur d'autres maladies dans lequel ce gène serait impliqué.

Procédures

Nous administrerons par voie orale quotidiennement aux animaux un traitement sur une durée de 14 jours. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte de très courte durée (10 secondes en moyenne). Deux prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse (d’une durée de 3 secondes en moyenne) au cours de l'étude afin d'analyser différents paramètres biologiques. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de la prise du composé qui induit la colite. Ce composé induit une altération du colon qui provoque une perte de poids chez les souris malgré une alimentation et une hydratation normale et des diarrhées qui peuvent ou non contenir du sang. Les effets apparaissent, notamment pour la perte de poids, entre le 6ième et le 7ième jour et persistent entre 2 ou 3 jours soit jusqu’au 9ème jour correspondant à la fin de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Pour répondre à l'étude du mode d'action d'une molécule inflammatoire destinée à une mise sur le marché, seule l'utilisation d'un modèle murin est adapaté. En effet, les différents modèles cellulaires testés n'ont pas permis de conclure et ne représentent jamais la complexité d'un organisme vivant entier, l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés permet d’étudier plus précisément le rôle des gènes d’interêt.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en se garantissant l’obtention de résultats statistiquement représentatifs. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats de tests statistiques précédemment obtenus dans un modèle de colite murine. Un maximum d’échantillons biologiques seront prélevès lors de l’euthanasie et seront conservés si une hypothèse est formulée après l’étude, permettant ainsi de ne pas recommencer l’étude pour y répondre.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera quotidiennement avec une évaluation du stress et de la douleur. Plusieurs signes pour lesquels il est établi qu'ils reflètent une douleur ressentie par l'animal seront considérés comme points limites et entraineront l’euthanasie des animaux concernés. L'administration par voie orale sera privilégiée pour éviter l'apparition d'une péritonite douloureuse et stressante pour l'animal et elle sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide. Ceci afin de limiter le stress de l'animal. Une anesthésie gazeuse sera utilisée pour permettre un prélèvement sanguin indolore. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin de colite est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide (9 jours) ce qui permet de ne pas garder les animaux trop longtemps en expérimentation tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets de la molécule.

218 souris juvéniles de quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un ou deux gavages de streptocoque du groupe B, susceptible de provoquer une infection systémique, avant d'être tuées pour prélever leurs organes et dénombrer les bactéries. Le porteur reste bref sur les atteintes, mentionnant un léger stress au gavage et le risque d'infection, sans détailler l'état des souris atteintes. Il indique recourir à un modèle cellulaire de barrière intestinale quand c'est possible, tout en jugeant la souris "indispensable" pour les interactions immunitaires.

Objectifs

Le streptocoque du groupe B est une bactérie présente naturellement chez environ un quart de la population, sans pour autant entraîner d’infection. Il s’agit pourtant de la première cause d’infection grave chez les nouveau-nés. Le streptocoque du groupe B se trouve habituellement dans l’intestin qui possède normalement un rôle de barrière que les bactéries ne peuvent pas traverser. Parfois, chez les nouveau-nés, le streptocoque du groupe B commence par coloniser l’intestin avant de le traverser pour atteindre le sang puis le cerveau, avec des conséquences qui peuvent être mortelles. Dans ce projet, des souris seront colonisées par du streptocoque du groupe B au niveau intestinal pour comprendre comment l’interaction de la bactérie avec les cellules intestinales peut conduire à une infection sévère. Les objectifs de ce projet sont : 1. identifier si certaines cellules de l’immunité présentes dans l’intestin peuvent prendre en charge le streptocoque du groupe B pour l’amener dans le sang ; 2. comprendre comment le streptocoque du groupe B intervient dans la modification de la barrière intestinale pour la rendre plus permissive ; 3. déterminer si la colonisation par le streptocoque du groupe B facilite la traversée de la barrière intestinale.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous allons mieux définir l'impact de la colonisation par le streptocoque du groupe B sur la composition de la barrière intestinale ainsi que les facteurs et les cellules qui facilitent son franchissement. A plus long terme, cela permettra d'identifier de nouvelles thérapeutiques et de nouveaux moyens de prévention de l'infection chez les nouveau-nés.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à un ou deux gavages (à 5 jours d’intervalle) d’une durée de 20 secondes. Ils seront ensuite soumis à une injection d'analgésique par voie intrapéritonéale d'une durée de 3 secondes, suivie d'une mise à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L’inoculation par gavage est susceptible de provoquer un léger stress chez les souris. Le gavage oral par le SGB est susceptible de provoquer une infection systémique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements d'organes seront réalisés pour des études moléculaires, immunologiques, histologiques et pour dénombrement des bactéries.

Remplacement

L'étude des interactions du SGB avec des modèles cellulaires simples est utilisée à chaque fois que cela est possible en remplacement du modèle animal. Nous utilisons en particulier un modèle cellulaire permettant de reproduire la barrière épithéliale intestinale. Cependant, le modèle cellulaire est dépourvu en particulier de cellules immunitaires (cellules dendritiques, lymphocytes, etc.) qui sont d'une part essentielles à la maturation de la barrière intestinale et d'autre part qui concourrent à la dissémination du pathogène et au processus inflammatoire. Aussi, le modèle animal est indipensable à l'étude des interactions entre l'hôte et le SGB et au franchissement de la barrière intestinale par le SGB.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe, même âge et même poids, obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale dans un souci de réduction du nombre d’animaux. De même, la multiplication des prélèvements réalisés sur un même animal nous permet de répondre à plusieurs questions expérimentales tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux par lot a été estimé à l’aide de tests statistiques et les résulats des expériences seront analysés à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec eau et nourriture à volonté, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les animaux dont les scores cliniques atteindront le score critique (point limite) seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la colonisation intestinale, l'infection par franchissement de la barrière intestinale et la survenue de méningite observées au cours de l'infection néonatale par le SGB chez l'espèce humaine. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes et types cellulaires impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 4 semaines car il s'agit d'une étude pédiatrique.

645 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt-huit jours des injections quotidiennes de corticostérone, l'hormone du stress, pour induire un état anxio-dépressif, puis passent une batterie de tests comportementaux (open field, labyrinthe en croix surélevé, splash test, novelty suppressed feeding, interaction sociale), avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. Le porteur qualifie l'induction du phénotype dépressif de "nuisance légère" et affirme les nuisances "très faibles". Les bénéfices se limitent à des informations sur de nouvelles molécules contre les déficits sociaux, le porteur jugeant l'expérimentation animale "indispensable" faute de modèle in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce protocole est de caractériser les effets de différents antidépresseurs sur different types de comportements, chez un modèle de dépression développé chez la souris. A coté des tests comportementaux utilisés pour la quantification de l'anxieté et du comportement de type depressif, le comportement de type social, qui est une caractéristique clé des rongeurs, sera evalué à l'aide de cages d'interaction sociale. Cette caractérisation phénotypique complète nécessite l’utilisation de plusieurs tests comportementaux mesurant l’état anxieux/dépressifs des animaux et l’état social, chez des souris modèles d'anxiété-dépression induit par un traitement chronique de corticostérone (hormone du stress chez les rongeurs).

Bénéfices attendus

Cette étude examinera les effets comportementaux à la fois de type anxiolytic-antidepressif, et de type social de differentes molécules chez des souris rendus anxio-dépressifs par un traitement chronique de corticostérone. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations surtout sur l'utilisation de certaines nouvelles molécules pour le traitement des deficits sociaux souvent présents dans les pathologies de type anxieux et dépressif.

Procédures

Administration quotidienne de médicaments par injection intrapéritonéale (réalisée en 10 secondes) pendant 28 jours. Tests comportementaux : toutes les souris seront soumises à une batterie de test comportementaux 4 tests en 5 jours : -le test de l'open field (mesure de l'activité motrice) qui dure 30 minutes, - labyrinthe en croix surélevé qui dure 5 minutes, - le splash test (observation du toilettage) qui dure 5 minutes - novelty supressed feeding qui dure 5 minutes, -test d'interaction sociale : les souris sont placées dans une cage où le comportement de chaque souris vis à vis de ses congénères est automatiquement évalué : cette évaluation a lieu 3 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Outre l'induction de phénotype dépressif qui est considéré comme une nuisance légère, les nuisances pour ces animaux sont très faibles : les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur . Les administrations de médicaments seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques.

Devenir

Suite à la dernière batterie de tests comportementaux, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico des troubles de l’humeur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour étudier ces pathologies et les alterations comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisations des mêmes animaux tout au long de l'expérience chaque animal est même son propre témoin (évaluation du comportement au cours des différentes phases du protocole).

Raffinement

Au cours des semaines de traitements une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien être des animaux. Des points limites ont été définis et seront strictements appliqués.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser la pathologie dépressive ainsi que d'évaluer les différents effets des médicaments testés. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée sous anesthésie puis des injections de morphine à doses croissantes deux fois par jour pendant six jours, pour observer les effets du sevrage sur leurs interactions sociales par un suivi vidéo. Le porteur indique que le sevrage aux opiacés provoque une douleur modérée et une perte de poids. Les souris sont ensuite tuées sans aucune analyse post-mortem, faute de pouvoir les réutiliser après un traitement pharmacologique, une mise à mort que le porteur présente comme conforme aux "3R".

Objectifs

Les troubles de consommations aux opiacés sont en forte augmentations ces dernières années et ont des conséquences dévastatrices. Ce projet de recherche vise à comprendre le développement des troubles de l’humeur (en particulier dépression et les déficits d’interaction sociale) qui se développent lors de la mise en place d’une dépendance aux opiacés. Les opiacés agissent sur un système spécifique dans le cerveau. En conditions normales, ce système régule la douleur, les processus de récompense, les réponses émotionnelles et les réponses au stress. L’exposition aux opiacés altère le fonctionnement de ce système, ce qui conduit aux troubles du comportement et de l'humeur. L’objectif de ce projet consiste à comprendre le développement de ces pathologies, en particulier les déficits sociaux en utilisant de nouveaux tests comportementaux murins permettant de suivre les interactions entre animaux en temps réel.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre l’effet des troubles de consommations aux opiacés dans les interactions sociales entre les animaux. L’appareillage utilisé effectue en effet un suivi permanent de l’activité des animaux, qu’ils soient proches de congénères ou isolés. Ce type d’analyse complexe nous permettra de poursuivre notre recherche sur les adaptations à la suite de l’abstinence aux opiacés.

Procédures

-Implantation sous-cutanée d'une puce sur l’ensemble des souris soit 90 souris. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. -Injections à doses croissantes de la morphine ou solution saline, durée moins d’une minute par injection, 2x par jour, espacées de 12 heures, pendant 6 jours sur deux groupes de souris mâles composés de 15 traités à la morphine et 15 traités à une solution saline et deux groupes de souris femelles composés de 15 traitées à la morphine et 15 traitées à une solution saline

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation d'une puce permettant l'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Ensuite, ils resteront en groupe sociaux dans leurs cages d'hébergement. Après deux semaines de repos, les souris des groupes traités à la morphine ou solution saline vont subir des injections à doses croissantes de la morphine ou solution saline, par la voie intrapéritonéale 2x par jour, pendant 6 jours. Lors des périodes d'analyse, les souris seront simplement transférées dans une arène de 50 cm de côté qu'ils pourront explorer. Les expériences réalisées précédemment avec la morphine montrent une faible perte de poids totalement réversible et d'une courte durée. Il y aura une douleur induite par le sevrage opiacé qui est considérée comme modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet sans analyse post-mortem. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser ces animaux dans une autre étude sachant qu'ils ont reçu un traitement pharmacologique. En accord avec le principe des « Trois R », ils ne seront donc pas gardés en vie, car aucune autre utilisation ne peut leur être attribuée.

Remplacement

Les effets de l’exposition aux opiacés sur le comportement et leurs conséquences ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne peuvent pas récapituler la complexité du cerveau. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes mammifères vivants et entiers. La souris est l’organisme le plus adapté car, nous pouvons étudier des comportements liés aux addictions et aux réponses émotionnelles.

Réduction

Pour cette étude, nous emploierons le minimum d'animaux pour pouvoir conclure de manière robuste et statistiquement significative. Les animaux utilisés seront consanguins, ce qui permet de diminuer la variabilité entre individus et donc de réduire le nombre d'animaux tout en mettant en évidence un effet statistiquement significatif. De plus, les mesures d'interactions sociales seront répétées au cours du temps sur les mêmes animaux ce qui permet également de réduire le nombre d'animaux. Ces expériences produisent également de nombreuses données (vidéo 3D) qui seront sauvegardées et qui permettront de faire des analyses poussées sur un nombre d'animaux limité. Nous utiliserons des tests statistiques pour étudier les données et mettre en évidence des différences significatives entre les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales à l’administration d’opiacés. De plus, au cours de l’étude, tout signe d'inconfort sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau observé, limitant ainsi la souffrance à l’animal. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Pour éviter tout stress de l'animal durant l'implantation, une anesthésie gazeuse sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de prédilection pour la recherche biomédicale. Avec 90% de son génome identique à l’homme, elle est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Etant donnée que les pathologies neuropsychiatriques se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, notre étude se fera chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est-à-dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 mâles tués à l'issue et 60 femelles réutilisées dans d'autres projets de l'équipe. Les souris subissent une gonadectomie sous anesthésie avec pose d'implants hormonaux, puis des tests de comportement de reproduction, les femelles utilisées pour déclencher le comportement des mâles, ceux-ci étant ensuite tués pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des atteintes possibles allant du dos courbé et de la perte de poids rapide à l'état de choc et à la détresse respiratoire, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les bénéfices se limitent à mieux comprendre l'action des hormones sexuelles sur le comportement, et le porteur affirme que l'étude ne peut se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Pour une reproduction réussie, il faut non seulement une production de gamète (oocytes et spermatozoides) mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle optimisant ainsi la rencontre des partenaires sexuels et la fécondation. Chez le mâle, le comportement de reproduction est contrôlé par le cerveau sous l’action des hormones sexuelles : androgènes (testostérone) et des oestrogènes (oestradiol). Différentes études sur des modèles de souris ne possédant pas les récépteurs de ces hormones sexuelles dans le cerveau ont permis de montrer le rôle de la testostérone et de l’oestradiol dans la régulation du comportement sexuel mâle. Néanmoins, la manière dont les hormones agissent spécifiquement sur le cerveau restent encore à identifier. Dans cette étude, nous souhaitons donc identifier les modes d’actions et les cibles cellulaires dans le cerveau des androgènes et des oestrogènes Plus particulièrement, nous étudirons les effets de la délétion génétique des récepteurs des hormones sexuelles au sein du cerveau sur les structures cérébrales régulant le comportement sexuel mâle.

Bénéfices attendus

Au cours de la vie, notre corps et nos fonctions biologiques sont soumis à des variations hormonales pouvant avoir un impact sur notre système reproducteur et sur notre cerveau. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des effets des variations des hormones sexuelles testosterone et oestradiol sur la fonction de reproduction mâle spécifiquement. Les modèles animaux transgéniques utilisés nous permettront de comparer les effets d'une absence de signalisation des hormones sexuelles, oetsradiol et testosterone, sur le comportement de reproduction chez le mâle.

Procédures

Les souris utilisées au sein de ce projet subiront une chirurgie gonadectomie et pose d’implants sous-cutanée (180 animaux) sous anesthésie générale avec réveil et analgésique d’une durée maximale de 30 minutes. Ensuite, l’ensemble des souris de cette demande d’autorisation de projet entreront dans un protocole de tests de comportement de reproduction. Pour les femelles stimuli (60 animaux), des injections sous-cutanées seront pratiquées quelques heures avant les tests de comportement de reproduction.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isoflurane pendant lesquelles les gonades seront retirés et un implant contenant des hormones sexuelles estradiol/testostérone sera posé en sous-cutané. Les éventuels symptômes à court et à long terme liés à cette procédure chirurgicale sont : Apparence et position anormale (poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie); Comportements anormaux (aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation)); Une perte de poids rapide; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité; Difficulté respiratoire. Certains animaux subiront également des injections sous-cutanées pouvant entrainer un stress lié à la contention et aux injections.

Devenir

L’ensemble des mâles adultes (120 animaux) de cette demande d’autorisation de projet seront euthanasié à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des cibles moléculaires des signalisations androgénique et oestrogénique impliquées dans la plasticité cérébrale controlant l’expression du comportement de reproduction chez le mâle adulte. L’ensemble des femelles adultes (60 animaux) utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe.

Remplacement

L’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite donc l’utilisation de modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau. Des animaux vivants sont donc nécessaires pour ce projet afin de réaliser des analyses comportementales et neuroendocrines sur des souris transgéniques dont les récepteurs aux différentes hormones stéroidiennes sont délétés dans le système nerveux. Ainsi des méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 180 animaux sur 2 procédures qui nous permettrons d’étudier les cibles moléculaires des récepteurs aux hormones sexuelles, androgènes et oestrogènes, impliquées dans le contrôle central du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Nous péléverons également d’autres organes et les garderont pour de futures études ou afin de les proposer aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie sous anesthésie avec réveil, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie ; Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) ; Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcent du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine ; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcent du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la littérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (à partir de 8 semaines). En effet, le but de ce projet est d’étudier les effets de l’invalidation des différents récepteurs des hormones stéroidiennes sur la neuroplasticité des structures cérébrales associés à la régulation des comportements de reproduction chez la souris mâle adulte.