Souris

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sous anesthésie, puis un substitut de peau humaine est greffé sous leur peau, avant leur mise à mort échelonnée à deux, quatre et douze semaines pour prélever la zone greffée. Le porteur signale la douleur de la chirurgie et le stress de l'isolement d'une semaine, atténués selon lui par l'analgésie et des cages transparentes. Le projet évalue la tenue dans le temps d'un substitut cutané destiné à traiter des plaies humaines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la fonctionnalité au cours du temps d’un substitut cutané humain greffé sous la peau, ainsi que la dégradation progressive de la matrice support de ce substitut cutané humain. Le substitut cutané humain est un produit de thérapie innovante développé en utilisant des cellules humaines isolées à partir d’un prélèvement de peau humaine et cultivées sur une matrice biologique support. Le substitut cutané humain, ou la matrice biologique support, sera greffé sur des souris dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Des prélèvements de la région greffée seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support afin de réaliser un ensemble d'analyses.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer tout ou partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques ont été développés et sont pour certains utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique,… mais leur efficacité et leur tenue dans le temps ne sont pas très bonnes. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies ou de remplacer une peau nécrosante.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support effectuée sous anesthésie générale. Un substitut cutané humain ou une matrice biologique support sera placé sous la peau par l’intermédiaire d'une incision qui sera ensuite refermée. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes seront observées quotidiennement et photographiées 2 fois par semaine, et un scoring de différents paramètres sera effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant une semaine après la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture effectués au niveau de la peau incisée, et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, puis elles seront replacées à 2 par cage.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support peut engendrer une souffrance mais sera limiter au maximum pa r l'utilisation d’une couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées pendant une période transitoire d‘une semaine, nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture au niveau de la peau incisée et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris au cours de cette période transitoire d’une semaine de voir au moins une de ses congénères. A l’issue de la semaine d’hébergement en cage individuelle, les souris seront replacées à 2 par cage.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 30 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support, 2 semaines, 4 semaines et 12 semaines, avec 5 souris par temps de prélèvement, par injection intrapéritonéale d’une surdose d’euthanasique effectuée sous anesthésie gazeuse . Un prélèvement sera effectué au large de la zone de greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support pour la réalisation d’un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané humain évalué et de suivre la dégradation progressive de la matrice biologique support au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation de greffes cutanées. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, puis des injections répétées d'un candidat médicament sous contention, avant d'être tuées par rupture des vertèbres cervicales. Le porteur signale une possible cachexie et une gêne à la marche liée au volume de la tumeur. Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que la souris pour reproduire un "organisme entier", l'étude constituant une étape vers un dossier réglementaire commercial.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu'une molécule est exprimée, voire fortement surexprimée, au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin). Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, principal cancer retrouvé chez les femmes en France. Il y a donc une nécessité de développer de nouveaux traitements à l’heure actuelle afin d’améliorer la survie des patientes. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel anti-tumoral d’un candidat médicament qui en plus d’inhiber la vascularisation tumorale, a d’ores et déjà démontré des effets anti-tumoraux dans différents modèles murins de cancer tels que le cancer de la peau, cancer cérébral et le cancer ovarien. Il a également été montré dans ce dernier modèle la capacité du candidat médicament à activer l’immunité anti-tumorale. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique et la pharmacologie du candidat médicament. Pour cela, un effet dose sera évalué en analysant la croissance tumorale au sein d'un modèle de cancer mammaire ainsi que la vascularisation grâce à la technique dite de "matrigel plug". Ces deux premières procédures permettront la détermination des paramètres pharmacologiques et pharmacocinétiques. Une fois la dose efficace déterminée à l'aide de ces deux premières études, nous analyserons l’effet de la dose efficace sur la réponse immunitaire dans les tumeurs. Pour cela, le modèle de tumeur mammaire est un modèle intéressant pour étudier les relations entre la tumeur et le système immunitaire en respectant la physiologie de développement tumoral. Enfin, le 3e volet de l’étude consistera à comparer quatre formulations du candidat médicament afin de déterminer celle qui pourrait améliorer l'efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par le candidat médicament sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’une diminution de la vascularisation tumorale selon un effet dose. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au candidat médicament dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeurs vascularisées et système immuno-compétent). Cette étape, associée à la détermination d’une dose efficace de traitement et d’une formulation adaptée, constitue un prérequis à la constitution de dossier réglementaire lors du developpement pharmaceutique.

Procédures

Pour toutes les procédures (toutes les souris) : identification des souris par tatoo au niveau des oreilles (durée: moins d'1min) sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois). Procédures 1, 3 et 4 (pour toutes les souris) : - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min) 3 fois par semaine pendant 3 semaines Procédure 2 (pour toutes les souris) : - Injection d’une solution de protéines matricielles, contenant un facteur favorisant la vascularisation, dans le flanc des animaux, sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse, dans la veine de la queue, sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min), 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Procédure 1 (souris du groupe satellite) : - Prélèvements sanguins sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (5 fois : submandibulaire gauche, submandibulaire droite (durée: 1min), rétoorbital gauche, rétroorbital droit (durée: moins d'1min), ponction intracardiaque après euthanasie) répartis au cours du temps jusqu'au sacrifice des animaux.

Impact sur les animaux

Une cachexie : d'après la bibliographie, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 3 semaines de traitements néanmoins le risque que quelques animaux en présente n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur. Un stress des animaux lors des injections sur animaux vigiles ainsi que préalablement à l'imagerie. Une douleur transitoire lors de l'injection intraveineuse. Une inflammation et/ou une dépilation dans de rare cas à l'emplacement de la tumeur croissante ou de la solution matricielle.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par rupture des vertèbres cervicales sous anesthésie générale (isoflurane 4%).

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du candidat médicament et de définir sa dose efficace et la formulation adaptée avant l’éventuelle réalisation d’essais cliniques.

Réduction

Afin d’être adapté au modèle de cancer mammaire, uniquement des souris femelles seront considérées dans les procédures comportant ce modèle. Pour le modèle in vivo de vascularisation, il s’agira de souris mâles et femelles afin de pouvoir identifier, si nécessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera mis à mort. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne) Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Souris Balb/c, syngéniques de la lignée de carcinome mammaire 4T1 Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. Homologie de la protéine cible Animalerie agréée pour l’espèce souris Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusque environ 1 an chez la souris).

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un stress subi en début de vie, elles reçoivent deux injections d'un vecteur viral dans le cerveau par chirurgie, une puce sous la peau, puis sont soumises à des tests dont une suspension par la queue de six minutes, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit la suspension par la queue comme génératrice de stress et une douleur locale après l'opération. L'objectif est de comprendre comment un stress juvénile installe l'anxiété à l'âge adulte, avec l'espoir de cibles thérapeutiques.

Objectifs

Pendant la petite enfance, l'enfance et l'adolescence, l'expérience et l'environnement façonnent l'organisation des neurones qui forment la base de la perception et du comportement des adultes. Les circuits cérébraux s'adaptent en fonction des stimulations sensorielles, motrices et sociales pendant des périodes dites critiques. Un certain nombre de troubles neurodéveloppementaux, notamment les troubles du spectre autistique et la schizophrénie, sont connus pour être associés à des anomalies de ces voies cérébrales. Certains neurones du cerveau sont impliqués dans ces périodes critiques et participent à la consolidation des circuits. Un facteur de transcription est capté par ces neurones dans le cerveau, et cela de manière concomitante avec le début de la période critique. Des souris soumises à un stress juvénile précoce présentent des comportements de type « anxieux » à l'âge adulte. Chez ces souris, des changements d'expression de ce facteur dans le cerveau sont aussi observés. De manière générale, le but de ce projet est donc de savoir comment le stress juvénile affecte le cerveau et les troubles de l’humeur comme l’anxiété. Ce projet étudiera les changements du comportement lors de l'installation de l’anxiété chez les souris adultes ayant subi un stress postnatal. De cette façon nous pourrons identifier les mécanismes qui se mettent en place lors de périodes critiques. Ainsi, des souris naïves subiront un stress postnatal précoce. Nous réaliserons ensuite des injections avec un outil viral qui permettra de rapporter une molécule d’intérêt pour augmenter l’expression du facteur de transcription. Grâce à une batterie de tests comportementaux, nous étudierons le comportement anxieux de ces souris à l’âge adulte. Nous nous attendons à obtenir une réduction du comportement anxieux chez les souris ayant reçu les injections de l’outil viral. De plus, une modification dans le fonctionnement et le développement des neurones est attendue.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété. Il fournira aussi de nouvelles cibles de traitement pour les troubles du développement du cerveau caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux d'une population de neurones appelés les interneurones.

Procédures

Deux injections (une par hémisphère) seront réalisées dans le cerveau avec des outils viraux chez chaque souris au début de l'âge adulte. Le temps total de la procédure de chirurgie est d'environ 30 min (incluant 10/15 min d'injection). Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. Un test comportemental étudiant le stress durera 6 minutes. Une injection de produits anesthésiques : durée moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend des injections intracérébrales, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'injection. Lors du test étudiant le stress, les souris seront suspendues par la queue pendant 6 minutes, ce qui peut engendrer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Nos recherches portent sur les effets du stress postnatal sur la plasticité du cerveau. Elles nécessitent des modèles animaux pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement à l'âge adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de la naissance à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'étudier un système dans son ensemble, à cet égard la souris est un modèle pertinnent car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.

Réduction

Des travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections intracérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales ainsi que des prérequis statistiques nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. En fonction de la répartition en cloche des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (stressée, contrôles et stressées + traitées avec un vecteur viral).

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Toute la procédure chirugicale sera réalisée sous anesthésie. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les injections pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. En post-opératoire une solution d’une crème cicatrisante sera appliquée localement sur les plaies. Une surveillance du site d'injection après les injections et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance La modification du comportement (posture voûtée, poil hirsute, lenteur des mouvements, rétrécissement orbitaire) sera traitée par analgésique en intrapéritonéale. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité du cerveau et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines, en particulier dans le cadre de maladies neurologiques étant donné que la souris présente une organisation du système nerveaux proche de celle de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'adolescence. Des injections intracérébrales seront effectuées pour modifier l'effet du stress reçu lors de la période postnatale car à cet âge cette région du cerveau est encore plastique. Le comportement sera évalué à l'âge adulte, lorsque le phénotype anxieux se manifeste.

4 725 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie des os de verre, elles présentent des fractures spontanées et subissent biopsies de l'oreille, prélèvements sanguins, injections répétées et jusqu'à dix scanners sous anesthésie, pour tester une biothérapie. Le porteur décrit les fractures comme seul symptôme et affirme n'attendre aucun effet indésirable des gestes techniques. Il conclut que le recours à des souris malades reste "inévitable" et renvoie l'effet pour les patients à un "bénéfice probable à long terme".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un traitement pour la maladie des os de verre. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour la maladie des os de verres. Il s’agit d’une maladie rare de fragilité osseuse responsable de fractures spontanées pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice probable à long terme pour ces patients.

Procédures

Biopsie d'oreille sur animal vigile 2-3mm durée 10 sec Prélèvements de sang 10-20 sec, 1 par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié Injection IntraPéritonéale (animal vigile) et IntraVeineuse (animal anesthésié) 10-30 sec, 1 à 3 par semaines maximum, Scanner avec anesthésie gazeuse d'une durée maximum de 10 min par scanner et au maximum 10 scanners dans la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé est un modèle de la maladie des os de verres qui présentent les memes symtomes que les patients soit des fractures spontanées. Cependant, les animaux ne présentent pas de problèmes pour se mouvoir ou s’alimenter aux âges où nous les utiliserons. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les gestes techniques réalisés sur ces animaux, il n'y a pas d'effets indésirables prévues. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés dans le but de prélever des organes pour réaliser une caractérisation histologique des tissus.

Remplacement

Globalement, la construction des molécules et l’optimisation de ces dernieres se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Seules les molécules efficaces in vitro vont être testées in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation de souris malades est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à utiliser le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les problèmes dentaires. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Ostéogénèse imparfaite, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

Un rongeur qui perd plus de 15 % de son poids, ou plus de 10 % pendant plus de trois jours, atteint le point limite de ce projet. 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie. Pour suivre l'absorption et l'élimination de composés chimiques ou biologiques, parfois radioactifs, l'équipe administre ces composés par toutes les voies possibles, jusque dans le cerveau ou la vessie, ou par minipompe posée en chirurgie, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures, une privation d'eau jusqu'à quatre heures, un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, et des phases in vivo jusqu'à douze mois. Le porteur annonce pourtant "pas d'effets indésirables particuliers", avant d'admettre que les composés peuvent se révéler toxiques. 10 220 rongeurs sont déclarés réutilisés, une possibilité que le porteur réserve à ceux restés moins d'une semaine après une dose unique non radioactive, et les autres sont tués pour récupérer organes et grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. La deuxième procédure aura le même objectif mais avec recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Afin d’évaluer la pharmacocinétique de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h, Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.

Devenir

Après la procédure numéro 2, et dans une grande partie des cas pour la procédure 1, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux de la procédure 1 ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids , les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Les cellules injectées dans le cerveau des souris et des rats de ce projet sont fournies par un client, et les effets indésirables à prévoir seront anticipés d'après les informations que transmettront les donneurs d'ordre. 2 250 rongeurs, 1 125 souris et 1 125 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue puis autopsiés pour prélever leurs organes. Nourris chaque jour d'un aliment contenant 0,2 % de cuprizone pour provoquer une maladie démyélinisante, ils reçoivent selon les groupes une injection unique de cellules par stéréotaxie sous anesthésie, pour des protocoles de deux jours à six mois. Le porteur évoque des phases de douleur aiguë puis chronique, des points limites et un suivi de la locomotion et de la sensibilité mécanique deux ou trois fois par semaine. Sur le remplacement, il recopie mot pour mot son paragraphe sur les effets indésirables, sans citer aucune méthode de substitution.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)

Procédures

L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.

Remplacement

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

Greffées de cellules cancéreuses du foie, sous la peau ou directement dans le foie sous échographie selon les groupes, 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, injecté sans anesthésie, certaines passent deux échographies hebdomadaires de 20 à 30 minutes sous anesthésie générale, et toutes sont mises à mort après un prélèvement de sang terminal pour récupérer tumeurs et foies. L'équipe veut confirmer chez des souris au système immunitaire fonctionnel l'effet de son anticorps, déjà entré en essai clinique pour d'autres maladies du foie, seul ou associé aux immunothérapies existantes. Le porteur qualifie les effets indésirables de "très limités", puis décrit des ulcérations possibles de la peau sur les tumeurs sous-cutanées, une gêne et des douleurs quand la tumeur du foie grossit, et des douleurs aux points d'injection répétés.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

45 souris immunodéprimées NOD Scid vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le ventre ouvert sur 5 à 6 millimètres, chacune reçoit dans la prostate une greffe de cellules tumorales prostatiques humaines, puis un traitement de 120 secondes à la torche à plasma froid par la même voie, le protocole durant une semaine. L'équipe veut savoir si ce plasma pourrait éliminer les cellules tumorales restées en bordure de l'ablation chirurgicale de la prostate chez l'homme, et reconnaît que la réaction du site greffé au plasma "reste inconnue", d'où un suivi renforcé d'une possible réponse inflammatoire. Sur le remplacement, le porteur indique avoir mis au point la torche sur lignées cellulaires, et présente la souris comme correspondant "au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

a procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque réduit à 1 semaine. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, celle-ci reste inconnue. Ainsi comme indiqué pour cette procédure, un suivi renforcé des animaux sera mis en place, notamment pour évaluer une potentielle réponse inflammatoire qui pourrais dégrader l'état général de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés.

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrit dans la présnte demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.