Souris

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de phalange, des injections intrapéritonéales, une chirurgie de dénervation chimique par injection d'une toxine dans le tissu adipeux, un régime hypercalorique et une exposition au froid à 6 °C, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur répète que ces gestes n'entraînent "aucune nuisance supplémentaire", la fonction étudiée étant présentée comme "bénéfique". Les retombées, une nouvelle cible thérapeutique contre l'obésité, restent renvoyées à l'avenir, et le porteur justifie le prélèvement de tissus non utilisés par une banque censée réduire le recours futur à d'autres animaux.

Objectifs

L’obésité, qualifiée d’épidémie depuis 1997 par l’OMS, touche plus de 1,9 milliards d’adulte dans le monde. De plus, l’OMS prévoit qu’un quart de la population mondiale sera obèse d’ici 2045. L’obésité se caractérise par une surcharge pondérale et favorise le développement de nombreuses complications et qui impliquent le dysfonctionnement de nombreux organes, tels que le foie et le tissu adipeux. Dans ce contexte, contrairement aux effets délétères associés à une augmentation de la production de glucose (sucre) par le foie, la production intestinale de glucose (PIG) est une fonction particulièrement intéressante, puisqu’elle améliore le métabolisme. En effet, le sucre produit par l’intestin active un signal nerveux qui se traduit, au niveau du cerveau, par une induction de la satiété (diminution de la prise alimentaire), une augmentation de la sensibilité à l’insuline et une diminution de la production de glucose par le foie. Le rôle important de la PIG dans la régulation du métabolisme a été démontré grâce à la caractérisation du phénotype de deux modèles murins : d’invalidation ou d’induction de la PIG. Ainsi, les résultats montrent que la PIG est capables de favoriser ou de protéger de l’apparition de nombreux troubles métaboliques tels que l’obésité, le diabète, la stéatose hépatique ou encore la dyslipidémie. Plus particulièrement, ces études ont permis de mettre en évidence le rôle de la PIG dans la régulation du métabolisme du tissu adipeux, et notamment sur sa fonction de production de chaleur (thermogenèse) qui est un poste de dépense d’énergie important dans la résistance au froid, mais également dans le maintien de la balance énergétique (et par conséquent du poids corporel). En effet, de nombreuses études visent à augmenter la dépense d’énergie en modulant la thermogenèse du tissu adipeux, dont on sait qu’elle est diminuée au cours de l’obésité. Puisque cette fonction est principalement sous le contrôle du système nerveux sympathique (SNS), cette étude vise à déterminer si les effets de la PIG sur le métabolisme du tissu adipeux passent une activation du SNS et préciser les mécanismes impliqués. Cette étude est réalisée dans différentes conditions nutritionnelles afin de nous d’étudier les effets métaboliques de la PIG dans un état physiologique (régime standard) et pathologique (régime hypercalorique riche en gras et en sucre).

Bénéfices attendus

La PIG est une fonction qui exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique lorsque les souris sont soumises à un régime hypercalorique pendant 5 mois. De plus, l’activation de la PIG améliore le métabolisme du tissu adipeux en diminuant l’adiposité et en augmentant la thermogenèse (production de chaleur) par le tissu adipeux brun (TAB) et le tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), se traduisant par une amélioration de la tolérance au froid. Néanmoins, alors que les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la PIG sur la résistance au froid et la protection contre l’obésité restent encore mal compris, nous proposons ici que le système nerveux sympathique innervant les tissus adipeux jouerait un rôle essentiel. Ainsi, grâce à ce projet, une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu permettra à l’avenir de proposer la PIG comme une nouvelle cible thérapeutique contre l’obésité, dont la prévalence à l’échelle mondiale a considérablement augmenté ces dernières années.

Procédures

Les différents modèles de souris génétiquement modifiées nécessaires à ce projet seront obtenus par modification génétique. Ainsi, une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours est nécessaire pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation génétique de la PIG ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Néanmoins, l’invalidation de la PIG sera réalisée par un traitement injecté (dans le péritoine) à l’âge de 6-8 semaines (5 jours de suite). Les souris de type naturel (contrôle) recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Afin de déterminer si les effets bénéfiques de l’induction de la PIG passent par le système nerveux sympathique du tissu adipeux brun interscapulaire (TAB) ou du tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), nous réaliserons des chirurgies de dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine directement dans l’un de ces tissus. Ces chirurgies seront réalisées chez des souris contrôles ou ayant une PIG activée, nourries avec une alimentation standard ou hypercalorique. Cette intervention est très rapide n’excédant pas 15-20min par animal. Les effets de la dénervation sur la résistance au froid seront évalués après une exposition des souris à une température froide. Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal , 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier les tissus adipeux et l’intestin.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en PIG présentent un phénotype anxieux léger (comportement exploratoire diminué et plus forte résignation). Néanmoins, d’après notre expérience, l’hébergement en groupe et l’apport d’enrichissement est suffisant pour atténuer l’anxiété. Les souris chez lesquelles la PIG est activée seront nourries avec un régime standard ou riche en graisses et en sucres. Ce dernier favorise la prise de poids et le diabète, néanmoins, avec le temps de régime prévu dans ce projet, les souris seront étudiées à un stade précoce afin de limiter les complications liées à ces maladies. De plus, la PIG étant une fonction bénéfique, aucune nuisance supplémentaire n’est attendue. Nous réaliserons une dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine dans les différents tissus adipeux (l’un ou l’autre) de souris contrôles ou chez lesquelles la PIG est activée (nourries avec un régime standard ou hypercalorique). Cette dénervation sympathique est une bonne alternative à la dénervation chirurgicale qui est plus invasive et moins spécifique. De plus, l’injection locale restreinte à un tissu n’entraine aucun effet délétère ou douloureux (ni aucun problème de cicatrisation). Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal, 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. Une dénervation du TAE sera réalisée chez des souris nourries avec une alimentation standard. Dès le lendemain de la chirurgie, les souris seront soumises à un régime hypercalorique pendant 1 mois (4 semaines). La dénervation du TAE ne devrait pas entrainer d’effets indésirables supplémentaires par rapport à celle du TAB. De plus, l’apport d’un régime hypercalorique pendant seulement 4 semaines permet de limiter les dommages sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la production de sucres (glucose) par l’intestin. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la fonction étudiée, la production de glucose par l’intestin, a des impacts sur l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté au niveau des senseurs de glucose (détecteurs) dans les vaisseaux sanguins entre l’intestin et le foie, et qui vont transmettre un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie, régulant en particulier le métabolisme du tissu adipeux.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique pertinente, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, 160 souris mâles transgéniques et de type naturel (contrôles). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe 3-4 souris par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Les procédures sont maitrisées par les personnes en charge de l’expérimentation animale. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation. Dans les conditions d’hébergement (groupe et enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris déficientes en production intestinale de glucose. Cependant, une attention particulière sera portée sur cette lignée ayant une susceptibilité à l’anxiété augmentée dans des conditions de challenge du stress. Une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera mise en place lors des chirurgies .

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production endogène de glucose, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet a été largement caractérisé au laboratoire depuis de nombreuses années. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J, lignée murine choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Cette souche a également été choisie car c’est une bonne souche pour l’étude du diabète et des maladies métaboliques. Les animaux provenant d’un éleveur agréé (souris de type naturel: C57BL/6J) seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Cela permet de limiter les biais expérimentaux dus à des conditions d’hébergement différents. A l’âge de 6-8 semaines, les souris (qui vont devenir déficientes en PIG) recevront des injections pour induire la modification génétique. Ces injections se font à l’âge adulte pour limiter les effets de la molécule sur le métabolisme des jeunes souris. L’activation de la PIG ne nécessite aucune intervention, mais les souris seront étudiées aux mêmes âges pour pouvoir comparer les résultats. Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ainsi, à l’issu des différentes procédures, les souris âgées de 13, 14, 17 ou 34 semaines, seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser.

124 souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une photobiomodulation par la lumière trente minutes par jour pendant onze à douze mois, subissent des prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux (labyrinthe radial, labyrinthe de Barnes, rotarod, open field), avant une ponction de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie létale et une perfusion intracardiaque. Le porteur cherche à déterminer l'heure de la journée la plus favorable à ce traitement. Les retombées annoncées, un passage chez le singe puis un traitement humain, restent renvoyées à la suite, tandis que le porteur affirme le modèle animal "indispensable" et "seul moyen" de répondre à la question.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux avec un fond génétique hybride 129/C57BL6, en prenant en compte des connaissances du modèle 3xTgAD par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en s'appuyant sur une approche statistique, nous avons déterminés que nous aurions besoin de 60 souris 3xTgAD soit 15 souris par groupe (femelles), de 18 souris contrôles femelles avec le même fond génétique et de 22 souris pour l’expérience pilote (22 souris WT). Le total de souris sera de 100 individus. Les modèles murins utilisés seront les 3xTg-AD et les WT femelles exclusivement car les stigmates anatomiques et cognitifs de la MA sont beaucoup prononcés. L’expérience pilote permettra d’affiner les paramètres de la photobiomodulation (PBM), de mettre au point parfaitement les techniques mis en œuvre pour répondre à l’hypothèse du projet et d’obtenir des résultats exploitables. Une modification du nombre de souris WT est actuellement demandé. Selon la première hypothèse et les connaissances sur le sujet, nous avions diminué le nombre de groupe de souris WT pour suivre la stratégie de réduction des 3Rs et car le cycle circadien et la photobiomodulation n’aurait pas dû avoir une influence sur ces souris. Nous avions également expliqué que le groupe WT-PBM sera illuminé série 1 le matin, série 2 l’après-midi et série 3 la nuit pour répondre aux futurs reviewers des journaux scientifiques. Cependant aux vues des premiers résultats, nous devons effectuer la photobiomodulation sur l’ensemble du cycle circadien. Passant de 2 à 4 le nombre de groupe de souris WT et pour obtenir des résultats statistiquement corrects (avec l’aide du logiciel G*Power), le nombre de souris supplémentaire est de 24, soit 124 souris au lieu de 100 auparavant. Ces groupes seront divisés en 4 séries avec pour les 3 premières séries un n=3 pour les WT/ WT-PBM-N et un n=5 pour les 3xTg-AD (au total n=18 pour les WTs et n=60 pour les ADs). Pour la 4ème série, il y aura seulement des souris WTs avec un n=3 pour les WT, n=9 WT-PBM-AM, n=9 WT-PBM-PM et n=3 WT-PBM-N (au total n=24 pour les WTs). Pour respecter les 3Rs, nous avons effectué un test statistique pour limiter le nombre d’animaux tout en ayant des résultats exploitables pour le projet.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse. Selon la dynamique évolutive de la maladie d’Alzheimer dans ce modèle, les marqueurs pathologiques (plaques amyloïdes et Tau) sont observables scientifiquement entre l’âge de 12 et 14 mois d’où la procédure sans réveil à cet âge et les déficits cognitifs sont, quant à eux, visibles à partir du 12ème mois. La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative sur des personnes âgées. Dans le cas des souris, cela correspond aux stades adultes/âgés entre 12 et 14 mois.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une greffe de cellules hépatiques humaines sous la capsule rénale, subit jusqu'à seize prélèvements sanguins pour suivre la formation d'un hépatome, puis est tué pour l'extraire, certains échantillons nécessitant un second passage dans le rein d'une autre souris. Le porteur décrit des risques d'hypothermie, de saignement, d'infection et de perte de poids liés à la chirurgie. Il présente ces lignées cellulaires comme un moyen de "réduire l'utilisation d'animaux" dans les tests d'hépatotoxicité, tout en fondant leur production sur l'usage de 900 souris.

Objectifs

Les lésions hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché tandis que de nombreuses molécules en cours de développement échouent au cours des essais cliniques pour des raisons d’hépatotoxicité. Pour ces raisons, les études d’hépatotoxicité et de pharmacocinétique représentent des éléments essentiels pour réduire les échecs de développement de nouveaux médicaments. Le foie est un organe essentiel d’où les hépatocytes represente environ 70-80 % de sa totalité et ont des fonctions essentielles telles que : la régulation du métabolisme des glucides, des lipides et du cholestérol ; la production de composants du sérum (facteurs de coagulation, albumine, etc) ; la sécrétion et l’excrétion d’acides biliaires et la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Les hépatocytes humains primaires (PHH) constituent le modèle de référence pour prédire le métabolisme et l'hépatotoxicité des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité. Devant cet accès très limité aux prélèvements cadavériques d’échantillons de foie humain, rares, au coût très élevé et de qualité très variable notamment en fonction du donneur et du prélèvement, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires transgéniques très éloignées de la physiologie humaine. Ainsi notre projet a pour objectif de développer des hépatocytes humains hautement fonctionnels, illimités, reproductibles et prêts à l'emploi provenant de différents donneurs, totalement similaires à des PHH. Ceci en se basant sur notre technologie Natline® d’immortalisation et de maturation ciblée de cellules fonctionnelles qui a déjà fait ses preuves avec la création de cellules béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles EndoC-bH1 à -bH5. Ainsi, nous pourrions répondre au besoin très fort des laboratoires de recherche et de développement pharmaceutique de modèles humains physiologiques et prédictifs de la physiologie des hépatocytes et de leur réponse aux toxines.

Bénéfices attendus

Le développement de lignées d’hépatocytes humains fonctionnels, ainsi disponibles en quantité illimitée, aurait des conséquences très bénéfiques pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments. En recherche, ces cellules remplaceraient les hépatocytes humains primaires, d’accès limité, et seraient un complément idéal aux lignées cellulaires humaines et modèles animaux. Elles permettraient d’accélérer la recherche sur la physiologie hépatocytaire humaine, les mécanismes des maladies du foie et de toxicité et permettraient la création de modèles pathologiques reproductibles. Concernant la pharmacologie et la toxicologie, l’impact de ces cellules serait immense. La possibilité d’avoir une source illimitée et reproductible de cellules similaires aux hépatocytes humains primaires et représentatives de la variabilité des réponses à l’hépatotoxicité rencontrée dans la population serait un bouleversement pour le processus de développement des médicaments. Une meilleure prédiction de l’hépatotoxicité permettrait de réduire le nombre de médicaments retirés du marché et augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché, ce qui diminuerait le risque de toxicité hépatique chez les patients. Enfin, l’utilisation de tels hépatocytes humains prédictifs permettrait de réduire l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et d’hépatotoxicité.

Procédures

Deux interventions: 1) Chirurgie pour greffe sous la capsule rénal de la souris (1 greffe par souris) et 2) prélèvement sanguin pour suivre le succès de la greffe (toutes les 2 semaines après la greffe ou tous les mois, en fonction des premiers résultats et du développement de l'hépatome, 16 prélèvements maximum par souris). La chirurgie, une procédure d’environ 30 min, sera effectuée sous anesthésie et analgésie et il y aura un analgésique administré en préventif pendant 3 jours. Pour la prise de sang, il s'agit d'une procédure sans anesthésie et analgésie car très peu douloureuse. La souris aura une gêne au moment de la piqure ce qui ne durera que très peu de temps. Les prélèvement s’effectueront par la queue de l’animal ou par voie submandibulaire.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris seront soumises à une chirurgie afin de greffer des cellules ou tissus humains dans la capsule rénale. Ainsi, la chirurgie et les jours qui suivent sont les moments pendant lesquels les animaux pourront subir des effets indésirables et des nuisances. Les effets indésirables et nuisances possibles sont de la douleur et du stress liés à la chirurgie et une gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Dans le cas de complications liées à la procédure celles-ci pourraient se traduire par une hypothermie liée à l’anesthésie, un saignement dû à la chirurgie, une infection suite à la chirurgie et une perte de poids. L’amplification des hépatocytes humains sous la capsule rénale des animaux ne devrait pas générer de douleur ou d’inconfort supplémentaire étant donné que leur taille restera très modeste. Néanmoins, dans le cas où un hépatome se formerait vite, l’expérience serait arrêtée au plus tôt et l’animal serait euthanasié et le tissu prélevé afin de minimiser les effets indésirable sur l’animal. La formation de l’hépatome sera suivie via des prélèvements réguliers de sang (1 fois toute les 2 semaines à 1 mois, selon les premiers résultats), pour la mesure de l’albumine humaine. Concernant ces prélèvements sanguins, il s’agit d’une procédure légère qui pourrait occasionner une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements.

Devenir

Tous les animaux utilisé dans se projet seront soumis à une chirurgie pour la greffe de hépatocytes sous la capsule rénal. Ils resteront en vie le temps que l’hépatome progresse et ils seront mis a mort à la fin de l’expérience pour l’extraction de l’hépatome (les hepatocytes). Le cas écheant ils seront mis a mort après l'age de 20 semaines.

Remplacement

Afin d’assurer le succès de notre projet de développement d’hépatocytes humains hautement fonctionnels, stables et en quantités illimités similaires aux PHH, nous nous baserons sur la méthodologie qui a permis la génération des cellules bêta pancréatiques EndoC-bH1 à -bH5, la plateforme NatLine. Une des étapes de cette plateforme est la transplantation de cellules primaires récemment transduites avec un gène immortalisant dans la capsule rénale de la souris SCID afin de permettre l’amplification sélective de cellules différenciées et leur maturation. Pour le développement des cellules EndoC-bH, cette étape a été indispensable, aucune autre stratégie n’ayant permis d’obtenir l’amplification de cellules béta pancréatiques humaines fonctionnelles sécrétrices d’insuline et répondant aux incrétines. Plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro d’hépatocytes humains primaires à différents stades de développement ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées cellulaires n’a aboutit à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des hépatocytes primaires, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empèche leur utilisation dans les études de pharmaco-toxicologie. Pour cette raison, la greffe initiale des hépatocytes primaires dans la capsule rénale de souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de lignés d’hépatocytes similaires aux hépatocytes primaires humains. Par ailleurs, dans le cas des cellules béta pancréatiques, après récupération du premier insulinome pour chaque échantillon primaire donné, cet insulinome a du être transplanté à nouveau sous la capsule rénale d’un seconde animal. Sans quoi ces lignées primaires ne survivaient pas in vitro. Seulement après un second passage dans l’animal, les lignées d’insulinome créées étaient suffisamment stabilisées pour pouvoir être adaptées à la culture in vitro. Dans le cas des hépatocytes nous procéderons de la même manière en séparant les hépatomes primaires en deux afin de tenter leur culture in vitro tout en sauvegardant une partie d’hépatome in vivo. Après les premiers essais, si les premiers hépatomes survivent in vitro, nous éliminerons cette étape de passage secondaire dans la capsule rénale de souris et la remplacerons par leur culture in vitro. Cela aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des lignées d’hépatocytes.

Réduction

Nous avons estimé que le projet nécessiterait l’utilisation d’un nombre maximal de 900 animaux. Ce calcul est basé sur l’utilisation de 3 animaux pour la greffe primaire puis d’un maximum de 6 animaux pour les greffes secondaires soit jusqu’à 9 animaux par échantillon primaire de foie. D’autre part, basé sur l’expérience de la génération des cellules béta EndoC-bH, nous avons estimé qu’il nous faudrait un total de maximum 100 échantillons primaires, étalés sur une période maximale de 5 ans, pour générer environ 30 à 40 lignées cellulaires stables à partir desquelles seraient caractérisées les 5 à 10 lignées d’hépatocytes humains les plus fonctionnelles et représentatrices de la diversité de métabolisme hépatique. L’expérience des cellules béta nous a montré qu’il pourrait être indispensable de procéder à une ré-implantation des hépatomes primaires incapables de survivre in vitro. Si cela n’est pas le cas pour les hépatomes et que lors des premières expériences pilotes nous observons qu’ils peuvent être amplifiées in vitro tout en acquérant un caractère de cellules fonctionnelles, nous n’effectuerons plus de passage secondaire dans la souris pour les échantillons primaires suivants. Ceci aurait pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet de jusqu’à 400 animaux (30 échantillons primaires x 9 souris puis 70 échantillons primaires x 3 souris = 480 animaux) si nous considérons qu’il nous faudra traiter un tiers des échantillons primaires via un passage secondaire dans l’animal avant d’avoir un recul suffisant sur notre capacité à amplifier in vitro des lignées fonctionnelles à partir des hépatomes primaires.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les nuisances et douleurs induites par la procédure (chirurgie) et subies par les animaux, différentes actions seront menées. Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus dans les locaux de la zootechnie et seront acclimatés pendant au moins 5 jours avant la procédure. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets prévus pour enrichir leur environnement. Avant la procédure (30 mins), les animaux seront soumis à une injection sub-cutanée d’analgésique en préemptif. Ils seront ensuite soumis à une anesthésie injectable à la kétamine et à la xylazine Ces deux derniers composants entraînent une anesthésie, d’une durée de 20 à 30 minutes et celle-ci sera re-administrée dans l’éventualité où la procédure prendra plus de temps, à une dose équivalente au tiers. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera placé sous l’animal et celui- ci sera couvert tout au long de la procédure. Dans la phase de réveil, l’animal sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur et confort pendant les heures qui suivent la chirurgie, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, soit 6 à 8 heures après la chirurgie puis 2 fois par jour espacé d’environ 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (7-10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les condition d’hébergement classique A2 de nos installations et surveillé tous les jours. De plus l’apparition des points limites sera surveillé afin d’éviter la souffrance de l’animal ou résoudre d’éventuelles complications opératoires ou post-opératoires. Ainsi, l’animal sera surveillé pour des signes : d’hypothermie, de douleur ou stress, de perte d’activité, de déshydratation ou d’absence de prise de nourriture, de perte de poids, pour l’apparition d’ une infection ou d’une ulcération de la plaie. Dans le cas où un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’évité la degradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il ne sera pas possible de reverser ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.

Choix des espèces

Nous avons mis au point chez la souris, un modèle expérimental qui permet de récapituler la différenciation du pancréas humain. Ainsi, en greffant sous la capsule rénale de souris SCID immuno incompétentes des fragments de pancréas embryonnaires humains immatures, nous sommes capables de reproduire le développement du pancréas tel qu’il a lieu in vivo. Cette méthode, associée à la transduction lentivirale d’un oncogène, nous a permis de générer les seules lignées cellulaires béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles (EndoC-bH). Ces lignées cellulaires ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires dans le monde. Cette stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain définitif. Ce modèle expérimental n’a été testé que sur la souris et pas sur d’autres espèces, rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet hépatocytes. Les souris qui seront utilisées auront entre 6-20 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits. Ceci car avant l’animal est trop petit et donc la chirurgie est plus compliqué du fait de leur petite taille. En autre, l’amplification in vivo du tissu pourra prendre ensuite jusqu’à 8 mois ( notre expérience avec le développement des cellules béta), ce qui fait que l'animal ne doit pas être trop âgé.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colique et des gavages répétés, puis sont tuées pour prélever tumeur, côlon, foie, rate, sang et fèces, afin d'étudier le rôle d'un acide aminé, la sérine, dans l'effet pro-cancérigène d'une bactérie E. coli. Le porteur indique que le développement tumoral devrait provoquer une perte de poids, un amaigrissement et de possibles lésions cutanées ou nécroses. Les retombées pour les patients, une alimentation appauvrie en sérine après chirurgie, restent renvoyées au long terme, et le porteur affirme l'expérimentation animale "indispensable" faute d'alternative in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre nos études en précisant les mécanismes d’action impliqués dans la capacité à participer au développement du cancer colorectal (CCR) suite à une infection bacterienne. Nos travaux préalablement publiés démontraient que l’infection avec des souches d’Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) isolées de CCR humains accéléraient le développement tumoral sur des modèles murins de carcinogenèse colique et via des mécanismes induits au niveau des cellules épithéliales intestinales. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide amine, la serine, dans les effets pro-carcinogènes des CoPEC, au niveau des cellules épithéliales intestinales et dans un modèle murin de prédisposition à développer un CCR. Ce dernier est un modèle long (4 mois), et la taille des tumeurs ne suffit pas à réaliser une étude mécanistique complète de la carcinogenèse. Ainsi, nous proposons d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en serine sur le rôle pro-carcinogene des CoPEC dans un autre modèle murin. Pour cela, nous évaluerons le développement tumoral de cellules d’adénocarcinome colique murines greffées en sous-cutané chez la souris. Nous avons choisi de travailler chez la souris C57BL/6 avec un modèle murin syngènique afin de nous affranchir des limites de la xénogreffe, en injectant des cellules d’adenocarcinome colique murines MC38 isolées de souris C57BL/6. Il s’agit donc d’un modele tumoral se developpant assez rapidement (20 jours) et qui nous permettra d’obtenir suffisamment de materiel biologique pour les différentes études.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient nous permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC. Plus précisément, à long terme les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne chez les patients. Suite à une chirurgie et afin de limiter la recolonisation du tratus digestif par les E. coli producteurs de colibactine, il pourra être envisagé d'administrer aux patients une nourriture artificiel déplétée en sérine.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué pendant la durée de l’expérience, en dehors du prélèvement de fèces (1 fois par semaine après gavage soit 5 fois) . En revanche, des prélèvements seront réalisés sur animaux après la mise à mort (feces, sang, tumeur, côlon, foie, rate).

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal ainsi que l'aspect et la localisation de la tumeur. Une baisse d'activité́, de locomotion ainsi qu'une perte de poil et un amaigrissement sont attendus au cours de l'expérimentation. D'éventuelles lésions cutanées/nécroses lié au développement tumoral pourront aussi être observées.

Devenir

Des prélèvements de tissus (tumeur, côlon, foie, rate), de sang et de fèces seront réalisés sur chaque animal. Des études histologiques et moléculaires seront ensuite mises en œuvre afin d’évaluer l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes d’interaction bactéries/hôtes/nutrition sur la carcinogenèse colique.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effet pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique en méthode in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité de la colonisation et de prise de la greffe entre les différents animaux. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage et aux injections sous cutanées, le nombre d'animaux par lot a été réduit au minimum Ainsi, nous avons montré que l’effectif optimal était de 10souris/groupe. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d'abord, un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau et de nourriture, observera le comportement général de l’animal (activité́, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, perte de poids) ainsi que l’aspect et la localisation de la tumeur. Cela permettra de repérer d’éventuelles lésions cutanées/nécroses, ainsi que des développements tumoraux trop importants qui pourraient gêner la souris. Ce suivi sera réalisé par une personne formée en interne au suivi des animaux et désignée compétente à détecter les signes de comportement anormal. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring. Une mise à mort anticipée de l’animale sera réalisée si besoin.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l'homme. Ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur des questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal.

Pour provoquer une chute des plaquettes, des souris reçoivent des chimiothérapies anticancéreuses, 5-FU, carboplatine, gemcitabine ou bortezomib, injectées sous anesthésie gazeuse et suivies de prises de sang à la queue. 269 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements et des analyses post-mortem. L'équipe étudie comment les mégacaryocytes de la moelle osseuse libèrent les plaquettes dans le sang, et retient pour l'imagerie des souris de quatre à huit semaines, dont l'os du crâne est assez fin pour laisser passer la lumière. Une opération chirurgicale sous anesthésie attend en plus 95 d'entre elles, sans que le résumé dise laquelle.

Objectifs

La thrombopénie correspond à une baisse du nombre de plaquettes sanguines exposant les patients à des risques hémorragiques. Il s'agit d'un problème clinique courant chez les patients traités par chimiothérapie. Les plaquettes sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse. Une étape clé et mal comprise dans leur formation est la libération des plaquettes dans la circulation sanguine (intravasation). L’exploration de l’intravasation in vivo constitue encore aujourd’hui un véritable défi car ces événements sont rares dans la moelle. Nous avons montré précédemment que cette étape dépend d’une structure cellulaire particulière : la PodoPZ (extensions permettant de palper son environnement). La PodoPZ permet aux MKs de libérer les plaquettes dans la circulation sanguine. Notre hypothèse est que la PodoPZ contribue à restaurer une numération plaquettaire normale après thrombopénie induite par les agents chimio-thérapeutiques anti-tumoraux (CIT). Ainsi, le but de ce projet est d’étudier l’importance de la PodoPZ dans les thrombopénies liées aux chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre le fonctionnement de la PodoPZ (zone périphérique des cellules riche en actine et myosine) dans une étape clé et indispensable de la formation des plaquettes sanguines, l’intravasation des MKs. Sur le plan clinique, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de la PodoPZ pour améliorer la prise en charge des CIT, offrant ainsi une méthode alternative de traitement de la thrombopénie.

Procédures

L'ensembles des 269 animaux seront soumis au début des expériences à des injections et prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse pendant 10 minutes. De plus 95 animaux seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les traitements de CIT, les souffrances infligées aux animaux sont légères puisqu’il s’agit principalement d’injections et de prélèvements de sang à la queue sur animal anesthésié. Les protocoles liés au 5-FU et au Romiplostim ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids. Pour les trois autres substances (Carboplatine, Gemcitabine, Bortezomib), le choix des doses et des voies d’injections sont basés sur des études publiées de la littérature qui n’indiquent pas d’effets néfastes ou de saignements. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux et classons nos procédures en modérées. Pour cela, nous allons surveiller le réveil de l’animal et son état général, des critères qui seront notés dans nos fiches de suivi. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’un suivi quotidien basé sur l’apparence, l’abreuvement, l’alimentation, l’examen clinique et le comportement de l’animal, en utilisant les grilles de scores cliniques.

Devenir

A l’issu des procédures les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre MKs, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Nous avons effectué les études préliminaires possibles en culture cellulaire avant de passer sur le modèle animal qui s’avère être la seule solution pour étudier ces phénomènes complexes dans leur intégralité.

Réduction

Nos expériences sont optimisées pour utiliser le moins d'animaux possible ainsi le maximum de prélèvements seront effectués : sang, tissus, organes pour avoir accès aux différentes expériences nécessaires au projet. Le nombre de souris nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé en amont suivant un calcul statistique bien défini et détaillé dans la demande de projet. On estime par ce calcul que le nombre d’animaux par lot doit être de n=9 (3 souris par groupe sur 3 séries différentes), l'effet attendu de nos traitements est augmenté de 5x par rapport aux témoins (thrombopénie et rebond selon la littérature).

Raffinement

Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées GFP-myosine permettant de visualiser en temps réel la PodoPZ). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. L’approche d’imagerie requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière. Pour les autres expériences les souris seront utilisées entre 8-18 semaines.

Une partie des souris est invalidée pour le gène Slc20a2 et ne produit pas la protéine PiT2, que l'équipe pense impliquée dans la production de chaleur par les tissus adipeux. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la pesée et l'analyse de leurs organes. Une partie reçoit jusqu'à 14 semaines un régime riche en graisse, certaines à thermoneutralité, et les souris subissent à jeun une prise de sang à la veine mandibulaire, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec cinq microprélèvements en deux heures par incision de la queue, sans anesthésie. Le porteur fixe le point limite à une prise de poids de 50 à 60 %, et prévoit une "légère réduction de la mobilité non dommageable".

Objectifs

Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de PiT2 comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité

Procédures

Les souris seront pesées une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (Les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue, limitant le stress des animaux). Un prélèvement de 50µl de sang sera réalisé sur souris à jeun par ponction de la veine mandibulaire. Une semaine puis deux semaine avant la fin de la procédure, 5 micro-prélèvements seront réalisés sur une durée de 2h à l'aide d'une légère incision, maîtrisée par les expérimentateurs de ce projet et sous contrôle du personnel de la SBEA.

Impact sur les animaux

Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Pour les mesures de tolérance au glucose et à l’insuline, les prélèvements de sang sont faits à l'extrêmité de la queue, à l'aide d'une légère incision sur animaux vigiles : douleur légère et de courte durée. Une prise de 50μl de sang sera réalisée au niveau de la veine mandibulaire pour les dosages hormonaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)

Remplacement

Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.

Réduction

D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).

Raffinement

Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène Slc20a2 qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de PiT2 dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.