Souris

Sous anesthésie, chaque souris reçoit sous la peau du cou une minipompe osmotique qui diffuse son traitement pendant 28 jours, de la prolactine à haute dose quand il s'agit de mimer l'hyperprolactinémie et l'infertilité qui l'accompagne. Du 8e au 28e jour, les 168 souris, réparties en 24 groupes de 7 et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, reçoivent 21 ou 7 injections, quotidiennes ou tous les trois jours, pour tester un analogue de la kisspeptine produit par le laboratoire. Aux 11e et 20e jours, chacune subit des prises de sang en série, de 40 minutes avant à 600 minutes après l'injection, 16 prélèvements au total selon le porteur, chacun suivi d'un morceau de cookie. Il prévoit des douleurs, une perte de poids et une perte de mobilité possibles, qu'il dit anticiper par des analgésiques. Au 28e jour, toutes sont mises à mort par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour l'étude de leurs tissus fixés.

Objectifs

Dans certains contextes physiologiques, les taux de prolactine (une hormone produite par les cellules lactotropes situées dans l’hypophyse) augmentent induisant ainsi une infertilité permettant le bon déroulement des processus physiologiques associés (notamment lors de la grossesse ou des périodes d’allaitement). Cependant, des phénomènes pathologiques peuvent également induire une augmentation importante des taux de prolactine sanguine, avec des valeurs supérieures à 25ng/ml (contre 5 à 10 ng/ml en situation non pathologique) et induisant alors une hyperprolactinémie. Parmi les symptômes associés, la fonction de reproduction se retrouve être le principal processus physiologique impacté. A ce jour, l’hyperprolactinémie est principalement traitée par des agonistes dopaminergiques La reproduction est principalement contrôlée au niveau du système nerveux central, notamment grâce à la kisspeptine, un neuropeptide produit et sécrété par des neurones spécifiques de l’hypothalamus. De nombreuses études rapportent un lien fonctionnel entre la prolactine et la kisspeptine dans le cerveau. L’une d’entre elle a d’ailleurs mis en évidence l’inhibition drastique de l’expression de kisspeptine en cas d’hyperproduction de prolactine, ce qui réduit la sécrétion de l'hormone gonadotrophique (GnRH) et, ainsi, un hypogonadisme hypogonadotrophique et l’infertilité. Dans notre laboratoire, nous avons produit un analogue de la kisspeptine (ayant une demi vie plus importante que la kisspeptine endogène) et qui a déjà démontré des effets positifs sur la reproduction des animaux d’élevages et les rongeurs. Nous suggérons alors d’utiliser cet analogue de la kisspeptine dans le traitement de l’hyperprolactinémie en utilisant un modèle de souris dans laquelle les taux de prolactine seront très nettement supérieurs à la normale (à l’aide de mini pompes osmotiques délivrant de la prolactine à haute dose de façon continue, pour mimer la pathologie). Dans ce modèle, déjà utilisé dans d’autres études, l’augmentation de la production de prolactine mime ce qui est observé en cas d’hyperprolactinémie hypophysaires avec notamment l’absence de fertilité, l’inhibition de l’expression de la kisspeptine et la baisse importante de la sécrétion des hormones liées à la reproduction.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à utiliser notre analogue de la kisspeptine, comme traitement d’une pathologie affectant la reproduction, l’hyperprolactinémie. En termes de bénéfices, le présent projet permettrait ainsi d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de notre molécule dans le traitement d’une pathologie humaine (mimé par un modèle murin), qui pourrait, in fine, être appliqué à d’autres pathologies associées à un dysfonctionnement de la reproduction chez l’Homme.

Procédures

Les 168 animaux inclus dans cette procédure seront soumis, sous anesthésie, à la pose d'une mini pompe osmotique sous la peau de leur cou et diffusant le traitement souhaité pendant 28 jours. Ils seront ensuite soumis à des injections répétées, tous les jours ou tous les 3 jours, à partir du 8ème jour de diffusion du traitement par la minipompe et jusqu'au 28ème jour, correspondant à 21 ou 7 injections de traitements. Au 11ème et 20ème jour de diffusion du traitement, des prélèvements de sang sériés seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection du traitement puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements afin de doser la concentration plasmatique d'une hormone cible. Au 28ème jour de diffusion du traitement, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.

Impact sur les animaux

En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets tels que des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent être observés mais sont anticipées par l'injection d'analgésiques au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence.

Devenir

Afin de pouvoir réaliser des études immunohistochimiques sur tissus fixés, tout les animaux seront perfusés par la voie intracardiaque.

Remplacement

Il nous est impossible d'utiliser des modèles in vitro pour des études mécanistiques de ce type. L'étude de l'effet de l'analogue de la kisspeptine sur la fonction de reproduction en cas d’hyperprolactinémie nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu (effet de la molécule sur la sécrétion des hormones liées à la reproduction, effet sur l’expression de gènes cibles dans des tissus périphériques, …). Aussi, ce genre d’étude n’à, à ce jour, aucun équivalent qui n’emploi pas de modèle animal.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, nous aurons besoin de 7 animaux par groupes afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Avec la formation de 24 groupes nous aurons donc besoin de 168 animaux au total.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi, une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les chirurgies, injections ou prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements sanguins. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes), réalisées sur un tapis chauffant, des traitements seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction et les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront, in fine, de poursuivre avec des expérimentations sur l'espèce humaine et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse L'approche expérimentale nécessite un système reproducteur complètement développé et mature, les animaux employés devront donc avoir atteint la maturité sexuelle, avec un âge minimal de 9 semaines

Des souris de deux lignées génétiquement modifiées, porteuses de formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, la CMT2A et la CMT4H, présentent selon le porteur une dégénérescence des axones, des défauts de myéline et des troubles de la locomotion. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un classement qui cumule selon lui ce phénotype, les injections et les tests. Toutes reçoivent sous courte anesthésie gazeuse des injections de vecteurs viraux, dans l'espace intrathécal au niveau lombaire ou dans les muscles des pattes arrière, puis passent à 3, 6 et 12 mois trois ou quatre tests de démarche, de sensibilité des pattes et de force musculaire, à raison d'un par semaine. À l'issue de ces études comportementales, toutes sont mises à mort pour examiner les tissus atteints. Pour les souris qui se dégradent avant, le porteur écrit que des points limites "seront définis", sans en donner aucun.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester des approches de thérapie génique "ciblant le gène et le type cellulaire atteint " sur des modèles souris de la maladie de Charcot marie tooth (CMT). Il s'agit notamment de déterminer l'effet bénéfique d'injections de vecteurs viraux médicament exprimant un gène thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si les approches de thérapie génique proposées ont un effet bénéfique pour améliorer ces deux formes de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit d'une étude préclinique qui permettra, en cas de bénéfices thérapeutiques, d'établir la preuve de concept de l'efficacité de ce type d'approche de thérapie génique ciblée pour la maladie de Charcot marie tooth (CMT). A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour les patients atteints de CMT.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=530) subiront des injections de type intrathécales au niveau lombaire ou intramusculaires dans les pattes arrières. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline et ne nécessite pas d’incision de la peau ou du muscle au préalable. En se basant sur notre expérience et celle de nos collaborateurs ,ces injections entrainent peu d'effets indésirables. Nous espérons notamment retarder voire prévenir l'apparition des symptômes grâce à l'approche thérapeutique que nous proposons. Néanmoins, elles peuvent occasionallement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention. Par la suite, les fonctions locomotrices de ces souris seront évalués au cours du temps au moyen de 3 ou 4 tests permettant d'analyser la démarche de la souris, la sensibilité de ces pattes ou encore la force de ces muscles. Ces tests entrainent peu d’inconfort aux souris. L’ensemble de ces tests pour un stade donné, seront effectué sur 3 ou 4 semaines afin de ne réaliser qu’un test par semaine et assurer une récupération aux animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer différents critères (poids, apparence, comportement général, blessure etc.) rendant compte de l'état de santé général de l'animal. La classification modérée des procédures prend en compte le cumul du phénotype de la souris CMT et des injections et tests effectués chez ces animaux.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT) (diminution de la dégénérescence axonale, réduction des défauts de myéline, etc.).

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann) et particulièrement les cellules de Schwann qu'il est impossible de différentier à partir de cellules pluripotentes humaines. Ainsi seuls des modèles souris nous permettent à l'heure actuelle d'établir la preuve de concept des thérapies que nous proposons pour envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion, force musculaire et vitesse de conduction nerveuse. De plus il s'agit d'une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,6 et 12 mois) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe, analgésiques après injection). Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu'ils atteindront le critères d'interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent la majorité des anomalies cellulaires et comportementales observés chez ces patients telles que une dégénérescence axonale, des défauts locomoteurs et des anomalies de myéline.

4 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la listériose, par gavage ou injection intraveineuse, puis pesées quotidiennement, certaines recevant du tamoxifène ou des anticorps, et peuvent développer diarrhées et infections d'organes dont le cerveau. Le porteur situe le projet dans la recherche fondamentale sur les interactions entre la bactérie et son hôte, et indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité d'un "organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Listeria monocytogenes (Lm) est la bactérie responsable de la listériose, maladie humaine d'origine alimentaire. Lm peut atteindre le cerveau et induire des méningites et encéphalites, en particulier chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 %. La listériose peut aussi se traduire par une infection materno-fœtale chez les femmes enceintes, provoquant fausses-couches, accouchements prématurés ou infections néonatales. Les objectifs de ce projet sont de déterminer les rôles des facteurs bactériens et de l’hôte, y compris le microbiote intestinal, dans la listériose. L’étude de la listériose est importante pour comprendre cette pathologie, mais également pour mieux appréhender la réponse de l’hôte à un pathogène intracellulaire facultatif.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses et en particulier sur la listériose. Cette maladie tue chaque année plus de 300 personnes en France. Elle constitue donc un problème de santé publique ainsi que pour l’industrie agro-alimentaire. Elle est également un modèle précieux pour la compréhension des interactions entre une bactérie intracellulaire facultative et son hôte. Une meilleure compréhension du mécanisme de dissémination des bactéries dans l'organisme et de la réponse immunitaire mise en place est en soi importante pour l’évolution des connaissances et constitue un prérequis indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques multi-cibles innovantes et efficaces. Même si nos recherches se focalisent sur Lm, une grande partie de nos approches et résultats pourrait être étendu à l’étude d’autres pathogènes..

Procédures

1128 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), avec un ou des composants du microbiote (ou PBS en contrôle) puis, 30 jours après, à un nouveau gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes, pathogène pour l’homme et l’animal. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement, et les fèces prélevés (durée d’environ 2 minutes dans une boîte individuelle). 600 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 240 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 324 souris seront soumises à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces animaux recevront 10 injections de tamoxifène ou de solvant contrôle (huile d’olive) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). 5 injections avant et 5 injections après inoculation de Listeria. L’injection de tamoxifène pourra être remplacée par l’ajout de tamoxifène dans la nourriture, si ce mode de délivrance est efficace pour notre modèle. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 480 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes. Parmi ces souris, 240 recevront 3 injections d’anticorps anti-Il-10 (ou anticorps contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 2 injections avant et une injection le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 60 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 60 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces 120 souris recevront 3 injections d’inhibiteur d’EVH1 (ou contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 1 injection avant et 2 après le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. Les animaux sont susceptibles de développer des diarrhées, des infections de différents organes y compris le cerveau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude de la physiopathologie de la listériose. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité d’un organisme vivant dans son intégralité, y compris les conditions très spécifiques pour maintenir un microbiote sous conditions physiologique. Seul les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus d’infection dans sa globalité et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. Nous utilisons en parallèle des approches in vitro ou ex vivo (organoïdes) pour répondre à des questions plus spécifiques.

Réduction

Les moyennes de CFU entre les groupes seront comparées à l'aide de tests de comparaison de moyenne (ANOVA ou test non paramétrique). Les effectifs par groupe (n=5) sont associés à des tailles d'effet de 2, pour un test de comparaison de 2 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Lorsque cela est possible, les animaux sont infectés avec un mélange de souches (index de compétition), afin de comparer leur virulence au sein du même animal, ce qui permet de diminuer le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Des points limites incluant la prostration/faciès de souffrance ou Body score 1, la perte de poids>20% du poids initial, ainsi que les signes d'infection du système nerveux central (paralysie partielle) sont appliqués pour ce projet. Les animaux seront mis à mort dès qu'un de ces points limites est atteint. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).

Choix des espèces

La souris n’est pas permissive à une infection orale par Lm du fait d’une spécificité d’espèce de l’interaction entre InlA et la E-cadhérine. La lignée murine permissive à Lm, qui exprime une E-cadhérine reconnue par InlA, sera dont principalement utilisée. L’interaction InlA-E-cadhérine n’étant pas impliquée après le passage de la barrière intestinale, des souris non permissives pour cette interaction, dont des C57BL/6J, pourront être également utilisées pour des infections intraveineuses afin de tester le rôle de facteurs bactériens ou de l’hôte indépendamment de la traversée de la barrière intestinale. Différentes lignées mutantes pourront ainsi être utilisées. Le recours à ces lignées permettra d’identifier et de caractériser les processus d’interactions hôtes / bactéries de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. Selon les procédures, les animaux suivants seront utilisés : Souris adultes (âge > 7 semaines), pour lesquelles le système immunitaire est mis en place. Souris gestantes pour étudier la listériose materno-fœtale et l’infection des fœtus. Souris âgées (plus de 18 mois) pour caractériser l’augmentation de la susceptibilité à la neuro-listériose liée à l’âge et au changement de microbiote.

1 750 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre injections de candidats vaccins contre l'allergie et trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire, une ponction derrière l'oeil que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des douleurs oculaires, un blépharospasme et des écoulements. Il indique que les souris gardent une mémoire immunitaire des vaccinations et ne peuvent donc être réutilisées, d'où leur mise à mort. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" pour remplacer ce type d'évaluation immunitaire.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines (comme l’IL4 et l’IL13) et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s) après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde™’. Ce dernier peut se présenter soit sous forme de proteine mélangé à un adjuvant, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm) encapsulé dans des particules lipidiques. Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin Kinoïde™ est évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de neutraliser l’activité biologique de la cytokine. Dans nos précédentes études, nous avons démontré que le vaccin kinoide (protéique ou ARN) murin induit une réponse immunitaire neutralisante contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s). Nous avons également démontré que le vaccin kinoide protéique humain induit une réponse immunitaire dans une lignée murine humanisée. Dans cette nouvelle étude, nous avons 2 objectifs : -Optimiser la réponse immunitaire induite par le vaccin kinoide protéique humain en testant différentes doses de vaccins -Tester 27 candidats vaccins kinoides ARN humains Pour cela, nous utiliserons la lignée murine humanisée hIL-4/hIL-13KI ; hIL-4RαKI.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d’immunisation du vaccin kinoide protéique, à savoir, la dose de vaccin à injecter. Il permettra également de sélectionner les meilleurs candidats vaccins kinoides ARN ainsi que la meilleure formulation de particules lipidiques. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -900 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (50 à 100 μl). Parmis ces animaux, un groupe de 810 souris recevra 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28 et un groupe de 90 souris recevront 4 injections de vaccin aux jours 0, 7, 28 et 48. -810 animaux seront injectés par voie sous-cutanée avec du vaccin (50 à 100 μl). Ces 810 souris recevront 3 injections aux jours 0, 7 et 28. Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins ARN étaient nécessaires. De plus, des études préliminaires ont montré que chez les souris humanisées triple KI 3 à 4 injections étaient nécessaires pour obtenir une réponse immunitaire efficace. 2)Prèlévement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. L’ensemble des 1710 souris subira 3 prélèvements sanguins aux jours -7, 38 et 58.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. L'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques puis soumises à un régime hyperprotéiné pendant douze semaines, elles reçoivent un gavage quotidien pendant vingt-huit jours et des incisions répétées de la veine caudale pour mesurer la glycémie, et sont hébergées seules en cage métabolique lors des dernières semaines. Le porteur indique un point limite de mise à mort à partir de 10 % de perte de poids accompagnée de signes de morbidité, et prévoit une réhydratation pour les animaux déshydratés. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'organisme vivant en entier" pour étudier la néphropathie diabétique.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) reste insuffisante malgré le développement récent de nouveaux médicaments dont les inhibiteurs de SGLT2. Ces derniers n’offrent qu’une protection partielle et freinent l’évolution de la ND sans pour autant la guérir. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable en utilisant un modèle de souris diabétique présentant les caractéristiques cliniques de la ND. Cette double approche pharmacologique devrait conduire à un niveau plus élevé de protection contre le développement de la néphropathie.

Bénéfices attendus

Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu que 3 fois par animal et durera 3-4 secondes. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 12 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. Cependant, au cours des 4 dernières semaines correspondant aux interventions pharmacologiques, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre la collection individuelle de la production urinaire (cages métaboliques) et l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. De ce fait, les souris auront accès à un enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empagliflozine ou INV202+Empagliflozine de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Nous avons ainsi fait le choix d’inclure aussi bien des souris mâles que femelles (à raison d’1/4 de l’effectif) pour prendre en compte les 2 sexes tout en limitant le nombre d’animaux finaux.

Raffinement

Depuis leur arrivée du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique (500 µL, 1 fois par jour) ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. En plus des critères d'intervention spécifiques au projet, les critères suivants s'appliquent à tout le projet et les animaux seront mis à mort si : La perte de poids corporel dépasse 10% et s'accompagne d'une mauvaise condition physique ou de signes de morbidité. Incapacité de mouvement empêchant l'animal d'avoir accès à la nourriture ou à l'eau. Inappétence prolongée (par exemple> 48 heures) et / ou preuve de déshydratation clinique. Diarrhée chronique (par exemple> 48 heures) ou constipation. Perte de conscience inattendue sans réponse à des stimuli externes tels qu'un pincement des orteils. Dermatite ou traumatisme auto-induit inadapté au traitement palliatif. De plus, pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local à base de lidocaïne quelques minutes avant l’incision.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète se fera chez des souris de 6 semaines. Deux semaines plus tard, le degré d’hyperglycémie sera évalué (8 semaines) les souris présentant une glycémie ≥ 250 mg.dL seront mises sous régime riche en protéines pendant 12 semaines. Ainsi, les souris seront âgées de 20 semaines lors du début des traitements pharmacologiques et de 24 lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

25 000 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de l'appareil reproducteur, ovariectomie, hystérectomie, ligature des trompes, vasectomie ou castration, avant d'être expédié vers d'autres laboratoires pour leurs propres expériences. Le porteur décrit ce projet comme la fourniture de rongeurs "préparés", à raison d'environ 5 000 par an, et indique n'appliquer aucune approche statistique sur les effectifs. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode de substitution" pour évaluer les réactions du "corps vivant entier".

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats, souris, hamsters et gerbilles ; pour les femelles (ovariectomie, hystérectomie, ovario-hystérectomie, ligature des trompes) et pour les males (vasectomie, castration) (environ : 5000/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale ou de modifier le comportement dans les tests ou d'obtenir des femelles pseudogestantes.

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurge du système reproducteur (ovariectomie, hystérectomie, ovario-hystérectomie, ligature des trompes, vasectomie ou castration).

Impact sur les animaux

La chirurgie du système reproducteur est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Les animaux sont maintenus en groupe.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum).

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe intracérébrale de cellules tumorales sous anesthésie, des séances d'irradiation, un médicament par voie orale cinq jours sur sept et des injections avec imagerie de suivi, pour tester un inhibiteur de PARP contre un gliome pédiatrique du tronc cérébral. Le porteur indique que les souris développeront des symptômes neurologiques, principalement de l'apathie, correspondant à la fin de la procédure. Il conclut qu'il est "indispensable" d'évaluer le passage du médicament dans un "organisme vivant entier" avant un éventuel essai clinique, l'espoir d'améliorer la survie des enfants restant à court terme.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes infiltrant de la ligne médiane (ou DMG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont inopérables en raison de leur nature infiltrante et de leur localisation profonde dans le tronc cérébral. Elles sont chimiorésistantes et la radiothérapie, traitement standard, n'est efficace que transitoirement. En cela, ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Une famille des polymerases a de nombreuses fonctions essentielles dans les processus cellulaires tels que la transcription, le remodelage de la chromatine, la réponse et la réparation des dommages à l'ADN ainsi que l'apoptose. Un inhibiteur de ces polymérases, a été évalué in vitro et a montré une excellente efficacité cytotoxique ainsi qu'une activation très importante du mécanisme de réparation de l'ADN en combinaison avec l'irradiation. De plus, cette molécule pénètre la barrière hémato-encéphalique (BHE), obstacle très limitant dans le traitement des DMG, tumeurs isolées par la BHE non perméable à la plupart des médicaments. L'utilisation de cet inhibiteur semble être donc très prometteur pour traiter nos modèles in vivo de DMG. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence un effet antitumoral du médicament en combinaison à la radiothérapie dans nos modèles de xénogreffes de DMG. Nous évaluerons l’effet antitumoral de la molécule sur deux modèles de xénogreffes de DMG par un suivi longitudinal de la croissance tumorale couplée à une étude de survie. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, des molécules pourraient être directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I, la molécule étant déjà entrée en phase clinique dans le cancer du sein.

Bénéfices attendus

Les DMG sont des tumeurs pédiatriques universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour car aucun traitement ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par des PARPi est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie des enfants atteints à court terme.

Procédures

Les animaux subiront : - une greffe intracérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 15 minutes - les souris pourront être irradiées sous anesthésie générale 1x/jour pendant 5 jours: durée 5 minutes- administrations par voie orale avec le médicament 5x par semaine entre 1 et 3 mois: durée 20 secondes - injections sous anesthésie générale et imagerie 1x/15j pour le suivi de la croissance tumorale: durée 15 minutes.

Impact sur les animaux

Du fait de leurs tumeurs cérébrales,, en fin de protocole, les animaux présenteront des symptômes neurologiques (principalement apathie) qui correspondront à la fin de la procédure. Les doses de radiothérapie utilisées ici sont très bien tolérées chez l’animal et n’engendrent aucun effet secondaire. Les doses de médicament utilisées pour traiter les souris sont très inférieures au doses maximales tolérées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car ils seront porteurs de tumeur.

Remplacement

L’efficacité des médicaments a été évaluée dans un premier temps in vitro, avec un bénéfice supérieur lorqu’ils sont utilisés en combinaison avec de l’irradiation. Toutefois, il est reconnu que la barrière hématoencéphalique est un réel frein aux passages de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc indispensable d'évaluer dans un contexte in vivo leur passage et leur pharmacodynamique dans un organisme vivant entier. De plus, dans la perspective du passage d'un médicament vers un essai clinique humain, il demeure indispensable d’avoir des données précliniques chez l’animal démontrant son efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste au moyen de calculs de puissance. Le suivi longitudinal par imagerie pemettra de réduire considéablement le nombre d'animaux,et d'obtenir des résultats statistiquement plus puissants. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogènes et reproductibles (100% de prise tumorale). Pour l'analyse des résultats, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés, pour les comparaisons de plusieurs groupes et pour les comparaisons de groupes deux à deux, ainsi que pour les suivis longitudinaux.

Raffinement

Nos xénogreffes sont suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d'extrapoler le volume tumoral sans avoir besoin d'euthanasier des animaux (réduction et raffinement). Cela permet donc de diminuer le nombre d'animaux par procédures et de prévoir au plus tôt la souffrance des animaux. Pour limiter la contrainte liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe clinique de douleur, ils recevront un antalgique . Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. La dose du médicament évalué est très inférieure à la dose maximale tolérée chez l’homme et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose que nous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Une singularité des gliome infiltrants de la ligne médiane réside dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles in vivo, où la variété et la complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la BHE est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire d’évaluer les traitements in vivo sur des modèles stéréotaxiques afin de pouvoir prétendre à une nouvelle médication pour les phases cliniques. Pour ces études, la souris immnodéficiente est l'espèce la plus pertinente du fait du recul déjà accumulé en oncologie préclinique. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge de l'adolescent/ jeune adulte.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin est provoquée par un produit qui altère la barrière intestinale, avec perte de poids et sang dans les selles, avant gavages, prélèvement de sang par ponction du cœur et mise à mort pour prélever plusieurs organes. Le porteur restreint l'étude aux mâles, décrits comme plus sensibles, au nom de la réduction du nombre d'animaux. Le projet teste si un produit laitier riche en certains lipides prévient cette inflammation.

Objectifs

L’intestin a plusieurs fonctions essentielles à l'intégrité de l'organisme et au maintien d'une santé optimale dont une fonction de barrière sélective limitant le passage de molécules délétères et une fonction d'absorption indispensable aux apports nutritionnels. L'inflammation intestinale modérée est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer l'intégrité de l'intestin. L’alimentation joue un rôle important dans le développement et la sévérité de l’inflammation intestinale. La consommation de certains produits laitiers contenant notamment des lipides polaires laitiers pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence, dans un modèle de souris avec inflammation intestinale modérée induite par un produit altérant la barrière intestinale pendant 8 jours, les effets préventifs d’une supplémentation en babeurre (riche en lipides polaires) sur l’inflammation, l’intégrité et la fonction de barrière intestinale, le microbiote et d’identifier les mécanismes en lien avec le métabolisme et le devenir intestinal des lipides polaires laitiers.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin est en forte augmentation sur les dernières décennies (environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017), non seulement dans les pays occidentaux mais aussi les pays émergents. Ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant la consommation de produits laitiers riches en lipides polaires et la modulation de la barrière intestinale. Les résultats pourraient contribuer à proposer des pistes de nutrition préventive associées au babeurre et aux lipides polaires laitiers dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ainsi que dans les pathologies humaines marquées par une inflammation modérée comme l’obésité ou le diabète de type 2.

Procédures

Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test lactulose-mannitol-sucralose pour tester fonctionnellement la perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection d’une dizaine de secondes en deux points sous-cutanés de 0.5 mL de solution saline afin de stimuler la miction. Après 30 minutes, les souris seront gavées en 10 secondes avec 0.2 mL de solution de lactulose/mannitol/sucralose. Pour le prélèvement de sang par ponction cardiaque, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes afin de réduire au maximun la douleur liée à ce type de prélèvement. Après 30 minutes, les animaux seront anesthésiés par un mélange analgésique/anesthésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation intestinale par le traitement des animaux avec un produit altérant la barrière intestinale peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistance des selles et la présence de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Une étude pilote a été menée en amont afin de déterminer une dose et un temps pouvant induire une inflammation modérée avec augmentation de la perméabilité intestinale. Au-delà de 8 jours de traitement à 1%, les effets du produit altérant la barrière intestinale sont plus marqués avec une diminution du poids corporel (

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, le sang des animaux doit être collecté pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Certains organes (le côlon, l'intestin grêle, rate, foie, reins) seront également prélevés pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. Il est alors impossible d’obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.

Remplacement

Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et où les données obtenues sont transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Ces stratégies nutritionnelles pour diminuer ou prévenir l’inflammation devraient permettre d’accroitre les connaissances quant au développement et à la manière de prévenir l’inflammation..

Réduction

Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale par un produit altérant la perméabilité intestinale que les souris femelles. Dans un but de réduction du nombre d’animaux, cette étude sera réalisée uniquement sur des souris mâles. Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d’animaux pour obtenir un effet significatif.

Raffinement

Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne (Week-End inclus) pour déceler un potentiel mal-être. Si des signes de souffrance des animaux sont observés, la surveillance sera accrue avec éventuellement la réhydratation des animaux, la mise de la nourriture dans la cage, le changement de la litière. Si l’état des animaux ne s’améliore pas dans des délais définis, la procédure sera stoppée.

Choix des espèces

Les travaux effectués dans ce domaine dans la communauté scientifique sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les études sur l’inflammation induite par un produit altérant la perméabilité intestinale, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J. De plus, les modèles d’inflammation intestinale induite par un produit altérant la perméabilité intestinale chez la souris sont considérés comme modèle pertinent des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin pour la transposition des résultats à l’Homme. Les souris seront commandées à 6 semaines de vie et le protocole débutera à 7 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une atrophie musculaire est déclenchée chez la souris adulte par injections, puis une partie reçoit un métabolite dans l'eau de boisson, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur indique que les animaux ne montrent pas de signe de souffrance avant sept mois et fixe les expériences au plus tard à douze semaines après le déclenchement. L'étude teste si ce complément freine la fonte musculaire liée au cancer, aux myopathies ou au vieillissement.

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est en partie causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Une diminution d’un métabolite essentiel à de multiples fonctions cellulaires a été mise en évidence dans les muscles atrophiés. L'objectif du projet est de tester, dans un premier temps, si la restauration de ce défaut par supplémentation orale avec le métabolite pendant 4 à 12 semaines pourrait avoir un effet bénéfique sur le muscle, comme cela a déjà été observé dans d’autres modèles de pathologie musculaire. Les souris seront mises à mort à 4 et 12 semaines après le traitement inducteur. Dans un second temps, l'évaluation de la pathologie musculaire nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Pour ce projet un maximum de 200 souris seront nécessaire.

Bénéfices attendus

A ce jour il n’existe pas de traitement permettant de maintenir ou de récupérer la masse musculaire dans les cas d’atrophies pathologiques ou lors du vieillissement. Le métabolite auquel nous nous intéressons est une piste prometteuse dans le traitement de l’atrophie et l’amélioration de la qualité de vie et la survie des patients, il a déjà fait ses preuves dans d'autres modèles de pathologie musculaire. En supplémentant les animaux ,nous espérons voir une amélioration de l'état du muscle, un ralentissement de l’atrophie.

Procédures

Tous les animaux recevront 4 injections consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, 4 semaines après ces injections, un lot d'animaux recevra 2 injections, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux seront vigiles lors des injections qui ne durent que quelques secondes et sont réalisées par des personnels expérimentés. Une partie des animaux sera traitée par voie oral via une solution buvable contenant un métabolite pendant 4 à 12 semaines après induction du transgène. Ce traitement sera introduit dans l'eau de boisson. Un prélèvement de sang sera fait en point terminal sous anesthésie générale profonde et ces souris seront mises à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La présence du métabolite dans l’eau de boisson pourrait induire une diminution transitoire de consommation de boisson, notamment par la présence d’un gout inhabituel. Nous vérifierons que l'hydratation des animaux est correcte en évaluant les plis de peau. Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les souris ne présentent pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Les expériences seront réalisées au plus tard 12 semaines après l’induction du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, et où aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les injections régulières sur 4 jours et sur 24h peuvent induire une douleur transitoire au point injection.

Devenir

mise à mort afin de collecter les muscles et les organes pour des analyses biochimique, histologiques et métabolomiques approfondies

Remplacement

Des expériences dans les cellules seront réalisées en amont, et de manière complémentaire. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude de traitement au-delà de quelques jours. Le modèle murin est essentiel pour étudier les conséquences musculaires des maladies chroniques et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le métabolisme global de l’organisme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs sera utilisé. Le maximum de données pouvant être générées à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 10 animaux maximum par groupe seront utilisés. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la robustesse des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux, la seconde partie du projet ne sera réalisée que si le traitement, réalisé en première partie du projet, montre un effet satisfaisant sur le maintien de la masse musculaire. Enfin, des échantillons collectés dans la première partie seront utilisés comme controle de la seconde partie du projet.

Raffinement

Le traitement avec le métabolite d'intérêt sera ajouté à l'eau de boisson, cela limitera le stress chez l’animal. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour détecter les signes de mal-être ou de souffrance. Les animaux seront pesés 2 à 3 fois par semaine pendant les 4 premières semaines de traitement (en même temps que le renouvellement de l’eau tous les 2 à 3 jours) puis toutes les semaines. La durée du traitement pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique. Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation d'une signalisation d'intérêt, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction du transgène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. L'étude à deux stades 4 semaine et 12 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par des résultats expérimentaux préalables.