Souris

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales répétées tous les quatre à sept jours pendant deux à sept mois, un séjour de 48 heures en cage métabolique, un prélèvement rétro-orbital, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les organes. Le projet teste des doses croissantes d'une molécule contre la néphronophtise, une maladie rénale génétique. Le porteur indique avoir mené les premières recherches sur cellules mais affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier un rein, et renvoie le bénéfice, éviter la greffe rénale, au long terme.

Objectifs

Récemment, une molecule a montré un potentiel thérapeutique après 2 mois de traitement dans un modèle murin qui reproduit en partie la néphronophtise humaine, avec l’observation de lesions rénales à partir de 3 mois. L’objectif de ce travail est d’évaluer dans ce modèle murin l’efficacité thérapeutique de doses croissantes de la molécule, administrée pendant une durée plus longue (de 1 à 5 mois de vie) pour prévenir l’apparition de lésions rénales, ou administrée à un stade plus tardif de la maladie (5 mois de vie) pour évaluer l’efficacité à guérir les lésions rénales apparues.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’administration intrapéritonéale d’un composé thérapeutique, participant ainsi au développement d’un médicament qui permettra à terme d’éviter la greffe rénale aux patients souffrant de néphronophtise.

Procédures

Les 920 animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales uniques (durée : 5-10 secondes/injection), ou répétées tous les 4 ou 7 jours pendant 2, 4 ou 7 mois à l’aide de seringues très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce à la forme biseautée de l’aiguille. Les 920 animaux seront également soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, chacun des 920 animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale (durée : 30 secondes/prélèvement), une seule fois le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale (durée : 2 secondes/dislocation).

Impact sur les animaux

L’administration répétée par injection intrapéritonéale comporte un risque d’irritation au point d’injection. Si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A la fin de ce projet, les 920 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification de la molécule thérapeutique qui fait l’objet de cette étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’un rein, il n’a pas été possible du substituer des approches cellulaires aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum (entre 5 et 20 animaux par groupe de traitement) permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et deux fois par semaine par le responsable du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Afin de limiter la possibilité d’une souffrance due aux injections i.p. répétées, les injections seront réalisées avec des seringues Insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Si la zone d’injection présente une irritation, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée (Douxo Calm). Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Afin de limiter ce stress, une période d’adaptation de 24h est réalisée. La mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Avant la mise à mort, lors de la phase terminale, les animaux seront anesthésiés via une injection intrapéritonéale d’un mélange de Kétamine/Xylazine (0,1mL/10g souris) à la dose de 160mg/kg pour la Kétamine et 8mg/kg pour la Xylazine. Des points limites spécifiques ont été définis sur une grille de score de sévérité allant de 0 à 3. Les souris sans perte de poids ayant un score compris entre 2 et 3 recevront un analgésique (Ketoprofen 5mg/kg) et seront observées quotidiennement. Les souris avec un score ≥3 ou ayant une perte de poids de plus de 20% par rapport à leur poids initial, seront mises à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Les souris ayant une perte de poids comprise entre 10 et 20% par rapport à leur poids initial seront observées tous les jours et auront accès à un complément nutritionnel hydraté (DietGel). En cas d’échec de la complémentation ou du traitement par analgésique, les animaux seront mis à mort par inhalation progressive de CO2 dans un appareil dédié.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Pour étudier l’efficacité du traitement à prévenir l’apparition de lésions rénales, le traitement sera initié à 1 mois de vie (avant le début de la maladie) et sera poursuivi jusqu’à 5 semaines de vie pour analyser un marqueur de réponse rapidement après le traitement ou jusqu’à 5 mois de vie, pour évaluer l’état des lésions rénales à l’âge de la phase exponentielle de la maladie. Pour évaluer l’efficacité du traitement à guérir les lésions rénales, le traitement sera initié à 5 mois de vie, après apparition des lésions rénales, et l’efficacité du traitement à guérir ces lésions sera évaluée entre 7 et 12 mois de vie.

64 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le cerveau sous anesthésie, puis jusqu'à quatre injections intraveineuses et huit injections intrapéritonéales d'un anticorps sur trois à six mois, avant d'être tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur décrit des épendymomes pédiatriques sans traitement efficace et affirme qu'en l'absence de modèle cellulaire in vitro, le modèle animal est "indispensable". Il annonce espérer améliorer la survie des enfants atteints "à court terme".

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les épendymomes sont des tumeurs intracrâniennes retrouvées très fréquemment chez l’enfant. Ces tumeurs sont chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes malgré les exérèses chirurgicales. Au cours des dernières décennies, leur traitement n’a connu aucun progrès. A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par un modèle animal. Nous avons développé plusieurs modèles de cette maladie à partir de tumeurs de patients que nous avons pu modifier en ajoutant un gène, qui permet un suivi de ces modèles par imagerie. Ces modèles sont très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité d'un anticorps monoclonal ainsi que ces propriétés de répartition dans les tissus atteints. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules pourront être directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.

Bénéfices attendus

Les épendymomes sont des tumeurs pédiatriques chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes et aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par l'anticoprs monoclonal objet de ce projet est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie des enfants atteints à court terme.

Procédures

Les animaux seront greffés avec des tumeurs dans le cerveau sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Les animaux recevront au maximum 4 injections de produits en intraveineuse et 8 injections en intrapéritonéales, toutes injections seront réalisées sous anesthésie locale (lidocaïne) réparties entre 3 et 6 mois (durée pour chaque 1 minute).

Impact sur les animaux

En fin de procédure, les animaux pourront présenter des symptômes neurologiques (principalement apathie). Les doses d'anticorps monoclonal utilisée pour traiter les souris sont bien inférieures au doses maximales tolérées: aucune toxicité n'est donc à attendre du traitement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer le sang et le cerveau et de pouvoir réaliser des analyses complémentaires ex vivo.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par le modèle animal. Cependant, nous avons pu montrer que les épendymomes de patients présentent une très forte expression de certains récepteurs, constituant une cible thérapeutique très prometteuse. De plus, il est reconnu que la barrière hémato-enchéphalique est un réel frein quant aux passage de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc indispensable d’évaluer l'efficacité du traitement par l'anticorps monoclonal pressenti dans un modèle animal pertinent.

Réduction

Nos greffes sont suivies par imagerie. Ce suivi permet d'estimer le volume tumoral. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédure et également d'assurer un suivi clinique précis et pertinent de l'évolution des tumeurs cérébrales. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogène et reproductible. Le nombre de souris a été déterminé de façon optimale par calcul de puissance les croissances tumorales des animaux traités ou non. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés,en analyse de variance ou pour les comparaisons de groupes deux à deux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antalgique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 3 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité du médicament. Des points limite précoces spécifiques ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines (population cible pédiatrique).

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de BrdU, puis sont tuées 24 heures plus tard pour prélever la moelle osseuse de leurs fémurs et tibias, afin d'étudier le rôle de la protéine HSF1 dans la formation des globules rouges. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur le poisson zèbre et des cellules humaines de sang de cordon, mais affirme que ces modèles ne permettent pas de tester son hypothèse au niveau de la moelle osseuse. La retombée annoncée reste fondamentale, définir HSF1 comme molécule clé de l'érythropoïèse.

Objectifs

L’érythropoïèse est le processus de formation de globules rouges. C’est un phénomène permanent et débute lorsqu'une cellule souche pluripotente (donnant naissance à n'importe quelle cellule sanguine) s’engage en progéniteurs érythroïde qui, par des phénomènes de prolifération et de maturation, donnera naissance à des érythrocytes. La proportion de progéniteurs érythroïdes dans la moelle osseuse est faible (-d’1 % des cellules). On estime la production moyenne de globules rouges à 10 milliards de cellules par heure. Il existe une remarquable expansion du compartiment érythroïde ainsi qu’une fine régulation de l’érythropoïèse au niveau cellulaire et moléculaire. Notre équipe a montré que les protéines de choc thermiques (HSP) sont impliquées dans l’érythropoïèse. Nos résultats préliminaires chez le poisson-zèbre montrent que la protéine HSF1 (Heat Shock Factor 1), contrôlant l’expression des HSPs, est également nécessaire à l’érythropoïèse, et de façon partiellement indépendante des HSPs. Nous avons observé une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons dans lesquels l’expression d’HSF1 est inhibée. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. Des travaux récents ont montré que de nombreux gènes n’appartenant pas à la famille des HSP sont régulés par HSF1 et jouent un rôle fondamental dans le cycle et la différenciation cellulaire. Notre hypothèse est que des gènes essentiels à l’érythropoïèse seraient également régulés par HSF1. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons besoin, dans des souris déficientes en HSF1 (Hsf1-/-), de mesurer les quantités d’érythrocytes dans le sang d’une part, et d’autre part de tester la capacité des précurseurs érythrocytaires de la moelle à former des globules rouges. La formulation sanguine de nos animaux de phénotypes sauvages (WT) et déficients pour HSF1 (Hsf1-/-), sera analysée grâce à un prélèvement sanguin (veine caudale). Après anesthésie, la mise à mort permettra de récupérer leurs fémurs et tibias afin d’en extraire la moelle osseuse dans le but de déterminer : Sa capacité à réaliser l’érythropoïèse via un phénotypage par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire (progéniteurs et précurseurs). Le niveau d’expression d’HSF1. L'état du cycle cellulaire des cellules en cours de différenciation érythroïde via injection intrapéritonéale de BrdU

Bénéfices attendus

Nos résultats chez le poisson-zèbre montrent une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons délétés en HSF1. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. La confirmation de ces résultats dans un modèle murin in vivo permettrait de définir HSF1 comme une molécule clé de la régulation de l’érythropoïèse.

Procédures

Les animaux vigiles recevront une injection par voie intrapéritonéale de BrdU (bromodésoxyuridine) (injection unique ; 3-4 secondes). 24h après injection, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés, la moelle osseuse sera extraite des fémurs et des tibias prélevés et l’analyse du cycle cellulaire réalisée par cytométrie en flux sur la base du phénotypage érythroïde précédemment mis au point.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles relatifs à l’utilisation de BrdU sur modèle murin sont les suivants : o Diarrhée o Léthargie o Agression o Perte de poids o Lésions inflammatoire cutanées o Réduction de la croissance du pelage o Atteinte hématologique (anémie, leucopénie, thrombopénie) Ces effets peuvent être observés dans le cas d’une exposition longue à la molécule (6 semaines pour une administration via l’eau de boisson ou 1 semaine par injection intrapéritonéale quotidienne). Dans notre cas de figure, nous n’excèderons pas 24h post injection ce qui, selon nous, limitera l’apparition de tels effets. Sachant cela, nous porterons toutefois une attention particulière à ces paramètres durant les 12 à 24h suivant l’injection de BrdU afin de garantir au maximum un qualité de vie optimale de nos animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, nous projetons de prélever et d’utiliser les moelles osseuses issues des tibias et fémurs des animaux de type sauvages (Wild Type ; WT) et déficients pour le facteur HSF1 (Hsf1-/-). Ce mode d’analyse sera réalisé ex-vivo par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire de nos souris.

Remplacement

Nos résultats préliminaires obtenus dans le modèle de poisson zèbre nous a permis à la fois de remplacer l’utilisation de petits mammifères tels que les souris (Mus musculus ; A1) et d’en réduire le nombre au regard des différents axes restant à être investigués. Toutefois, ce model ne nous permet pas de tester notre hypothèse de régulation de gènes essentiels à l’érythropoïèse par HSF1 car 1) il nous permet seulement de travailler sur l’érythropoïèse embryonnaire et 2) l’étude des gènes régulés ne peut se faire qu’au niveau du poisson entier, et non pas au niveau de la moelle osseuse (site de l’érythropoïèse).

Réduction

En plus du modèle poisson zèbre, nous avons obtenu un ensemble de données grâce à l’utilisation de cellules souches et cellules progénitrices érythroïdes humaines à partir de sang de cordon ombilical. La réalisation de telles expériences sur ce matériel cellulaire nous a permis d’affiner nos axes de recherche, d’affiner notre investigation relative aux voies de signalisation intracellulaire d’intérêts ainsi que nos cibles géniques. Ceci ayant pour répercution la réduction, in fine, du nombre d’expérience à réaliser sur le modèle murin (Mus musculus) et par extension la réduction du nombre d’animaux à utiliser afin de confirmer nos résultats. Nous estimons à 60 le nombre total d’animaux qui seront utilisés dans le cadre de la phase expérimentale (30 Wild Type ; WT (phénotype sauvage) / 30 Hsf1-/- (déficientes pour le facteur HSF1) toutes expérimentations comprises). Ce nombre d’animaux correspond au nombre minimal permettant d’obtenir des résultats significatifs avec le test statistique utilisé ainsi que les mises au point (principalement sur des souris de phénotype sauvage).

Raffinement

Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse de nos animaux dans le cadre de nos expériences nécessitant une intervention (injection intrapéritonéale) sur animaux vigiles, nous avons basé notre méthodologie sur des travaux optimisés, revus et publiés dans la littérature scientifique. Pour l’ensemble de nos animaux (injectés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…).

Choix des espèces

L’érythropoïèse murine est bien caractérisée et est proche de celle de l’homme. Les souris déficientes en HSF1 sont disponibles et viables. Nous utiliserons des souris de 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de trypanosomes africains fluorescents, puis un prélèvement sanguin tous les trois jours pendant quatre semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant une ponction intracardiaque terminale. Le porteur affirme qu'aucun dommage évident n'est attendu car la procédure s'arrête avant l'installation des symptômes, tout en déclarant la gravité modérée. Sur le remplacement, il décrit un modèle de peau en micropuce en développement mais conclut que le recours à l'animal reste "indispensable" pour l'"organisme entier".

Objectifs

Le comportement des trypanosomes extravasculaires en termes de prolifération, différentiation, migration, métabolisme et perception sensorielle est certainement déterminant pour le développement de l’infection. Nous suivrons donc la progression de l’infection chez la souris par des parasites Trypanosoma brucei brucei fluorescents et bioluminescents, par une combinaison de méthodes d’imagerie intravitale et de cytométrie. Ceci nous permettra de localiser et de quantifier les trypanosomes dans le temps et dans l’espace en distinguant les parasites intra- et extravasculaires. Le tropisme et le comportement extravasculaires de différents trypanosomes mutants seront successivement comparés à des infections par une souche sauvage afin de : 1- Déterminer la capacité des parasites extravasculaires à se différencier en formes transmissible au vecteur : 1 souche ZCH20 KO (incapable de se différencier) et 1 contrôle Add-Back, 1 souche contrôle rapporteur NLS-EGFP PAD1-UTR (noyau vert fluo si différenciée). Ces 3 souches seront injectées par voie intrapéritonéale. 2- Déterminer l’importance de la mobilité active des parasites pour leur tropisme extravasculaire : 1 souche DNAI1RNAi inductible (nage lente et en arrière seulement). Cette souche sera injectée par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. 3- Déterminer l’importance des fonctions sensorielles pour le tropisme et la maintenance extravasculaire du parasite : 3 souches AQP123 KO (dépourvues de canaux membranaires aquaglycéroporines) et leur 3 contrôles Add-Back. Ces souches seront injectées par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. Un traitement suboptimal à la suramine après 2 semaines d’infections nous permettra de confirmer ces observations en ciblant spécifiquement les parasites sanguins afin de n’observer que les parasites extravasculaires possiblement présents. 4- Déterminer l’importance de la glycolyse et de la néoglucogenèse chez les formes extravasculaires. L’importance du glycérol comme source de carbone sera en particulier étudiée : 1 souche GK KO (sans glycérol kinase) et son contrôle Add-back. Ces souches seront injectées par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. Un traitement suboptimal à la suramine après 2 semaines d’infections sera également réalisé.

Bénéfices attendus

La biologie des formes extravasculaires de trypanosomes reste mal connue. Le comportement des parasites extravasculaires (prolifération, différentiation, migration, métabolisme, perception sensorielle…) est certainement déterminant pour le développement de l’infection. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait donc d’envisager de nouvelles cibles diagnostiques et / ou thérapeutiques, et d’optimiser la surveillance des cas et des réservoirs asymptomatiques dans le contexte de l’élimination de la maladie.

Procédures

Une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou intradermique (quelques secondes) au début de la procédure. Une prise de sang (10ul en quelques secondes) par animal tous les 3 jours pendant 4 semaines. Une observation par imagerie intravitale sur organisme entier (

Impact sur les animaux

D’après la littérature et notre expérience avec ce modèle d’infection chronique : les symptômes de la maladie ne s’installent chez la souris qu’après plus de 4 semaines et la mort ne survient qu’à partir de 6 à 8 semaines. Dans nos conditions d’observation d’une durée maximum de 4 semaines, aucun dommage évident n’est donc attendu. De plus, l’approche d’imagerie intravitale envisagée permet une réduction significative du nombre d’animaux et minimise grandement le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur ces animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés (les animaux étant infectés).

Remplacement

Nous développons actuellement un modèle organoïde de peau en micropuce qui permettra de répondre à certaines questions à l’échelle tissulaire, et ainsi de réduire de façon substantielle les infections expérimentales de rongeurs. Toutefois, pour comprendre certains mécanismes à l’échelle de l’organisme entier, le recours à l’animal reste indispensable.

Réduction

L’approche d’imagerie intravitale envisagée permet un suivi des individus dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, selon la question biologique étudiée, entre 4 et 8 groupes seront nécessaires, contrôles inclus, et plusieurs mesures seront réalisées au cours du temps sur chaque animal. Dans ces conditions, les effectifs permettront de mettre en évidence avec suffisamment de puissance des effets moyens à larges (d entre 0.7 et 0.9). Avec 3 répétitions pour chaque expérience et plusieurs cages par groupe, les effets techniques pourront également être quantifiés et pris en compte dans l'analyse à l'aide de modèles à effets mixtes.

Raffinement

L’approche d’imagerie intravitale envisagée minimise le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur les animaux. La fréquence des observations est limitée à 3 fois par semaine et sous anesthésie gazeuse peu profonde pendant environ 10 minutes. Les prélèvements sanguins caudaux sont réalisés après application topique de lidocaïne. Les souris sont hébergées dans des conditions optimales en portoirs ventilés en animalerie A3 sous la surveillance de zootechniciens spécialisés. Elles sont suivies quotidiennement durant toute la durée de la procédure par un des 2 expérimentateurs formés impliqués dans l’étude. Leur poids est mesuré et leur état de bien-être est contrôlé avec la grille de suivi utilisée pour évaluer leur douleur, leur stress, leur inconfort, mise au point par la SBEA et disponible sur le site internet de l’animalerie centrale. Elles disposent en permanence de nourriture, d’eau et de coton (enrichissement). Une attention particulière sera prêtée aux points limites suivants : prostration ou asthénie, aspect général altéré (pelage ébouriffé, palissement des oreilles, yeux vitreux, vivacité) et perte de poids > 20% du poids initial. La durée maximum de la procédure dans le contexte d’une infection chronique est trop courte pour que des symptômes apparaissent nettement. Dans tous les cas, les phénotypes de virulence attendus pour les souches de parasites mutées sont des diminutions voire des pertes totales de virulence par rapport aux souches contrôles.

Choix des espèces

La souris est le plus petit modèle Mammifère validé disponible et suffisamment proche de l’homme pour permettre un accès à toutes les informations recherchées et une interprétation / extrapolation par analogie, et à la fois le moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Adultes de 7 semaines. Il s’agit du modèle le plus fréquemment utilisé dans la littérature, ce qui nous permettra des comparaisons.

2 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente, d'autres reçoivent des injections répétées de cocaïne dans un test de préférence de place ou des injections intracérébrales par canule, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet étudie les synapses à dopamine impliquées dans la maladie de Parkinson, la dépendance et la schizophrénie. Le porteur affirme que ces dimensions ne sont pas modélisables in vitro ou in silico, tout en prévoyant de remplacer certaines validations par de la culture cellulaire.

Objectifs

Les neurones du cerveau communiquent entre eux grâce à des neurotransmetteurs au niveau de structures très petites appelées « les synapses ». Un de ces neurotransmetteurs est la dopamine. Les synapses qui libèrent de la dopamine sont impliquées dans le contrôle de nos mouvements et la sensation de « bien-être ». Elles sont affectées dans la maladie de Parkinson ainsi que dans les troubles psychiatriques comme la dépendance aux drogues et la schizophrénie. Il est donc très important de connaître cette synapse précisément afin de permettre le progrès des approches médicales à ces maladies graves. Le but de ce projet est donc d’étudier ces synapses au sein du système cérébral de la locomotion, de la récompense, et de la prise de décision (système nigrostrié et mésocorticolimbique). Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique, et/ou une approche de marquage viral. Nous utiliserons aussi une approche de manipulation pharmacologique par la cocaïne, ou une déficience en acides gras polyinsaturés de type n-3. Ces approches seront suivies de tri par fluorescence des synaptosomes, d’analyses par immuno-blot, immuno-fluorescence et spectrométrie de masse. Ces différentes approches permettront d’analyser l’impact de ces manipulations sur la structure moléculaire et la fonction de la synapse dopaminergique. Nous testerons également les processus de récompense en utilisant des tâches comportementales de conditionnement à la préférence de place. Lors de ce test la préférence de compartiment dans lesquelles des souris reçoivent une dose de cocaine ou une solution saline est analysé.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre le rôle de SynCAM 2 (molécule d’adhésion cellulaire synaptique 2) dans la formation et la maintenance des synapses dopaminergique, de comprendre quelles sont les altérations synaptiques induites par l’apprentissage conditionné par la cocaïne, et comment le statut cérébral en acides gras polyinsaturés influence la synapse dopaminergique. Ces données seront fondamentales d’un point de vue physiopathologique étant donné que : la dégénérescence des voies dopaminergiques est centrale dans la maladie de Parkinson, la plasticité des synapse striatales doit être comprise pour mieux appréhender les altérations induites par l’abus de drogues chez les patients dépendants, l’équilibre central en acides gras polyinsaturés n-3 est affecté dans les troubles psycho-affectifs. Nos données constitueront un socle de connaissances pour l’ensemble des laboratoires impliqués dans l’étude cellulaire et moléculaire de la physiopathologie du système dopaminergique central.

Procédures

Une partie des animaux subira des procédures chirurgicales (1 fois, durée de 1h à 1h30) afin d'exciser la protéine SynCAM 2, d’exprimer des protéines fluorescentes et ou de re-exprimer la protéine SynCAM 2. Une partie des animaux recevra une injection de solution saline intrapéritonéale par jour pendant 4 jours. Une partie des animaux subira quatre injections intrapéritonéales de cocaïne et/ou de solution saline. Deux injections par jour, une le matin et une le soir et sont placées à chaque fois dans une boite d’analyse de la préférence de place pendant 20 minutes. Une partie des animaux subira 2 injections intra-canules d'agents pharmacologiques. Une injection 30 minute avant chaque injection de cocaine du protocole CPP. Les injections intra-canules durent 10 minutes, 5 minutes d'injection et 5 minutes d'attente après injection pendant lesquelles l'injecteur est laissé en place pour permettre la diffusion des agents pharmacologiques. Les injections intra-péritonéales durent 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale peut causer une perte de poids ou une infection cutanée. Le régime alimentaire peut aussi impacter le poids de l’animal. Tous ces effets indésirables seront évités par le protocole de suivi mis en place et l’expertise de l’expérimentateur habitué à ces pratiques. Enfin une accoutumance et les effets de manque qui peuvent se produire suite aux injections de cocaïne seront évités par le sacrifice des animaux 24h après la dernière injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet, soit par dislocation après induction par isoflurane, soit par l'injection d’un euthanasiant (exagon) avec sédation préalable par méloxicam suivi d'une perfusion intracardiaque afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses protéomiques, biochimiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions non modélisables sur des modèles in-vitro ou in-silico. Nous remplacerons certaines validations par la mise en place culture cellulaire de neurones dopaminergiques.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum pour obtenir assez de matériel biologique ainsi que le nombre de répétitions indépendantes pour éliminer les biais expérimentaux a été déterminé par nos expériences précédentes ainsi que celles de nos collaborateurs. Basé sur nos précédentes études ce nombre est aussi suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de la plupart des animaux de la descendance et utiliseront les mâles et les femelles. Les animaux restants dont le génotype n’est pas directement utilisable seront utilisés en contrôle de fluorescence lors du tri de synaptosomes. Du fait de cette stratégie, la grande majorité des animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. D’autre part nous réduiront le nombre de souris qui passeront en chirurgie stéréotaxique par l’emploi de souris génétiquement modifiées exprimant déjà une fluorescence (VGLUT1venus). Enfin la mise en place de protocoles aseptiques de chirurgie nous a permis de réduire d’un facteur deux le nombre d’animaux utilisés lors de notre précédente étude.

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance des animaux, les procédures suivantes sont mise en place: les animaux sont logés dans des cages communes (3 à 5 par cage de 612,5 cm2), pourvues de litière pour leur permettre de reproduire un comportement naturel de recherche de nourriture et d'un enrichissement composé d'un nid de plantes et de tube en carton pour leur permettre de ronger. Ces cages leur donnent beaucoup d'espace pour se tenir debout. Concernant la chirurgie stéréotaxique : L’ensemble de la chirurgie sera réalisée à deux opérateurs pour maintenir l’asepsie. Prévention de l'hypothermie : l'animal sera placé sur un tapis chauffant permettant d'ajuster la température du tapis en fonction de la température corporelle de l'animal (maintien à 37°C). Prévention de la déshydratation : administration d'une solution saline chaude et stérile à la fin de l'opération. Suivi, soins et hébergement, phase d'éveil: l'animal sera placé sur un tapis chaud dans une cage de récupération (~15min), avec accès à de l'eau et à de la nourriture humide, sous observation étroite pendant au moins 1h. Suivi postopératoire: l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement pendant au moins 2 jours (pesée, observations, évaluation des points limites) sur un formulaire de suivi individuel. Si des signes d'infection ou de saignement apparaissent au niveau du site chirurgical, la plaie sera nettoyée et un antiseptique local sera appliqué. L'administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien sera également systématiquement effectuée toutes les 24h après la chirurgie afin de garantir 48h de soins pour chaque souris après la chirurgie. Si nécessaire, la douleur sera soulagée par l'administration d'une injection de de ce même anti-inflammatoire 72h après la chirurgie. Pour limiter le stress des animaux lors de la procédure de perfusion les souris recevront une sédation par un anti-inflammatoire suivie 10 minutes plus tard de l'injection d'un euthanasiant. Après vérification de l'anestésie par pincement de la patte, les animaux seront perfusés en intracardiaque. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l'animal avant la perte de conscience.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles génétiquement modifiés disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations sur le cerveau mature

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes, elles sont irradiées, reçoivent des greffes de cellules souches et de cellules leucémiques humaines, puis des injections, des prélèvements sanguins et un prélèvement de moelle osseuse, l'envahissement leucémique pouvant provoquer un amaigrissement. Le projet, mené avec une entreprise de biotechnologies, teste une thérapie cellulaire dérivée des CAR-T contre les leucémies. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne produit des lymphocytes T humains matures et que seule la xénotransplantation le permet.

Objectifs

Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T modifiés génétiquement dans le but de reconnaître puis éliminer les cellules cancéreuses. Elles sont la base d’une toute nouvelle approche de traitement contre le cancer, consistant à prélever des cellules immunitaires d’un patient ou d’un donneur sain (ici, les lymphocytes T), pour les modifier génétiquement et les réinjecter chez le patient. Cette nouvelle approche est un espoir dans le traitement des cancers. Des obstacles d'efficacité, de longévité et de spécificité des lymphocytes T génétiquement modifiés restent à résoudre dans cette thérapie et malgré un taux important de réponse complète aux traitements après thérapie, la rechute de la maladie reste un défi. La perte précoce des cellules liée à leur demi-vie courte et une inefficacité est une des raisons qui expliquent les échecs de cette thérapie. Notre stratégie est une approche cellulaire par l'utilisation de cellules progénitrices de lymphocytes T exprimant un récepteur CAR, génétiquement modifiées appelées ci-après (CAR-ProTcells) qui pourrait contourner certains des obstacles rencontrés. L'utilisation de la thérapie CAR-ProTcells permettrait d’accélérer la reconstitution du thymus, lieu de production des lymphocytes T, du patient, et améliorerait l'efficacité et la durabilité du traitement. Le projet sera mené en collaboration avec une entreprise de biotechnologies qui a mis en place un procédé de production de progéniteurs T et montré son efficacité à produire un compartiment de lymphocytes T matures, importantes. Des études préliminaires ont également mis en lumière une nouvelle génération de produits d’immuno-oncologie cellulaire pour lutter efficacement contre les cancers. Ces produits cellulaires pourraient limiter les effets néfastes secondaires récurrents, par exemple la production massive de cytokines inflammatoire, de la stratégie des lymphocyte T génétiquement modifiés. Notre projet propose de mener des études précliniques dans un modèle rongeur, afin de démontrer le potentiel et l’efficacité de la stratégie CAR-ProTcells comme thérapie pour l’éradication de leucémies.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des progéniteurs de lymphocytes T génétiquement modifiés, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique chez l'humain. L’acquisition de nos données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. La stratégie de CAR-ProT cells pourrait offrir des réponses antitumorales durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs d'efficacité, de longévité et de spécificité des CART reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Irradiation : Les animaux receveurs des greffes de CSH et cellules Pro-CAR T cells. La procédure d’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles.) Injection intraveineuse rétro-orbitale des cellules 1 fois, sous anesthésie. L’injection durera 1 minute / animal après anesthésie. Injection sous cutanée, 1fois par semaine, animaux vigiles. durée 1 minute/ animal. Injection intraveineuse (queue) des cellules tumorales 1fois. L’injection durera 1 minute par animal vigile. Les souris subiront des prélèvements sanguins (au maximum 3 sur une période de 2 à 3 mois) en cours d'expérience sous anesthésie. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes par animal. Imagerie Bioluminescence sur animaux anesthésiés maximum 1 foi par semaine (dure 10 min/souris) Un prélèvement de moelle osseuse, sous anesthésie générale, avec un traitement anti-douleur avant et après l'intervention (dure environs 3 minutes)

Impact sur les animaux

L’introduction des cellules leucémiques humaines peut occasionner chez l'animal des troubles de type amaigrissement du fait de l'envahissement leucémique prononcé qui joue sur l'appétit des animaux. La durée de nos expériences ne dépassera pas 6 mois pour éviter ces effets indésirables. Nos expériences préparatoires vont anticiper ces possibles troubles en définissant la période précédant leur apparition, qui sera celle choisie pour injecter les CAR-T ou CAR-ProT cells qui devraient agir comme une thérapie. Un prélèvement de moelle osseuse sera réalisé (uniquement sur les groupes ayant reçu les cellules leucémiques du patient) qui pourrait provoquer également de la douleur.

Devenir

L'obtention des résultats requiert que tous les animaux soient euthanasiés en fin d'expériences afin de pouvoir analyser le contenu cellulaire normal et leucémique des organes des souris et donc de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long processus expérimental de mises au point et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique des CAR-ProT cells avant un développement clinique chez l'humain. Des études in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser les conditions de préparation et améliorer le produit de thérapie cellulaire. Néanmoins ces tests sont trop limitants et il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir des cellules T humaines matures et fonctionnelles. Pour l’instant, seule la xénotransplantation de cellules hématopoïétiques humaines à des souris immunodéficientes permet la maturation et la différenciation complète de progéniteurs de lymphocytes humains dans le thymus de ces souris. Nous sommes donc arrivés à un point où nous ne pouvons pas aller plus loin dans le remplacement de l'utilisation d'animaux par un modèle in vitro.

Réduction

Chaque expérience sera répétée 2 fois, afin d’accumuler les datas dans 10 à 12 animaux au total. Nous avons auparavant et au sein d’autres projets acquis des connaissances sur le modèle tumoral de cellules hématopoïétiques. Ce modèle est reproductible et la tumeur peut être éliminée par un traitement classique CAR-T. Selon nos expériences précédentes et les données de la littérature utilisant ce type de modèle, nous avons postulé que si nous accumulons des données sur 10 à 12 souris au total nous devons pouvoir observer une différence significative entre les groupes non-traités et traités par l’approche CAR-ProTcell (diminution de tumeur dans le groupe traité versus groupe non traité). Pour obtenir ces résultats sur le nombre d’animaux déposés, nous allons effectuer 2 expériences indépendantes contenant 5 à 6 souris par groupe.

Raffinement

Les animaux seront suivis très régulièrement pour mesurer l'impact des manipulations sur leur état de santé. L’état de santé sera évalué à l’aide d’une grille de score définie par la structure chargée du bien-être animal au sein de l’organisme. Cette grille permet de réagir rapidement, pour décider de la mise en place de traitements palliatifs ou d’une euthanasie Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telles que les prélèvements sanguins ou les injections de cellules seront réalisées sous anesthésie et analgésie

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes. Ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, normales ou pathologiques, et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Ce modèle est couramment utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris immunodéficientes adultes, qui joue un rôle majeur dans la maturation des lymphocytes T, ressemble à celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients.