Souris
Transgelin3, un nouveau régulateur de la neuroinflammation, un biomarqueur et une cible thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer : validation préclinique dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
590 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la gravité sévère concernant la majorité d'entre elles. Elles reçoivent une injection de vecteur viral dans le cerveau puis passent jusqu'à sept tests comportementaux, certaines femelles subissant des prélèvements d'urine et des frottis vaginaux. Le modèle d'Alzheimer utilisé peut provoquer des crises d'épilepsie spontanées entraînant une mortalité anticipée. La plupart seront tuées pour analyse des tissus, dix femelles servant de stimulus social étant proposées à d'autres projets, et le porteur teste une thérapie génique ciblant un gène candidat, le Transgelin3.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative encore incurable, et dont l'apparition semble liée à des phénomènes d’inflammation dans le cerveau (ou neuroinflammation). Un nouveau gène candidat qui permet de réduire de façon sélective les phénomènes de neuroinflammation observés dans des cellules humaines dérivées de patients a récemment été identifié in vitro. Ce gène pourrait avoir des effets bénéfiques dans le contexte de la MA et ainsi représenter une nouvelle cible thérapeutique, ce qui doit maintenant être testévalidé in vivo. Ce projet va tester une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la MA : en augmentant l'expression de ce gène candidat par certaines cellules du cerveau, une diminution de la neuroinflammation devrait être observée. Les cellules ciblées par la thérapie génique sont ici les astrocytes, des partenaires clés pour la survie des neurones et des régulateurs de la neuroinflammation. Ce projet cherche à évaluer l’efficacité de cette stratégie thérapeutique, visant une meilleure régulation de la neuroinflammation sur les atteintes comportementales, dans un modèle transgénique souris de la MA. L’objectif est de prévenir/ralentir le développement de certains symptômes comportementaux, déficits mnésiques et altérations des cellules et du cerveau caractéristiques de la MA.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche translationnelle, de la compréhension des mécanismes fondamentaux à une application clinique chez l'humain. Ce projet doit déterminer le potentiel thérapeutique du gène candidat, et fournir des données précliniques en faveur de son ciblage chez les patients ou comme marqueur du développement de la MA. À long terme, l'objectif est d'identifier des potentiels médicaments induisant l’expression du gène candidat chez des patients atteints de la MA.
Procédures
Les souris recevront une injection intracérébrale de vecteurs viraux (environ 30 min de chirurgie par souris). Ces injections seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Après 1 mois minimum certaines souris passeront 7 tests de comportement (qui visent à évaluer la mémoire, la sociabilité, l’anxiété et l’anhédonie des souris (tests de 5 à 10 min chacun) ; en 2 sessions de 4-5 semaines et 2 semaines respectivement, en laissant 2-3j de repos entre chaque test, les 2 sessions étant espacées de 3 mois). Ces tests sont peu stressants. Certaines femelles seront prises en contention pendant 1 à 2 minutes pour prélever leur urine et réaliser un frottis vaginal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole sont les suivantes : douleur liée à la chirurgie intracérébrale et faible stress lié aux test comportementaux. Douleur et stress seront pris en charge et réduits au minimum par des procédures adaptées (analgésie, anesthésie et habituation à l’expérimentateur, respectivement) Enfin certaines souris modèle de la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des crises d’épilepsies spontanées très brèves (de 5 à 30 sec de durée) et assez peu fréquentes (1 par semaine en moyenne) entre 1 et 3 mois d’âge, qui peuvent conduire à une mortalité anticipée, sans que le bien-être des animaux semble altéré entre les crises, car les souris qui présentent une crise d’épilepsie soit en meurent immédiatement, soit s’en remettent immédiatement et sans anomalie mesurable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés (à l’âge de 3 ou 10 mois) par des méthodes adaptées et validées, pour analyse post mortem complète des tissus. 10 souris femelles « sauvages » servant de stimulus pour les tests de comportement d’interaction sociale, n’ayant pas reçu d’injection ou de chirurgie seront proposées pour utilisation dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets anti-inflammatoires bénéfiques du gène candidat dans le contexte de la MA. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre cellules. Ces interactions ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris modèles de la MA qui reproduisent de nombreux symptômes de la MA. Ces modèles permettent d’étudier les cellules cérébrales dans leur environnement normal, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui joue un rôle clé pour moduler l’inflammation dans le cerveau. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre l’’évaluation des symptômes cliniques très invalidants pour les patients MA (ex. déficits mnésiques, anxiété), ainsi que leur potentielle restauration par notre stratégie thérapeutique. Ces symptômes cliniques ne peuvent pas être reproduits dans un modèle ne représentant que partiellement un organisme. Au final, seules une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe nous permet de faire la preuve de l’intérêt thérapeutique de notre stratégie, dans une approche translationnelle de validation préclinique.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 590 souris nées dans notre élevage ou provenant d’un fournisseur agréé . Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Chaque animal sera analysé de manière approfondie, pour obtenir plusieurs mesures biologiques d’intérêt par animal ( certaines souris auront chacune 7 tests comportementaux suivie d’une analyse biochimique ou de biologie moléculaire post-mortem. Ceci permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires et d’obtenir le plus d’informations pertinentes pour un même animal. Les mâles et les femelles de l’élevage seront utilisés, pour étudier un éventuel effet du sexe. Tous les animaux nés de l'élevage seront ainsi utilisés dans cette étude.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe dans un milieu enrichi, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettront de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des animaux à l’expérimentateur une semaine avant chacune des sessions de tests comportementaux permet de réduire le stress des animaux à la manipulation.
Choix des espèces
Les souris modèles de la MA permettent d’étudier les interactions entre cellules cérébrales dans le contexte génétique de la MA. Elles présentent des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de MA. Elles seront étudiées à l’âge adulte, à différents stades de la pathologie, la MA étant une maladie se déclarant chez l’adulte et évoluant de façon très progressive.
Régime obésogène péri-adolescent : effets délétères sur la mémoire sociale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, sur cinq ans. Nourries dès le sevrage d'un régime gras, elles subissent des tests comportementaux, jusqu'à six injections intrapéritonéales, une chirurgie du cerveau et un stress aigu par choc électrique appliqué jusqu'à deux fois, pour étudier l'effet de l'alimentation adolescente sur la mémoire sociale. La plupart seront tuées pour analyse du cerveau, une partie non quantifiée pouvant être réutilisée dans d'autres projets. Le porteur affirme que ces tests sur animal vigile sont une "nécessité expérimentale" impossible à remplacer par des approches cellulaires.
Objectifs
Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabète …), elle est également associée des déficits de mémoire. Nous avons récemment mis en évidence chez le rongeur que la consommation de régime riche en graisse pendant l'adolescence perturbe la mémoire dépendante de l'hippocampe, et en particulier la mémoire sociale. Nous avons également pu montrer que ces déficits semblaient être dus à une hyperactivité des neurones de l’hippocampe. L'objectif du présent projet est d’approfondir notre compréhension des effets de la consommation d'une nourriture riche en graisse pendant l'adolescence sur l’hippocampe et la mémoire. Nous souhaiterions nous pencher plus précisément sur la mémoire sociale chez la souris. L’olfaction de la souris étant primordiale dans la fonction sociale, nous souhaitons étudier en particulier les potentiels déficits de mémoire olfactive sociale des animaux nourris par un aliment riche en graisse. Nous nous pencherons plus particulièrement sur une zone précise de l'hippocampe pour son importance dans la construction de la mémoire sociale.
Bénéfices attendus
A l’heure où la prévalence de l’obésité juvénile est en forte hausse dans les sociétés industrialisées, comprendre pourquoi la consommation d’un régime obésogène à l’adolescence entraîne des perturbations de mémoire à l’âge adulte est important. En effet, avoir une vue d’ensemble des modifications physiologiques et neurologiques que ces régimes entraînent permettra à terme de mieux encadrer les patients, surtout lorsqu’on sait que prise alimentaire et fonctions cognitives et mnésiques sont intimement liées.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux, éventuellement précédées d'injections intra-péritonéales lorsque cela est nécessaire, et cela dans une limite de 6 fois. La majeure partie des tests comportementaux durent de 5 à 10 minutes par jour et par souris, mais certains tests effectués plus rarement peuvent durer jusqu'a 30 minutes. Les animaux auront un repos d'au moins 24h entre chaque injection. Certains animaux devant servir de démonstrateurs pour tests sociaux seront positionnés dans des petites cages de 4500 cm3, mais dans un maximum de 45min par jour pendant 2 jours. Certains animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique, d'une durée de 30 à 45 minutes. La recupération se fait sur deux à quatre jours. Afin de regarder l'impact du stress sur l'activité cérébrale et les capacités de mémoire en relation avec la diète, les animaux seront soumis à un stress aigu, un maximum de deux fois.
Impact sur les animaux
L’aliment riche en graisse et en sucre donné pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme c’est le cas dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. Le choc électrique pourra entraîner un stress aigu qui peut se poursuivre pendant 1 à 2 jours, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur le poids des animaux.
Devenir
La majeure partie des animaux, en particulier ceux ayant subi une injection stéréotaxique, seront euthanasiés car leur cerveau doit être récupéré pour analyses histologiques et biochimiques. Les animaux ne nécessitant pas de perfusion intracardiaque seront réutilisés lorsque cela est possible (nombre difficile à quantifier car dépend des besoin des autres chercheurs du laboratoire), ou euthanasiés sans récupération de matériel dans le cas contraire.
Remplacement
L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Le rôle primordial de l'olfaction dans les fonctions sociales chez la souris sera tout particulièrement exploité dans notre étude, et les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements innés chez les rongeurs. Les approches pharmacologiques et biochimiques permettent, elles, d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents, et de réduire les souffrances inutiles. En minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables, nous estimons que 800 souris seront nécessaires afin de mener à bien le projet. Cela correspond à une durée de 5 ans.
Raffinement
Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi dans une animalerie agrée comportant une régulation de la température et de l’hygrométrie. De plus, une analgésie adaptée sera utilisée pour chaque procédure expérimentale.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les approches pharmacologiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales. De plus, les outils génétiques dont nous disposons pour la souris permettent de cibler les zones cérébrales et types cellulaires que nous souhaitons étudier. Les souris sont maintenues en cage collective (3 à 10 par cage) dès le sevrage. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou standard dès le sevrage (3 semaines) et ce pendant 12 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusquà l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Après 12 semaines de régime HL, les souris seront intégrées dans les différentes procédures expérimentales. Les animaux soumis à un régime contrôle seront également testés à l'âge adulte afin de garantir la comparatibilité des résultats
Evaluation thérapeutique de la cytokine IL34 dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié subit une chirurgie de pose de mini-pompe, une partie un gavage quotidien pendant dix jours, et toutes un suivi locomoteur alors qu'elles développent la paralysie du modèle de sclérose latérale amyotrophique. Les souris atteignant 20 % de perte de poids ou une paralysie sévère seront mises à mort avant le terme. Le porteur teste l'effet d'une cytokine, l'IL-34, et affirme que la complexité de la réponse immunitaire ne permet pas de s'en tenir à des études in vitro.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA ou Maladie de Charcot) est une maladie neurodégénérative progressive qui affecte les neurones moteurs dans le cerveau et la moelle épinière. La dégénérescence de ces neurones conduit à terme à une paralysie et au décès par insuffisance respiratoire. La SLA intervient à la fois sous des formes sporadique et familiale qui sont similaires sur les plans clinique et pathologique. Il existe un modèle de souris transgéniques qui développent des symptômes assimilés à la sclérose latérale amyotrophique. L’objectif de ce projet est d'étudier le potentiel thérapeutique de l'Interleukine (IL)-34 dans ce modèle préclinique murin de sclérose amyotrophique latérale. Nous analyserons l’effet de cette protéine sur la progression de la pathologie, sur la survie des souris atteintes, et sur les épisodes neuro-inflammatoires et neuro-dégénératifs observés dans cette maladie.
Bénéfices attendus
Effet protecteur de l'IL34 sur le développement et la sévérité de la pathologie.
Procédures
- Procédure chirurgicale pour l'installation de mini-pompes sur la moitié des souris (30 minutes par souris). -Gavage quotidien sur la moitié des souris pendant 10 jours. - Prise de poids et tests locomoteurs quotidiens pendant 15 jours
Impact sur les animaux
Perte de poids, mobilité réduite (paraplégie/paralysie) et stress associés à la pathologie. Gêne et stress associés à la pose de la mini-pompe.
Devenir
Les souris seront euthanasiées 10 jours après le début du traitement ou à l'atteinte de points limites. Des prélèvements sanguins et post-mortem (moelle épinière, cerveau, rate) seront effectués sur l'ensemble des animaux afin de réaliser une analyse comparative entre les groupes, et ainsi évaluer les effets de l'IL34 sur les réponses immunitaires et inflammatoires intervenant dans ce modèle.
Remplacement
La nature de cette étude ne permet pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux ; le même niveau d’information ne pouvant être apporté par des études in vitro ou in silico (simulation informatique), étant donné la complexité de la réponse immune. De plus, l'IL-34 est une cytokine exprimée par différents types cellulaires dont la fonction n'est pas encore entièrement connue dans tous les tissus. Les modèles in vivo permettent donc de prendre en compte ces différents aspects.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Nous estimons que 5 animaux par groupe est le nombre minimal requis pour obtenir des résultats significatifs et que trois expériences indépendantes au minimum sont nécessaires pour rendre robuste la validation des résultats. A partir de l'ensemble des données obtenues, des tests statistiques appropriés seront réalisés pour émettre des conclusions quant aux résultats observés. Si à l’issu de ces expériences, la différence entre les groupes est clairement validée, les expériences concernant ce protocole seront arrêtées. Si en revanche, une tendance à une différence entre les groupes est observée mais qui nécessite d’être validée, de nouvelles expériences pourront être menées afin d'augmenter la significativité des résultats (3 au maximum).
Raffinement
Durant le protocole, les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement général, pour la prise de poids et pour évaluer le score clinique locomoteur selon l'échelle définie. Plusieurs types d'enrichissement (nestlets, tunnels en carton et buchettes en peuplier) seront apportés pour réduire le stress des animaux, pour permettre aux souris présentant des signes sévères de s'isoler et pour réduire l'agressivité des congénères les plus actifs. Les souris seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement. Les animaux atteignant une perte de poids de 20% par rapport à leur poids initial seront euthanasiés, ainsi que les animaux montrant une paralysie sévère (score 4=score final). Tous les animaux seront analysés afin d'en obtenir un maximum d'information post-mortem, au niveau anatomopathologique pour les lésions des motoneurones au niveau de la moelle épinière et de certaines régions du cerveau, et par immunohistologie pour étudier l'infiltration des cellules dans les tissus inflammés.
Choix des espèces
Le modèle de souris transgéniques surexprimant SOD1 développent des symptomes assimilés à la sclérose latérale amyotrophique. C'est un modèle qui est bien caractérisé dans la littérature. Les souris seront utilisées juste avant l'apparition des symptômes, soit vers 140jours+/-10j.
Neurostimulation des voies dopaminergiques in vivo par des ultrasons de basse énergie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, dans une chirurgie du crâne de trois à quatre heures. Elles reçoivent une stimulation cérébrale par ultrasons de basse énergie pendant qu'une microélectrode mesure la libération de dopamine, pour vérifier si ces ultrasons excitent bien les neurones in vivo. Le porteur affirme que la technique a déjà été testée in vitro et sur des explants, et que l'étape chez l'animal est "nécessaire" avant tout passage chez l'homme. Les retombées annoncées pour la maladie de Parkinson restent renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons de basse énergie (low-energy ultrasound ou LEUS) est une méthode prometteuse pour stimuler des régions cérébrales de façon non-invasive et avec grande sélectivité spatiale limitée à quelques mm3 de tissu nerveux. La neurostimulation par les LEUS a déjà été testée chez l’animal, et a été capable d’évoquer des mouvements des membres, des vibrisses chez le rongeur, voire des yeux. Cependant, les effets cellulaires des LEUS et les mécanismes biologiques de cette stimulation demeurent largement inconnus. Un verrou important consiste à comprendre comment les LEUS affectent la neurotransmission, le mécanisme fondamental par lesquels les neurones libèrent des neurotransmetteurs et transmettent des signaux chimiques à leurs voisins. In vitro, les LEUS sont capables d’induire des libérations de calcium intracellulaire et d’évoquer une libération de dopamine par des neurones en culture. Cependant, la pertinence de ces effets in vivo au sein d’un cerveau intact reste inconnue. Ce projet se focalisera sur les neurones dopaminergiques de la souris. La libération de dopamine peut être monitorée en routine par la technique de voltamétrie cyclique rapide à l’aide de microélectrodes en fibre de carbone. L’objectif de ce projet est de tester in vivo l’hypothèse selon laquelle la stimulation par LEUS des voies dopaminergiques induit une libération de dopamine dans le cerveau, démontrant ainsi que les LEUS ont bien la capacité d’exciter les neurones in vivo et de stimuler la libération de neurotransmetteur.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet permettra d'évaluer le potentiel des LEUS pour stimuler le cerveau de façon non invasive et localisée. Il s’agira de la première évaluation de ce type in vivo et cette approche apportera des informations cruciales sur les mécanismes biologiques mis en jeu par la stimulation par LEUS dans le cerveau. Il existe déjà des pathologies neurologiques humaines dont les traitements utilisent la neurostimulation. Par exemple, les patients atteints de maladie de Parkinson et ne répondant plus aux traitements pharmacologiques peuvent recevoir une électrode de stimulation pour compenser la perte de dopamine dans leur cerveau. D’autre pathologies humaines pourraient bénéficier d’une approche thérapeutique par neurostimulation mais les développements de ces thérapies sont limités par les risques liés à l’implantation d’électrodes invasives dans le cerveau. La technique de neurostimulation par LEUS pourrait offrir une alternative prometteuse pour remplacer les méthodes de neurostimulation invasive dans la maladie de Parkinson et peut-être ouvrir la voie vers de nouvelles thérapies à base de neurostimulation chez l'homme.
Procédures
Procédures chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sans réveil d'une durée de 3-4 h.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales seront effectuées sur l’animal anesthésié sans réveil. Les protocoles de stimulation cérébrale par LEUS ne causent aucune douleur, ni perte de poids, ni stress puisque les stimulations, préalablement testées sur des cultures cellulaires et in vivo, seront calibrées et de courte durée. L’anesthésique utilisé permettra de couvrir la durée nécessaire aux expériences à réaliser. Les effets indésirables sur l’animal se limitent donc à des problèmes d’anesthésie pouvant provoquer un réveil de l’animal lors de son positionnement dans l’appareil stéréotaxique ou en cours d’enregistrement, ce qui reste rare.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de chirurgie car le réveil de l'animal après une chirurgie du crâne entrainerait des souffrances inutiles.
Remplacement
La technique de neurostimulation par LEUS a déjà été testée in vitro sur des neurones en cultures ainsi que sur des explants de cerveau. L'étape in vivo chez l'animal est maintenant nécessaire avant de passer chez l'homme afin de vérifier l'efficacité de la stimulation et son innocuité.
Réduction
Les effectifs des groupes ont été réduits au maximum afin de permettre une mise au point sérieuse des procédures : 10 souris pour la mise au point de la détection de dopamine, 10 souris pour la mise au point des paramètres d'angulation des électrodes, 20 souris pour l'optimisation des paramètres de la stimulation LEUS. Nous pourrons procéder à des comparaisons statistiques de différents paramètres de stimulation par LEUS à l'aide d'un test de Student ou d'une ANOVA à partir d'un effectif de 6 animaux par groupe. Par exemple, la comparaison entre les paramètres LEUS optimaux et la stimulation électrique de référence pourra être menée à bien avec ces effectifs.
Raffinement
Concernant la douleur, un traitement analgésique est prévu avant la chirurgie avec une injection sous-cutanée de buprenorphine (0.02 mg/kg) et une administration locale de lurocaïne sur le scalp, pratiquées avant l’incision de la peau. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale par l'isoflurane et en appliquant les points limites définis par (1) une défaillance du système d'anesthésie pouvant conduite au réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hemorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (roue d’exercice, matériau de nidification).
Choix des espèces
La souris est une espèce qui a été largement caractérisée pour la libération de dopamine dans le noyau Accumbens évoquée par une stimulation électrique de faisceau médian du télencéphale. Les procédures permettant de réaliser cette mesure ont été décrite dans la littérature et serviront de base à notre approche expérimentale. Souris adultes pour bénéficier d'une taille maximale.
Identification de marqueurs moléculaires sanguins de la maladie dans un modèle murin de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation d'alpha-synucléine agrégée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie, pour accélérer une pathologie proche de la maladie de Parkinson et chercher des marqueurs de la maladie dans leur sang. Le porteur indique que les souris développent une démarche saccadée et des troubles de l'équilibre, signes à l'apparition desquels elles sont tuées avant que ne survienne une paralysie du train postérieur. Sur le remplacement, il affirme que le projet ne peut être réalisé qu'in vivo et qu'il n'existe "pas de méthode alternative" à l'expérimentation animale.
Objectifs
Le projet vise à identifier des marqueurs moléculaires de la maladie dans le sang de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable du vivant de l’animal et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.
Procédures
Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 48 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.
Impact sur les animaux
L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin d’accélérer l’apparition des signes cliniques moteurs, qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet développent des signes cliniques lors de leur vieillissement qui conduiraient irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.
Remplacement
Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à rechercher des biomarqueurs dans le sang. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
Réduction
Dans le cadre de cette étude pilote, les nombres de 12 animaux par lot sont déterminés afin de permettre la collecte d’une quantité de sang suffisante chez au moins 8 souris, pour isoler une quantité suffisante de vésicules extracellulaires d’origine neuronale. Concernant la détection d‘alpha-synucléine pathologique dans les vésicules extracellulaires neuronales, le test t de Student bilatéral non apparié et l'ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak seront appliqués. Concernant les analyses des microARN, les tests P-value, test exact de Fisher et FDR (False Discovery Rate) seront utilisés.
Raffinement
Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée chez un animal soumis à une anesthésie générale, permettant de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé et maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de dépilations qui peuvent être observées chez quelques souris femelles au delà de l’âge de 7 mois. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort, afin d’éviter des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, espèce qui peut être modifiée génétiquement pour produire une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. L’expresssion de cette protéine dans cette espèce permet l’accélération de la maladie après inoculation d‘alpha-synucléine agrégée. Les souris sont adultes lors de l’inoculation, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie par perfusion intra-cardiaque sans réveil afin de pouvoir réaliser des prélèvements de sang.
Etude de traitements pharmacologiques du syndrôme de Alport sur modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
140 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un gavage quotidien sous contention pendant 30 jours, puis une injection rétro-orbitaire d'un fluorochrome et deux heures de mesure de la fonction rénale, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs reins. Le projet teste des médicaments censés stimuler l'activité d'un gène impliqué dans une maladie rénale génétique, la maladie d'Alport, et le porteur affirme viser un traitement pour une maladie aujourd'hui sans traitement pharmacologique. Il décrit un modèle où les souris ne présentent pas de symptômes douloureux et conclut que le recours à la souris est "absolument nécessaire" pour reproduire un processus "difficile, voire impossible" à récapituler in vitro.
Objectifs
Nous étudions un gène qui joue un rôle important dans la morphogenèse du rein ainsi que le maintien des fonctions rénales chez l’adulte. Chez l’homme, des mutations dans ce gène sont responsables de pathologies rénales diverses et graves comprenant des anomalies du développement rénal (dysplasie, hypoplasie) et des atteintes de la différenciation tubulaire plus tardive (kystes). Il s’avère que nous avons constaté que le développement des dysfonctionnements liés à l'apparition d'une maladie rénale, en générale, s’accompagne par une profonde diminution de l'activité de notre gène d'étude. Nous émettons donc l’hypothèse qu’une partie des dysfonctionnements observés dans l'insuffisance rénale chronique puissent être expliqués par la baisse soudaine de l’activité de notre gène. Nous allons tester cette hypothèse en traitant des souris qui soufrent d'insuffisance rénale par des médicaments qui stimulent l'activité de notre gène d'étude.
Bénéfices attendus
Le bénéfice susceptible de découler de ce projet est le développement et la validation d'un nouveau traitement pour une maladie génétique qui n'a pas de traitements pharmacologiques disponibles. Nous attendons pouvoir mesurer l’effet du traitement par ces médicaments sur le degré d’avancement du disfonctionnement rénal. Ces mésures seront effectué par 1) analyse d’image de sections histologiques (quantification de fibrose interstitielle par analyse de coupes histologique coloré au Sirius Red et PAS) 2) par mesure de la fonctione rénale en se basant sur la clearence de la sinistrine. 3) par mesure de l'expression génique liée au dysfonctionnement rénal dans l'ARN rénal.
Procédures
Nous allons traiter 140 souris males. Chaque souris sera soumise à un gavage quotidien pendant 30 jours (en état vigile en contention) d'un médicament (ou du placebo). Chaque procédure de gavage va durer moins de 2 minutes. A la fin des traitements, une injection retrorbitale d'un fluorochrome pendant moins d'une minute. Une mesure de la fonction rénale sera effectuée avec un photodiode pendant la durée de deux heures.
Impact sur les animaux
En dépit de la présence d'une insuffisance rénale progressive liée à un défaut génétique, au stade du developpement de la maladie qu'on étudie dans ce protocole, les souris ne souffrent pas de nuisances évidentes. D’autre part, pour ce qui concerne les médicaments qu'on doit tester, des études récentes ont montré que ces composés, administrés par gavage à ces doses, ne provoquent pas de conséquences visibles sur le bien-être des animaux. Les souris seront exposées au stress lié à un gavage quotidien pendant 30 jours.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce protocole seront mis à mort à la fin de procédure. En effet, le prélèvement des reins nécessite la mise à mort des souris.
Remplacement
Remplacement : La complexité du rein et de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais les molécules à l'étude de ce protocole ont préalablement été testées sur des cultures cellulaires ce qui nous permet d’envisager une gamme d’efficacité sans toxicité pour les animaux.
Réduction
Réduction : nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. En effet, nos résultats antérieurs ont montré que le nombre d'animaux qu'on a choisi pour effectuer nos expériences nous garantit que par rapport à l’effet biologique attendu, la variabilité expérimentale qui inévitablement va accompagner nos mesures, va nous permettre d’atteindre une puissance statistique suffisante pour pouvoir tirer une conclusion scientifiquement acceptable. Le test statistique adopté sera le ANOVA.
Raffinement
Comme chez l’homme, les maladies rénales restent longtemps silencieuses et le modèle murin qu'on va adopter ne comporte pas de souffrance spécifiquement liée à la déficience rénale. En tout cas, les animaux seront mis à mort avant l’apparition de symptômes douloureux. Une surveillance quotidienne sera effectuée auprès des animaux afin de s’assurer de leur bien-être constant en se référant à une grille de points limites. Pour compléter cette surveillance les souris seront pesée chaque jour pendant le traitement. Si les souris dépassent un niveau de score 1 pour l'évaluation de leur apparence physique ou de leur comportement, on mettra en place l’administration d’un antalgique. En cas d'atteinte d'un point limite, on choisira la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le développement de l'insuffisance rénale dans les modèles murins représente un excellent modèle experimental qui se rapproche de celui de l'homme. En effet, en néprologie experimentale, la souris représente l' animal le plus adapté pour ce qui concerne l'études des organismes génétiquement modifiés. La complexité du système étudié (la fonction rénale) est très importante. L'utilisation d’un modèle animal est absolument nécessaire car il nous permettra de démontrer l’efficacité de certains médicaments pendant le développement des lésions rénales, un processus hautement complexe qu’il est difficile, voire impossible, de récapituler in vitro. De plus, le développement des lésions rénales chez la souris Alport est un excellent modèle expérimental qui se rapproche de celui de l'homme. Le traitement des souris sera effectué à partir du 30eme jour après la naissance, à un stade de developpement de la maladie assez précoce où les lésions rénales sont à peine visibles. Normalement, ce modèle génétique va developper des lésions rénales plus sévères 1 mois après le début du traitement pharmacologique. En fin de traitement (au 60eme jour après leur naissance), la fonction rénale sera mesurée et par la suite les mâles seront mis à mort par dislocation cervicale et les reins prélevés pour analyse histologique (par une coloration des coupes histologiques en PAS et SyrusRed) et d’expression génique. Le traitement des souris sera effectué à partir du 30eme jour après la naissance, à un stade de developpement de la maladie assez précoce où les lésions rénales sont à peine visibles. Normalement, ce modèle génétique va developper des lésions rénales plus sévères 1 mois après le début du traitement pharmacologique. En fin de traitement (au 60eme jour après leur naissance), la fonction rénale sera mesurée et par la suite les mâles seront mis à mort par dislocation cervicale et les reins prélevés pour analyse histologique (par une coloration des coupes histologiques en PAS et SyrusRed) et d’expression génique.
Efficacité thérapeutique anti-tumorale de la combinaison entre un inhibiteur de topoisomerase 1 et un inhibiteur de la voie PARP sur une lignée cellulaire de cancer du sein HER2+ chez la souris immunodeficiente et PARP
- Recherche appliquée
- Cancers
194 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou deux greffes de tumeurs mammaires puis des injections et des administrations orales répétées de médicaments, pour tester une combinaison de deux molécules contre le cancer du sein HER2+. Le porteur affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas compte du microenvironnement tumoral, rendant selon lui le modèle in vivo "indispensable". Toutes les souris sont porteuses de tumeurs et euthanasiées pour analyse des tissus.
Objectifs
Les anticorps conjugués aux médicaments sont une classe émergente de produits thérapeutiques en oncologie. Ils sont capables de délivrer une concentration élevée de molécule thérapeutique spécifiquement aux cellules cancéreuses. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes d'action et de régulation de ces anticoprs conjugués et du médicament qui lui est liée. Ceci a pour objectif de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques qui allieront l'utilisation de ces nouveaux médicaments à d'autres traitements afin de potentialiser leurs effets. Dans ce contexte, nous étudions des combinaisons thérapeutiques de notre molécule dans le traitement du cancer du sein. Des résultats prometteurs obtenus sur des lignées cellulaires du cancer du sein, montrent que la combinaison de notre molécule avec un autre inhibiteur de croissance des cellules cancéreuses a un effet synergique. Ainsi, la combinaison de ces 2 molécules permettrait une amélioration de l'efficacité thérapeutique tout en limitant les doses d'anti-cancéreux administrés, donc les effets secondaires du traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera les caractérisations précliniques en vue de préparer l’étude sur des modèles de greffes de tumeurs de patientes puis l’étude clinique chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif.
Procédures
Injections de cellules : 1 à 2 par souris. Administrations de médicaments : 3 injections (1 fois par semaine pendant 2 semaines), durée 1 minute. Administration par voie orale 10 par animal (5 fois/semaine pendant 2 semaines). L'administration orale d'un animal dure 30 secondes.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la présence de tumeurs sur les flancs des animaux et aux administrations orales répétées de médicaments non toxiques aux doses utiliséees.
Devenir
En fin de procédures, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et pour pratiquer des analyses post-mortem sur certains tissus.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo et donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’efficacité de la moléculetestée seule et en combinaison afin de proposer le meilleur traitement aux patientes lors d’éventuelles futures études cliniques.
Réduction
Si le schéma de croissance tumorale le permet et que la croissance tumorale est rapide et homogène, il pourra être envisagé de greffer les animaux sur chacun des 2 flancs afin de réduire le nombre d'animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicaité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés pour chaque étape du projet.
Raffinement
Les souris sont greffées sous anesthésie générale par inhalation ou par anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limite précis ont été définis et seront strictement appliqués. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine. Le cancer du sein est un cancer de l'adulte. Les animaux seront donc utilisés à l'âge adulte.
Dexmedetomidine: nouvel agent anti-tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur puis des injections et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour tester si un anesthésique, la dexmédétomidine, freine la croissance tumorale. Le porteur affirme que ces effets multiparamétriques ne sont pas modélisables ailleurs que dans un "être vivant entier". Les tumeurs peuvent nécroser ou saigner, et toutes les souris sont euthanasiées pour analyse des tissus.
Objectifs
Des études rétrospectives ont suggéré un possible rôle anti tumoral des anesthésiques après observation d’une diminution de récidives métastasiques et une meilleure survie chez les patients ayant reçu ces produits. Le but du projet est donc d'étudier si un anesthésique utilisable en chirurgie oncologique induit une réponse anti-tumorale in vivo en diminuant la croissance tumorale et en augmentant la survie. C'est aussi de démontrer si les effets anti-tumoraux de cet anesthésique peuvent être potentialisés par les traitements anti-cancéreux conventionnels et en fin de démontrer si cet anesthésique diminue le stress glucocorticoïde. Le dernier objectif est de démontrer si les effets anti-tumoraux médiés par cet anesthésique, s'ils existent, impliquent une réponse du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Démontrer si l'anesthésique étudié pourrait être un nouvel agent anti-tumoral in vivo. Ce résultat pourrait amener à des essais randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement cet agent est utilisé comme complément analgésique per-opératoire et n'a aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique.
Procédures
Génération de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes) -traitement par injection (1 fois, durée 1 minute) -prélèvements sanguins sous anesthésie (2 fois, durée 3 minutes) -
Impact sur les animaux
Greffe et croissance de tumeurs (risque de nécrose intratumorale, voire de saignements intratumoraux).
Devenir
Euthanasie pour analyses sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Les effets des traitements anticancéreux seuls ou en association impliquent des processus multiparamétriques mettant en jeu des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro ou in silico, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que l'association dun anesthésique aux traitements anticancéreux conventionnels potentialiseraient la réponse anti-tumorale. . La compréhension de cette potentialisation et sa reproduction in vivo ouvriraient la possibilité d'associer systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction potentialisée des cellules tumorales résiduelles.
Réduction
Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de souris déterminés en nombres pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les réusltats seront analysés selon des méthodes de statistiques non paramétriques.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Nous souhaitons prouver l'efficacité d'une association de traitements anti-cancéreux afin d'augmenter la réponse anti-tumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitements. Le modèle souris est le modèle mammifère de choix en oncologie préclinique. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, mimant la population de patients.
Immunothérapie ciblant les lymphocytes T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales et de médicaments sous anesthésie, pour tester l'effet antitumoral d'un antihistaminique repéré lors d'un criblage. Le porteur décrit l'usage d'animaux vivants comme "indispensable", l'impossibilité de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro étant invoquée. Les tumeurs peuvent provoquer perte de poids et ulcérations, et toutes les souris sont euthanasiées pour analyse des tissus.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans une recherche qui vise à améliorer l'efficacité de la thérapie anti-tumorale utilisant certains lymphocytes. Nous avons effectué in vitro un criblage à haut débit sur 2100 composés afin d’identifier de nouveaux activateurs de lymphocytes. Nous avons ainsi identifié un antihistaminique. L'objectif du projet est d’évaluer l'effet antitumoral de cette molécule chez des souris immunocompétentes comparé à son effet sur des animaux immunodéficients. Nous étudierons également si l'efficacité de cette molécule peut être améliorée en présence de traitement d'immunothérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace dans plusieurs types de cancer. En cas de succès, cette stratégie pourra être utilisée pour améliorer la prise en charge des cancers humains.
Procédures
Injection une à cinq fois de médicaments sous anesthésie générale: durée 1 minute. Injections de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 1 minute. Imagerie in vivo (luminescence) pour un type tumoral, une fois sous anesthésie générale, durée 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations (contentions, injections) peuvent induire du stress à l’animal ainsi qu’une légère douleur au site d’injection.. La croissance tumorale, la chimiothèrapie et l'immunothèrapie peuvent induire une perte d’appétit et donc une perte de poids. La croissance tumorale peut engendrer l’apparition d'ulcérations ou infection au site de la tumeur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem de tissus et d'organes.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car, ce projet visant à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, ne peut qu’être effectué chez l’animal en raison de l'impossibilité de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo à la limite des technologies actuelles.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été déterminé rationnellement par calcul de puissance. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris déterminés pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés (test ANOVA pour comparer l’effet étudié entre les groupes). Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests et maisons en carton ou tunnels). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par le fait que la souris est le modèle le plus couramment utilisé et admis en cancérologie prélinique. Les souris âgées de 6-8 semaines (18-20g à la livraison) seront utilisées dans ces études. A ce stade de développement, le système immunitaire est à maturité. Ceci correspond à la population de patients visée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (6-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.
Etude de l’effet de la fibrose sur la croissance du cancer du poumon
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
Opérées sous anesthésie générale pour qu'une molécule provoquant une fibrose pulmonaire leur soit injectée dans la trachée, après incision de la peau, puis intubées deux semaines plus tard pour recevoir des particules virales qui déclenchent un cancer du poumon, 640 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet doit établir si la fibrose favorise la croissance de ces cancers, plus fréquents chez les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique. Le porteur prévoit des difficultés respiratoires, une posture de repli et une perte de poids, sans nommer la molécule fibrosante, et tient compte dans ses effectifs d'un "risque de mortalité si les points limites sont atteints". Toutes sont tuées à trois temps différents pour le prélèvement de leur sang et de leurs poumons.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique grave, entrainant la mort en 3 à 5 ans. La fibrose est la formation d'une quantité anormalement abondante de tissu cicatriciel. La cause et les mécanismes qui sous-tendent le développement et l’évolution de cette maladie dans le poumon sont inconnus. Elle se manifeste par une perte d’élasticité du tissu de soutien pulmonaire, résultant en une altération des échanges entre les alvéoles contenant l’oxygène et les vaisseaux sanguins. Le poumon devient progressivement trop abimé pour assurer l'oxygénation du sang et le patient développe une insuffisance respiratoire chronique conduisant au décès. Les médicaments disponibles sont uniquement capables d’en ralentir la progression. Ces traitements permettent d'augmenter la survie de ces patients mais on peut craindre l’apparition de cancer du poumon. En effet, les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus susceptibles de développer des cancers du poumon. Avec l'émergence de nouveaux traitements prometteurs contre la fibrose pulmonaire, il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes favorisant la survenue de ces cancers, menaçant potentiellement les patients atteints de fibrose pulmonaire. Les mécanismes conduisant à l'apparition du cancer chez les patients FPI sont encore mal connus. Notre hypothèse est que la fibrose va favoriser la croissance des cancers chez ces patients atteint de fibrose pulmonaire. Nous étudierons des souris génétiquement modifiées pour modéliser le développement du cancer pulmonaire dans le contexte de la fibrose pulmonaire. Ainsi, nous utiliserons des modèles de fibrose pulmonaire établis chez la souris, impliquant une injection au niveau de la trachée sous anesthésie générale de différentes molécules favorisant le développement de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
Les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus enclins à développer des cancers du poumon (une des formes de cancers les plus courantes et mortelles dans le monde). Nos travaux de recherche permettront d’identifier le rôle de la fibrose sur le développement de ces cancers afin 1) d'identifier de nouvelles thérapies potentielles et 2) de permettre une meilleure prise en charge de ces patients fragiles.
Procédures
En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Deux semaines plus tard, les souris recevront une injection unique de particules virales qui activera la formation du cancer du poumon. L’injection se fera via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale gazeuse (durée de la procédure: 5 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Il faut noter que l'induction de la fibrose pulmonaire et d'éventuelle lésions cancéreuses chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général (posture de repli...) avec perte de poids. Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers associés à la fibrose pulmonaire.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des modèles alternatifs comme des cultures d'alvéoles pulmonaires reconstituées en laboratoire ou de tranches de poumon. Cependant, ces méthodes alternatives ne permettent pas de modéliser la réponse d’un organe entier vivant dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire et du cancer du poumon.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.
Raffinement
1) Surveillance quotidienne: nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. 2) Surveillance clinique en lien avec les procédures: les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement en préopératoire. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur et permettra de détecter une éventuelle souffrance. Selon la grille de surveillance mise en place, la douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques si nécessaire. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront également suivies de manière rapprochée. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés (des antalgiques seront administrés avant l’euthanasie).
Choix des espèces
Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte. Le modèle murin est pertinent du fait de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme.
Etude du rôle de l’activité neuronale dans les interactions neurone-glie aux noeuds de Ranvier dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures classées sévères et 406 modérées. Elles subissent des injections dans la moelle épinière et la pose d'une fenêtre spinale, la procédure sévère tenant à l'isolement des animaux pendant deux semaines au maximum après cette chirurgie, pour étudier la réparation de la myéline dans la sclérose en plaques. Le porteur affirme travailler d'abord in vitro et ex vivo mais juge le modèle murin in vivo "nécessaire" pour étudier la démyélinisation dans un contexte intégré. Les 60 souris imagées ne sont pas réutilisables et toutes sont euthanasiées pour analyse des tissus.
Objectifs
La Sclerose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central. Elle conduit au ralentissement (ou au blocage) de la conduction de l’influx nerveux et à des lésions axonales irréversibles à l’origine d’un handicap permanent. Les nœuds de Ranvier, qui permettent la propagation rapide de l’influx nerveux, sont désorganisés lors de la démyélinisation. Lors de la réparation, la mise en place de ces domaines peut précéder la remyélinisation. Les cellules gliales présentes dans l’environnement direct des nœuds (cellules oligodendrogliales, microglie, astrocytes) ont un rôle prépondérant dans la réparation. Comprendre le rôle des interactions entre structures nodales et cellules gliales est une étape majeure pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la remyélinisation et favoriser le développement de thérapies visant à promouvoir la réparation dans la SEP. Objectifs du projet : Caractériser les interactions entre cellules gliales et domaines nodaux, ainsi qu’évaluer l’impact de ces interactions sur la remyélinisation et la neuroprotection. Nous souhaitons notamment étudier comment l’activité neuronale peut influencer les fonctions gliales associées à la remyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étudier les phénomènes d'intérêt dans l'organisme entier et ainsi compléter et valider des résultats récemment obtenus in vitro et ex vivo. Il nous permettra de mieux comprendre l'impact de l'activité neuronale sur l'interaction neurone-glie aux nœuds de Ranvier et sur ses rôles en condition physiologique et lors de la remyelinisation. Il implique notamment des études sur tissu fixé (immunofluorescence), de l'imagerie en temps réel et le prélèvement de tissus frais pour réaliser des études transcriptomiques. La découverte des effets bénéfiques de l'activité neuronale sur la réparation pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Certains animaux seront soumis à des procédures chirurgicales sous anesthésie générale (injection(s) focale(s) au niveau de la moelle épinière dorsale (durée maximale de 15 min) et/ou pose d’une fenêtre spinale (durée maximum : 1h30). Tous les animaux soumis à une procédure chirurgicale reçoivent une prise en charge analgésique adaptée. Certains animaux recevront une injection intrapéritonéale pour activer les récepteurs modulant l’activité neuronale (durée de la manipulation de l’ordre de la minute). Certains animaux seront imagés sous anesthésie (durée maximum : 3h). Les animaux euthanasiés le sont afin de pouvoir prélever et analyser les tissus d’intérêt.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter des signes de douleur ou tiraillement post-chirurgie, qui ne doivent pas persister après 48h post-opératoire. Un inconfort temporaire lors du réveil après anesthésie (de l’ordre de la demi-heure maximum). La procédure d’injection du CNO par voie intrapéritonéale peut générer un stress et une douleur très localisée liée à la contention et l’injection. Ces effets doivent disparaitre de l’ordre de la minute après injection. Enfin, la procédure classée comme « sévère » l’est car les animaux sont isolés après la pose de la fenêtre spinale (durée maximale de conservation des animaux inférieures à 15 jours post-chirurgie
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés en fin de projet pour analyse de tissus post-mortem (406 animaux) ou après imagerie dynamique (60 animaux, non réutilisables pour un autre projet).
Remplacement
Dans un effort de remplacement et de réduction, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo. Cependent, les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car permettant d'étudier la demyelinisation et la remyelinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissu nerveux, effecteurs de l’immunité et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de cette pathologie.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés (nombre total pour le projet : 466), nous avons en première approche réalisé nos études autant que faire se pouvait in vitro et ex vivo, mais il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vivo, car les mécanismes étudiés peuvent être partiellement altérés dans les modèles in vitro. Des approches statistiques permettront de plus d’utiliser un nombre minimal d’animaux après des expériences pilotes et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul de puissance après utilisation initiale de 3 à 8 animaux par condition, selon l’expérience considérée. Les analyses statistiques des résultats obtenus seront adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, selon nos procédures standards. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Des traitements analgésiques sont donnés à titre préventif avant tout acte chirurgical. En cas d'observation de la persistance de douleur ou d’inconfort suite à l’opération, les souris recevront un traitement analgésique après consultation du concepteur et du vétérinaire (classiquement burpénorphine 0,05mg/kg, en sous-cutané deux fois par jour). Si des signes de douleur devaient persister (isolement social, poil hérissé, stéréotypie), les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines et ces modèles sont bien caractérisés. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proche de l'Homme. Par ailleurs, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. Pour ce projet, les animaux seront utilisés à deux stades différents : - Animaux âgés de 10-12 jours pour étudier la myélinisation dévelopmentale. - Animaux adultes pour étudier le tissu myélinisé et le processus de remyélinisation.
Impact de la température corporelle sur les complications cliniques du choc infectieux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Une ligature suivie d'une perforation du cæcum en trois minutes de chirurgie, ou une injection de contenu cæcal dans le péritoine : 496 souris adultes, munies d'une sonde thermique sous la peau, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour déclencher chez elles une septicémie. Les deux méthodes s'accompagnent d'un changement important de la température du corps, d'une perte de poids, de possibles diarrhées, d'une prostration et d'une activité sociale fortement altérée, avec une prise de sang par jour sous anesthésie gazeuse pendant les 48 premières heures. L'équipe veut contrôler leur température pour vérifier son hypothèse d'une fièvre bénéfique en cas d'infection, sur une espèce retenue parce que ces protocoles y sont "largement décrits dans la littérature scientifique", puis toutes sont tuées par surdose d'anesthésique gazeux pour prélever leurs organes. Le porteur ne mentionne aucun antidouleur, ni pour la chirurgie du cæcum, dont il ne précise pas l'anesthésie, ni pendant la septicémie.
Objectifs
Le choc septique est le dysfonctionnement des organes à la suited'une infection, impliquant une atteinte des vaisseaux sanguins et un changement de la température corporelle. Malgré les recherches et les travaux publiés ces dernières années, le rôle de la température sur ce dysfonctionnement est encore mal connu. Notre hypothèse est que la fièvre est bénéfique chez des souris atteintes d'infections. Dans ce projet, nous souhaitons contrôler la température pour étudier finement la dysfonction des organes lors d'un choc septique chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle que joue la température dans l'évolution du choc septique, et pourrait aider les cliniciens à mieux prendre en charge la température chez les patients en choc septique.
Procédures
Les souris seront implantées avec des sondes thermiques en sous-cutanée sous anesthésie (2 minutes par souris). Un modèle de septicémie sera induit chez ces souris au niveau du péritoine, soit par injection de contenu caecal dans le péritoine (simple injection péritonéale), soit par ligature et perforation du caecum par chirurgie (3 minutes par souris). Puis les souirs seront placées sous surveillance. Un prélèvement sanguin quotidien sera réalisé durant les 48 premières heures après une courte anesthésie gazeuse, afin de suivre les paramètres sanguins au cours du temps. Les souris seront euthanasiées par excès d'anesthésie gazeuse lors de la fin de l'expérience, et les organes seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les deux modèles sont associés à un un changement important de la température corporelle des souris, à une perte de poids, à des diarrhées possibles, à une prostration et à une activité sociale fortement alterée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés « afin de prélever les organes et le sang nécessaires pour l'étude que nous menons
Remplacement
Afin de tester les mécanismes moléculaires, des expériences in vitro seront menées indépendamment. Néanmoins, le remplacement total par la culture cellulaire n'est pas possible à ce jour car les expériences in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des intéractions moléculaires et physiologiques qui ont lieu dans un organisme comme l'homme ou la souris. Nous utilisons les modèles de péritonite afin de nous rapprocher au plus près des causes du choc septique chez l'homme, qui représentent la 1ere cause de mortalité dans le monde. A cet égard, aucune étude expérimentale chez l'animal n'a permis de contrôler finement la température corporelle dans un modèle de sepsis.
Réduction
Pour minimiser le nombre d'animaux, nous nous sommes basés sur des études préalablement publiées dans la littérature ainsi que sur des tests statistiques. Des résultats antérieurs fournissent des informations importantes concernant la mortalité, les modalités de modèles de sepsis, les temps d'étude etc. Ainsi, nous proposons d'utiliser 496 animaux au total. Cet effectif permettra d'approfondir les mécanismes de la septicémie en réponse à la température, tout en limitant l'étude.
Raffinement
Afin de minimiser le stress animal, les souris seront placées en groupe avec des éléments d’enrichissements comme des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés quotidiennement. La mise en place de nourriture humidifiée dans la cage sera faite une semaine avant le début du protocole pour éviter le stress. Nous mettrons en place une grille d'évaluation de la souffrance des souris pour suivre l'évolution de la maladie. Le poids, l'apparence, la conscience, l'activité physique, la réponse aux stimuli, les yeux, la respiration seront évalués pour suivre l’évolution de la maladie et intervenir par euthanasie lorsque les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Pour notre étude, nous avons choisi la souris car les modèles de choc septique que nous utilisons sont largement décrits dans la littérature scientifique chez la souris. De plus, de nombreux souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes pathologiques sont largement développés. Age adulte (2 à 3 mois). Nous utiliserons des souris adultes car les données de la littérature scientifique montrent que l'incidence de la péritonite est beaucoup plus importante chez l'adulte que chez l'enfant.