Souris

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie, implantation d'un cathéter ou d'un dispositif médical, non pour produire des connaissances mais pour former et entretenir les compétences chirurgicales du personnel, puis est mis à mort pour vérifier la qualité du geste. Le porteur décrit une douleur et un stress attendus, une perte de poids et une baisse d'activité dans les quarante-huit heures. Il indique que des mannequins couvrent les gestes de base, mais présente l'entraînement sur souris vivantes comme "requis" par la réglementation et par la maîtrise des interventions.

Objectifs

Tous les personnels impliqués dans des études menées sur des animaux ont pour obligation d'acquérir et de maintenir leurs compétences tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de former et d'actualiser les compétences du personnel sur différents actes techniques impliquant de la chirurgie dans le but de réaliser les gestes techniques nécessaires aux études pré cliniques développées au sein de la société. Les actes chirurgicaux nécessitant une expertise élevée, l'acquisition de ces compétences est requise afin que ceux-ci soient réalisés de façon maîtrisée et reproductible.

Bénéfices attendus

L'acquisition et le maintien de compétences de gestes techniques en chirurgie est un requis réglementaire et permet d’acquérir et de maintenir la dextérité et la technicité permettant de limiter les dommages infligés à l’animal et les niveaux de douleurs non conformes au type de chirurgie réalisée. La maitrise des techniques chirurgicales obtenues par le maintien des compétences contribue par la suite à une réduction du nombre d’animaux dans les procédures. En effet, un geste technique maitrisé permet de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécéssaires. D’où l’importance de ce projet, quant à l'acquisition et au maintien des compétences du personnel intervenant sur les animaux.

Procédures

Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans une procédure maximum de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelle que soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure chirurgicale sont les suivants : - Procédure 1 (Implantation de cathéter) : environ 1 heure - Procédure 2 (Implantation de dispositifs médicaux) : environ 30 minutes. Les temps d’injection des anti douleurs sont estimés à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress est attendu nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Pour chaque procédure, la possibilité d’administrer une dose supplémentaire d’analgésique durant la période opératoire et post-opératoire en cas de signe visible de douleur est prévue. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 48h suivant les interventions, ces paramètres font l’objet d’un suivi durant la période de rétablissement des animaux. Le port de colerette éventuel ainsi que l'implantation d'un dispositif médical peuvent aussi impacter le comportement de l'animal et les décisions appropriées seront prises.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’expérimentation afin de vérifier que le geste technique a été réalisé correctement et valider la formation du personnel. De plus, si nécessaire des études histologiques pourront être réalisées afin de caractériser l’état des tissus après chirurgie.

Remplacement

Des modèles animaux artificiels (exemple : souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, l’apprentissage des bons gestes en chirurgie ainsi que de la surveillance de la profondeur d’anesthésie/analgésie et du suivi post-opératoire ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Néanmoins, certains gestes de base (exemples : sutures, incision, etc...) inclus dans les différentes procédures décrites dans ce projet pourront être réalisés sur ce type de support dans un but de remplacer l'utilisation de l'animal.

Réduction

Une meilleure maîtrise des gestes techniques permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. De plus, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, naïfs de toute expérimentation (après avis favorable de la Structure du bien être animal et du vétérinaire référent) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux impliqués dans cette demande pourra également être revu à la baisse dans les cas suivants : - lorsque les gestes techniques auront été pratiqués par un collaborateur lors d'une étude - lorsqu'un collaborateur maitrise le geste technique qu'il aurait pratiqué dans une autre société /laboratoire de recherche.

Raffinement

Le tuteur sera vigilant sur l’exécution des manipulations/gestes réalisés sur l’animal tout au long de la formation/maintien des compétences. Le tuteur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou une douleur chez l’animal. Préalablement à toute formation, des points limites seront définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. Ces points limites permettront un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des gestes techniques mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une intervention précoce et adaptée si cela est nécessaire. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une euthanasie sera réalisée immédiatement sur décision du tuteur de la formation. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie ainsi que l’analgésie nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par un vétérinaire compétent. Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex: lampe chauffante, enceinte chauffée, etc…). Les animaux seront hébergés individuellement après les chirurgies le nécessitant jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 10 jours). Afin de limiter le stress dû à l’isolement et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à l'espèce sera utilisé (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…) bien que le contact visuel entre les animaux soit tout de même maintenu.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est justifiée par le fait que les modèles de maladies sur lesquels nous travaillons pour les projets de recherche de la société sont exclusivement des modèles souris. Le maintien des compétences sur des souris non malades nous permet donc ensuite de pouvoir réaliser ces gestes sur des souris malades. Les procédures peuvent être réalisées sur des animaux juvéniles (à partir de J15) jusqu’à l’âge adulte de 3-4 mois environ et jusqu’à 7-8 mois maximum car cela correspond aux âges nécessaires dans nos différents projets, .

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique de cellules tumorales sous anesthésie puis, trois fois par semaine pendant trois semaines, un traitement de l'oreille qui provoque une inflammation cutanée, développant une tumeur locale et des métastases dans les ganglions avant la mise à mort. Le porteur décrit cette dermatite induite, épaississement, rougeur et desquamation de l'oreille. Il indique que les cibles ont d'abord été identifiées in vitro et in silico, mais présente l'expérimentation in vivo comme "nécessaire" pour comprendre une réponse immunitaire impliquant plusieurs organes.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur du système pigmentaire de la peau. Il apparait souvent sous la forme d’une tache pigmentée pour ensuite évoluer en métastases, en faisant un cancer très agressif. Normalement, notre système immunitaire nous protège des cancers en éliminant les cellules cancéreuses. Cependant, ces cellules tumorales peuvent bloquer notre système immunitaire, conduisant donc à la progression de la tumeur, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome. Les mécanismes mis en place par les cellules cancéreuses et qui stoppent notre système immunitaire sont à ce jour mal connus. Le projet vise donc à déterminer ces facteurs, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer les traitements actuels qui restent peu efficaces dans le cadre du mélanome. Nous nous intéressons particulièrement à une molécule qui est connue pour moduler la réponse immunitaire, et qui est associée à un mauvais pronostic dans les cancers du pancréas et sein. Il a été suggéré que cette molécule pourrait aussi être associée au mélanome. L’objectif du projet est donc d’identifier le rôle de cette molécule dans la progression du mélanome, et de déterminer via quels mécanismes cette molécule induit la croissance tumorale. De plus, nous évaluerons l’effet de son blocage thérapeutique, en combinaison avec des thérapies déjà existantes mais peu efficaces pour voir si cela améliore le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les signaux et cellules impliquées dans la réponse immunitaire et la croissance tumorale au cours du mélanome. Ceci permettra l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, lesquelles seront testées pour déterminer si leur blocage pourrait être un traitement potentiel en clinique pour améliorer la qualité de vie et survie des patients atteints de mélanome.

Procédures

258 souris seront anesthésiées et injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée: 5min x 9 traitements = 45min). La durée totale de la procédure par souris est de 51minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 48 souris seront injectées par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires (durée: 12min). Par la suite, ces 48 souris seront anesthésiées puis injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Enfin, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée : 5min x 9 traitements : 45min). La durée totale de la procédure est de 63 minutes. Lors de la troisième partie du projet, 126 souris seront anesthésiées puis injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée : 5min x 9 traitements : 45min). Ces souris seront ensuite injectées par voie intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée: 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30). La durée totale de la procédure par souris est de 52 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux inoculés avec des cellules tumorales développeront une tumeur au niveau locale et des métastases au niveau des ganglions lymphatiques. Le traitement des oreilles des animaux par l'analogue de la vitamine D induira une légère inflammation de type dermatite atopique au fur et à mesure du traitement, se caractérisant par une épaisseur, rougeur et desquamation de l’oreille. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A l'issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés pour étudier la réponse immunitaire impliquée dans la croissance tumorale, à savoir 432 animaux.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de progression tumorale.

Réduction

Ces souris seront utilisées afin d’étudier le rôle de la signalisation de la cytokines étudiée dans la progression du mélanome. Nous réaliserons une expérience pilote sur la réponse des différentes lignées cellulaires injectées en intradermique pour explorer de manière étendue les différentes interactions présentes au niveau du microenvironnement tumoral. La 1ère expérience pilote permettra de choisir la lignée qui fera l’objet des expérimentations du projet. La 2ème expérience pilote nous permettra de définir la dose d'anticorps bloquants à injecter. Dans un but de réduction du nombre de souris utilisées dans ce projet, l'oreille droite sera traitée avec l'analogue de la vitamine D alors que l'oreille gauche, servant de contrôle, sera traitée avec de l'éthanol. Les groupes comporteront 12 souris (paramètres étudiés : fréquence des cellules T et croissance tumorale), ce qui permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables selon les paramètres étudiés à l’aide d’un test statistique.

Raffinement

La greffe tumorale par le biais d’injection intradermique, le traitement topique avec du MC903 et la prise de photos nécessitent une anesthésie gazeuse légère (2.5% d’isoflurane) de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. Le nid sera retiré lors des traitements, mais sera remis dès la fin des traitements. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la progression tumorale (prise de photos, mesure de la taille de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Les points limites, précis et gradés pour chacune des procédures expérimentales sont définis en fonction de la grille d’évaluation de la douleur que nous avons mis en place. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de tumeurs qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale des tumeurs de 5mm sur les oreilles, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement ou peau percée au-dessus de la tumeur.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte tumoral met en jeu différents organes comme la peau et les ganglions lymphatiques, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réaction. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du mélanome. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

2 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent l'ablation des cinq sixièmes de leurs reins en deux opérations chirurgicales, puis une exsanguination terminale, tandis que les souris reçoivent une injection de glycérol provoquant une destruction musculaire avant d'être décapitées sous sédation. Le porteur reconnaît une douleur modérée et continue liée à la chirurgie rénale. Il teste des molécules contre la maladie rénale chronique et présente les modèles in vivo comme "les plus adaptés et les plus prédictifs", écartant les cultures cellulaires limitées à un seul type de cellule.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une détérioration lente et progressive de la capacité des reins à filtrer les déchets métaboliques du sang. Les causes majeures sont le diabète et l’hypertension artérielle. Les conséquences sont une acidification du sang, le développement d’une anémie, l’endommagement des nerfs, une détérioration du tissu osseux et un risque augmenté d’athérosclérose. De plus, une atteinte rénale aiguë peut devenir une maladie rénale chronique si la fonction rénale n’est pas rétablie après le traitement et dure plus de trois mois. Les traitements actuels visent à limiter les liquides, le sodium et le potassium dans l’alimentation ; la prise de médicaments destinés au traitement d’autres pathologies (telles que le diabète, l’hypertension artérielle, l’anémie et les déséquilibres électrolytiques) et, le cas échéant, à faire appel à la dialyse ou à une greffe de rein. Il existe un ensemble de données concordantes révélant que l’existence d’une atrophie continue et la diminution de la masse musculaire constituent des facteurs de risque indépendants de la mortalité chez les patients ayant une maladie rénale chronique. La lutte contre l’atrophie musculaire apparait donc comme une composante majeure pour améliorer le pronostic des patients ayant une altération de la fonction rénale. L’objet de ce projet est d’évaluer chez l’animal le potentiel de nouvelles molécules sur les fonctions musculaires et rénales, molécules dont on a démontré préalablement des effets bénéfiques sur le muscle squelettique in vitro. Deux modèles animaux ont été retenus ; le premier est un modèle aigu comparable à la rhabdomyolyse chez l’homme et le deuxième un modèle chronique avec une forte altération métabolique. • Quel est l’impact du muscle squelettique sur le bon fonctionnement du rein ? • Des molécules actives sur la fonction musculaire peuvent-elles préserver la fonction rénale ? • L’ensemble des données collectées permettront-elles de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans les maladies rénales afin de retarder et/ou diminuer le nombre de personnes dialysées ?

Bénéfices attendus

- Amélioration de la fonction musculaire - Amélioration de la fonction rénale - Retardement du moment de dialyse - Amélioration de la fonction d’autres organes. Pour l’homme, les molécules actives permettraient d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies rénales. La protection du muscle et du rein permettrait d’envisager un retardement du moment de la dialyse et de meilleures conditions de vie.

Procédures

Sur rats néphrectomisés, la procédure chirurgicale consiste à réaliser une résection au 5/6ème des 2 reins du rat. Elle est réalisée en 2 fois à une semaine d'intervalle; le rein droit est enlevé au cours de la 1ère opération, les 2/3 du rein gauche au cours de la 2nde opération. Chacune des opérations réalisées sous anesthésie a une durée moyenne par animal de 30 minutes. 2 prélèvements de sang de 500µl seront réalisés à l'extrémité caudale sur animaux vigiles (extrémité caudale après anesthésie locale) 2 semaines avant et 6 semaines après l'opération chirurgicale. Chaque prélèvement sanguin a une durée de 2 à 3 minutes. Une exsanguination terminale des rats et un prélèvement d'organes d'intérêt sont réalisés 10 à 12 semaines suivant l'opération après sédation à l'isoflurane 4%. Pour le modèle de souris présentant une atteinte rénale aigue, l'animal reçoit une injection (10 secondes) intramusculaire unique de glycérol sous anesthésie. 48 ou 72h après, chaque souris sera décapitée après sédation à l'isoflurane 4% pour permettre le recueil du sang terminal et des organes.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales entrainent une douleur modérée et continue. La chirurgie sous anesthésie générale et l'analgésie appropriée permettent d'atténuer cette douleur, la souffrance postopératoire et le trouble de l'état général. Aucune perte pondérale significative n'est attendue dans le modèle 5/6Nx ni aucun effet sur les paramètres comportementaux (activité motrice, anxiété, exploration, altération de la mémoire) malgré une forte variabilité et une fluctuation dans le temps de ces paramètres. Les différents travaux déjà réalisés sur ce modèle ne montre pas de lien entre l’aggravation des fonctions rénales et une baisse de l’activité motrice, de la cognition ou des émotions.

Devenir

Tous les rats ayant subi la procédure expérimentale de néphrectomie seront traités avec les molécules d'intérêt pendant 12 semaines minimum puis euthanasiés (prélèvement de sang + organes) Toutes les souris utilisée dans la procédure d'atteinte rénale aigue seront euthansiées au plus tard 72h après l'induction de la rhabdomyolyse (prélèvement de sang + organes)

Remplacement

Pour tester les molécules dans le cadre des pathologies rénales, les modèles vivo sont les plus adaptés et les plus prédictifs. En effet, le rein est un organe dont la structure tri-dimensionnelle est importante pour sa fonction de filtration et formé de plusieurs types cellulaires (podocytes, cellules mésangiales, cellules épithéliales). Les modèles in vitro sont restreints à l’observation d’un seul type cellulaire, sans prise en compte des interactions intercellulaires et environnementales caractéristiques d’un tissu dans son milieu d'origine. Il existe des organoïdes, cependant les structures obtenues ne sont pas organisées comme dans un rein et l’absence de l’uretère dans ces modèles empêche l’évaluation de l’ensemble des fonctions rénales. De plus, le but de ce projet est d’évaluer l’influence des muscles sur cette fonction rénale et les nouvelles thérapies envisagées sont de traiter le muscle. Ce but ne peut être atteint qu'en utilisant un modèle animal qui présente cette intégrité physique.

Réduction

Modèle de pathologie aigue (rhabdomyolyse) Une à deux études pilotes seront réalisées pour confirmer l’obtention du modèle avec un taux de réussite estimé proche de 100%. Il est donc envisagé d’injecter 10 souris par lot sur les 2 premières cohortes pour lesquelles les paramètres d’atteinte rénale et musculaire seront mesurés afin d’évaluer la robustesse du modèle obtenu (48 à 72h après induction) Les 2 lots de chacune de ces 2 premières cohortes seront des animaux contrôles injectés en intramusculaire avec du sérum physiologique (sham) et des animaux pathologiques injectés avec du glycérol 50%. Par la suite, si la mise au point est conforme aux attentes, les cohortes seront constituées de 5 à 6 lots de 10 souris pour permettre le test de 2 à 3 molécules. Il est prévu de réduire le nombre d’animaux induits à n=6 dans les lots sham et référence (quinacrine) en consolidant les données obtenues avec celles générées à l’occasion des études pilotes. Seules les molécules présentant une activité sur le modèle de rhabdomyolyse (pathologie rénale aiguë) seront évaluées sur un modèle de pathologie rénale chronique. Modèle de pathologie chronique (néphrectomie) Une à deux études pilotes seront réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires dans chaque lot test. L’induction de la pathologie rénale par néphrectomie pouvant présenter une légère variabilité, il est estimé nécessaire d’opérer 12 rats/lot pour obtenir 8 à 10 animaux présentant les signes cliniques de la maladie rénale chronique. A l’issue de la mise au point, les lots envisagés dans chaque cohorte d’étude d’un composé sont Contrôle Sham, Contrôle pathologique, référence (MnTBAP), molécules à tester. Chaque lot sera constitué de 8 à 10 animaux pour mettre en évidence des effets statistiques interprétables. Les molécules seront évaluées sur une période de 12 semaines et les cohortes seront constituées au minimum de 5 à 6 lots d’animaux pour permettre de tester 2 à 3 molécules. L’objectif est de réduire le recours à l’opération systématique d’animaux pour les lots sham, contrôle pathologique et référence. A l’issue des 2 premières études, il est prévu de ramener entre 6 et 8 le nombre d’animaux affectés au groupe sham et référence, les résultats sur ces 2 groupes seront consolidés avec les données obtenues lors des tests pilotes.

Raffinement

Pour le modèle de néphrectomie 5/6Nx, 48h avant l’opération, une analgésie pré-opératoire sera réalisée par voie orale L'anesthésie et l'analgésie pour l'opération chirurgicale seront obtenues avec l'association d'un sédatif, d'un analgésique et d'un anesthésique. Pendant l’opération, la température corporelle sera suivie et les animaux maintenus sous lampe chauffante. En fin de chirurgie, les rats recevront 2 fois/jour une dose d'antalgique pendant 3 jours. Les rats seront mis en boite individuelle jusqu'à cicatrisation complète. L'aliment dans la mangeoire sera également disposé dans la cage et un enrichissement type sizzle dry sera disposé avec la litière. La surveillance post opératoire sera quotidienne avec une grille de score associée à une feuille d'observation individuelle.

Choix des espèces

Les espèces choisies, souris pour l'atteinte rénale aigue (rhabdomyolyse), rat pour l'atteinte rénale chronique (néphrectomie) sont celles les plus couramment utilisées pour étudier ces pathologies et l'effet de nouvelles molécules permettant un traitement potentiel. Ces modèles permettent l’étude conjointe de l’atteinte musculaire et rénale. Les animaux sont des rats adultes (6-7 semaines) pour la néphrectomie et des souris adultes (7-8 semaines) pour le modèle de rhabdomyolyse. Pour ces 2 modèles, l'âge retenu permet d'inclure des animaux n'ayant pas une atteinte rénale spontanée et d'éviter une variabilité des paramètres biochimiques rénaux et plasmatiques liée à l'âge qui pourrait interférer avec l’effet attendu du traitement.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une substance induisant une fibrose pulmonaire est instillée dans la trachée au cours d'un acte chirurgical de dix minutes sous anesthésie, avec incision et suture, puis les souris sont mises à mort pour prélever les poumons. Le porteur décrit une possible perte de poids, une baisse de mobilité, un essoufflement voire une détresse respiratoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise la réponse d'un "organe entier" et retient la souris pour sa proximité respiratoire avec l'humain et ses lignées transgéniques.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, dévastatrice et mortelle. La FPI est une maladie très rare, moins d’une personne sur 2000 en France. Il s’agit d’une modification de la structure du poumon qui devient un tissu fibreux et ne remplit plus sa fonction essentielle qui est d’assurer les échanges gazeux. Le mécanisme exact n’est pas connu, et impliquerait l’exposition à des facteurs endommageant les poumons (tabac, infections virales, pollution), probablement en association avec un dérèglement des cellules immunitaires (globules blancs ou leucocytes chargés de la défense de l’organisme contre les micro-organismes pathogènes) qui favoriserait ce processus de cicatrisation excessive. Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules qui participent en temps normal à la protection contre les infections. Cependant, ces cellules peuvent dans certaines circonstances avoir un rôle délétère et favoriser l’apparition de maladies comme la fibrose hépatique (cicatrisation excessive avec perte des fonctions vitales du foie). Notre hypothèse est que les MAIT pourraient être recrutés et activés dans les poumons chez les patients présentant une forme sévère de FPI. Des résulats préliminaires obtenus chez la souris ont montré que le degré de fibrose pulmonaire est moins important chez des souris qui possèdent beaucoup de ces cellules, et qu’inversement les souris dépourvues de ces cellules ont une maladie plus sévère. L’objectif de ce projet est de confirmer les résultats obtenus précédemment suggérant que ces cellules immunitaires auraient un rôle protecteur. Pour cela, nous utiliserons le même modèle établi de fibrose pulmonaire dans différents types de souris caractérisées soit par une absence de ces cellules, soit au contraire en ayant beaucoup (comme chez l’homme). L’objectif futur sera d’utiliser ces cellules immunitaires comme cible thérapeutique pour freiner la progression de la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment se développe la fibrose et plus précisément si certaines cellules immunitaires influencent la gravité de la fibrose. A plus long terme, il permettra d’explorer une nouvelle piste thérapeutique, basée sur l’utilisation de molécules capables de moduler l’activité de ces cellules

Procédures

Introduction unique dans la trachée d’une substance induisant une fibrose du poumon, sous anesthésie générale et analgésie pré-opératoire. Il s'agit d'un acte chirurgical de 10 minutes au cours duquel une incision de la peau est réalisée afin d’instiller la substance dans la trachée à l’aide d’une seringue. Une suture de la trachée et de la peau est ensuite réalisée. Cette intervention sera réalisée une seule fois. Aucun prélèvement sur animaux vivants ne sera effectué durant le protocole. Les prélèvements de poumons et les lavages broncho-alvéolaires se feront uniquement après euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L'incision de la peau peut entrainer une gène, une irritation. Les complications possibles de l'administration de la substance sont : une perte de poids, un comportement anormal comme une baisse de la mobilité, un essoufflement ou une détresse respiratoire.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des lavages broncho alvéolaires et des poumons pour l’étude de la fibrose.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Les expériences sur cellules isolées sont complémentaires et seront réalisées dans la suite du projet, mais ne peuvent pas se substituer à l’expérience sur l’animal en sa globalité, pour plusieurs raisons : - Les expériences in vitro ne permettent pas de contrôler / recréer tous les paramètres intervenant dans le développement de la fibrose du poumon - L’accès au tissu pulmonaire humain est très limité (biopsie à visée diagnostique, greffe de poumons)

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre hypothèse de travail. Après analyse statistique le nombre de souris nécessaires pour mener à bien cette expérience est de 48 animaux (16 animaux dans chacun des trois groupes : 8 recevant la substance induisant la fibrose et 8 recevant une solution saline contrôle).

Raffinement

Le personnel responsable du protocole ou en charge d’effectuer les expérimentations sera composé de personnes formées. Afin de diminuer angoisse et douleur, une source de chaleur (tapis chauffant, lampe) sera mise en place pour éviter l’hypothermie en post-opératoire. Les animaux seront surveillés quotidiennement et un suivi clinique sera réalisé tous les deux jours pour déterminer une éventuelle souffrance avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de scores. Si une douleur/souffrance est constatée, un antalgique sera administré, de l’eau gélifiée et de la nourriture hydratée seront placées dans la cage et le suivi clinique sera quotidien. Si des animaux atteignent les points critiques définis ou ne présentent pas d'amélioration après 24 heures, ils seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris est pertinent du fait de son temps de gestation court et de par son système respiratoire qui est très similaire à celui de l’Homme. De plus, les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule ou d’une population cellulaire en particulier dans le poumon. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont très largement décrits dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. La fibrose pulmonaire est une pathologie humaine du sujet adulte.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées avant leur réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements à la queue et des injections rétro-orbitaires sous anesthésie générale, pour observer comment les mégacaryocytes de la moelle osseuse libèrent les plaquettes sanguines. Le porteur mentionne des risques d'inflammation, d'infection et d'hypothermie, et prévoit de surveiller l'automutilation au niveau de la queue. Il affirme que ce passage des cellules dans la circulation ne peut être étudié qu'in vivo, les retombées cliniques éventuelles restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements. Elles sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau multilobé. Chaque mégacaryocyte libère plusieurs milliers de plaquettes dans la circulation sanguine. A ce jour, la manière dont les mégacaryocytes interagissent avec les microvaisseaux médullaires, les traversent et libèrent les plaquettes dans le sang est incomprise. Dans ce projet, nous allons aborder les questions suivantes : 1) Comment les mégacaryocytes interagissent-ils physiquement avec les microvaisseaux, 2) Quelles sont les mécanismes moléculaires de ces interactions ? Pour cela nous utiliserons des modèles de souris et des traitements pharmacologies connus pour cibler les mécanismes d’intérêt qui seront analysés par une combinaison d’approches d’imageries. La réalisation de ce travail permettra de faire progresser nos connaissances sur la formation des plaquettes en vue d’améliorer la production des plaquettes in vitro à partir des cellules souches

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour but de mieux comprendre comment se forme les plaquettes, ainsi que le rôle joué par le microenvironnement médullaire, en particulier les protéines de la matrice extracellulaires et les macrophages dans ce procédé. Il permettra d’explorer différentes approches afin de trouver un traitement pour restaurer efficacement la numération plaquettaire observée dans des souris déficientes et à plus long terme chez les patients

Procédures

Tous les gestes invasifs (prélèvements à la queue, injections) sont effectués sous anesthésie générale. La durée de l'anesthésie est au maximum de 7 minutes pendant les opérations de prélèvements - injections par animal. Les différents animaux transgéniques (81) et traités (189) seront tous soumis à deux prélèvements à la queue un au début du traitement et l'autre en fin d'expérimentation. Les souris traitées seront par ailleurs injectées en rétro orbitaire une fois ou deux selon le produit à injecter, toujours sous anésthésie générale.

Impact sur les animaux

Les différentes molécules envisagées : GM6001, le romiplostim et les liposomes, ne devraient pas engendrer de dommage ou douleur majeurs aux souris. Cependant les risques habituellement liés à l'intervention demeurent : risque d'inflammation et d'infection aux zones d'injection et de prélèvement, hypothérmie due à l'anesthésie. En particulier, nous prévoyons la surveillance d’automutilation au niveau de la queue.

Devenir

Toutes les souris sont mises à mort pour prélèvement avant leur réveil à la fin du protocole expérimental.

Remplacement

Les mécanismes conduisant au passage des MKs dans la circulation sanguine ne peuvent pas être étudiés chez l’homme. Des animaux sont nécessaires afin de pouvoir prélever les tibias et les fémurs contenant la moelle osseuse pour étudier les processus menant à la formation des plaquettes sanguines. Ces processus mettent en œuvre simultanément des interactions entre MK, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et, vue l’imprévisibilité de l’évènement et sa rareté, ne peuvent être étudiés qu’in vivo dans des conditions ou la mégacaryopoièse est stimulée. Enfin, nous disposons de lignées de souris transgéniques thrombocytémiques (Souris Yall) qui contiennent 2 fois plus de MKs dans la moelle osseuse qui nous permettrons de cibler plus facilement des évènements intérêt qui sont rares dans une souris contrôle.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : Pendant l’hébergement, un environnement calme et non stressant est privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées, maintenues au chaud tout au long de l’expérience pour éviter une hypothermie due à l’anesthésie, les yeux protégés par du gel hydratant oculaire.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées pour augmenter la production plaquettaire). La connaissance de la souris et l’existence de modèles transgéniques adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude . Ce projet ne requière pas un stade de développement spécifique de l'animal. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 8 à 12 semaines

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections répétées de lymphocytes T génétiquement modifiés, des prélèvements sanguins, des échocardiographies sous anesthésie et une mesure de force par stimulation du nerf sciatique, avant la mise à mort pour prélever le cœur et les muscles. Le porteur décrit un affaiblissement musculaire et une baisse modérée de la fonction cardiaque liés au modèle lui-même. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés à une utilisation future, et le porteur revendique la souris comme une source "unique et indispensable" faute de système in vitro reproduisant la maladie.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations du gène de la dystrophine qui assure la stabilité structurelle des muscles squelettiques et cardiaque. Chez les patients DMD, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. La présence d’une quantité importante de tissus fibreux (fibrose) dans le muscle des patients est l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement. Pour cette raison, il est cliniquement pertinent de réduire la quantité de tissus fibreux comme une nouvelle piste dans la prise en charge de la DMD. L’une de ces pistes consiste à cibler et dégrader une protéine présente en grande quantité au niveau des tissus fibreux et ceci à l’aide de lymphocytes T génétiquement modifiés ou de nanoparticules lipidiques permettant de cibler spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin de cardiopathie a été préalablement réalisée. Cette pathologie diffère toutefois de la DMD, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables à la DMD. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des modèles murins de DMD. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la DMD.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes-T spécifiques dans des modèles murins de la dystrophie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. L’objectif de ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la dystrophie de Duchenne à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permet également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- Injection intra-péritonéale en solution saline (150 microlitres, réalisée en quelques secondes) -2 Injections intra-veineuse caudale espacées d'une semaine (solution isotonique saline contenant ou pas des lymphocytes) réalisés sous anesthésie avec un volume de 150 microlitres, avec une durée d'environ 5 minutes - 3 Prélèvements sanguins (une goutte, environ 50microlitre) espacés d'une semaine pour les deux premiers et 3 mois plus tard pour le dernier avec une durée d'une minute -Echocardiographie réalisé sous anethésie (fréquence 3, durée 20 minutes). -Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal. -Mesure de la force musculaire suite à une stimulation du nerf sciatique réalisée sous anesthésie générale et analgésie (Fréquence 1; durée 15 minutes). A l'issue de ce test la procédure sera achevée pour procéder à l’analyse histologique des tissus afin de récolter les données. Ainsi, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et si nécessaire analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci à l’exception du test de préhension et du prélèvement sanguin. Une grille d’évaluation des points limites sera établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint les points limites seront sortis de protocole précocement.

Impact sur les animaux

Ici, les souches de souris étudiées ont été choisies pour mimer la pathologie humaine. Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée de la fonction cardiaque. La contention pour l'injection intra-péritonéale et le prélèvement sanguin pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne. Le prélèvement de sang (une goutte) peut occasionner un léger stress chez l'animal, ce niveau de stress est équivalent à l'effet d'une piqure. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et receuillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité des CAR-T cells est mise en place in vitro via des tests cytotoxiques sur des modèles cellulaires musculaire et cardiaque. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité in vitro. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration histologique et fonctionnelle induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur le profil de sécurité de ce traitement grâce à la détection d’un potentiel syndrome de relargage des cytokines, effet indésirable communément observé en clinique humaine.

Réduction

Nous allons dans un premier temps vérifier grâce à des coupes histologiques issues de travaux précédents la présence des protéine d’intérêt chez des animaux d’âge et sexe différents. Le but est de sélectionner le moment optimal de l’administration de CAR-T cells pour observer un effet thérapeutique. Lors du passage à la phase in vivo, les mêmes animaux sont utilisés pour les évaluations fonctionnelles, les tests de contraction musculaire ainsi que les études d’histologie et de transcriptomique à la suite de la mise à mort. Les procédures expérimentales sont donc conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés au maximum, sans compromettre la puissance statistique de l’étude. Les calculs d’effectifs, assurés par une statisticienne, se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe. Ce nombre devrait permettre de valider le concept et tient compte de l’exclusion du protocole de certains animaux (due à l’atteinte de points limites ou de décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 300 souris. L’effectif de 25 souris par groupe a été établi grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception des mesures de la force musculaire (test de préhension) l'injection intra-péritonéale et le prélèvement d'une goutte de sang, seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse de CAR-T cells étant donné qu’elle est simple et non invasive. L'injection sera réalisée sous anésthésie et avec l'utilisation d'une source de chaleur pour dialter la veine ce qui facilitera l'injection. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, les prélèvements sanguins correspondant en terme de douleur et stress à une piqure seront réalisés sans anethésie. Des antalgiques sont prévus pour la mesure de la force musculaire qui intervient en étape finale. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité . Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des modèles murins car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la DMD. Nous utiliserons ici un modèle préclinique pertinent de la Dystrophie de Duchenne. Ces modèles développent une fibrose du myocarde et des muscles squelettiques, ainsi qu'une altération fonctionnelle et récapitule ainsi la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. Les contrôles seront des souris contrôle saines avec le même fond génétique. Ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application potentielle chez l’homme de ces approches thérapeutiques. La souris constituant le modèle sera étudiée entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances musculaires et cardiaques. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ces modèles à partir de 5 mois. Cette fourchette sera affinée en fonction de l’analyse histologique en cours de coupes issues d’études antérieures.