Souris

80 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux jours, ils reçoivent une injection dans le cerveau de bleu de méthylène ou de solution saline sous anesthésie par hypothermie sur la glace, 60 étant tués juste après l'injection et 20 gardés jusqu'au sevrage. Le porteur indique que des pertes sont attendues du fait du jeune âge et du rejet des petits par la mère après l'injection. Cette étude ne teste aucun traitement, elle sert à caler le geste avant une future recherche de thérapie génique contre la sclérose latérale amyotrophique, et le porteur affirme que la souris reste un modèle "indispensable".

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre cette maladie, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent des troubles moteurs associés à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de la stabilité à long terme de l’expression des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mettre en place des injections dans le cerveau chez la souris à l'âge de deux jours, pour permettre la libération de matériaux génétiques dans l'ensemble du système nerveux central. Dans cette étude pilote nous utiliserons du bleu de méthylène pour confirmer nos sites d'injections. Après la mise au point de ces injections, des injections avec des AAV seront réalisées dans un modèle de souris SLA, afin de valider l'effet thérapeutique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).

Bénéfices attendus

Ce projet méthodologique permettra de mettre en place un protocole pour des injections intracérébrales chez la souris à un stade de développement précoce. Cette étude pilote précède une étude de thérapie génique reposant sur l'injection de virus AAV dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique. A long terme, ce projet permettra de mettre en place de nouveaux traitements contra cette maladie incurable.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec du bleu de méthylène ou une solution saline chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l'aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable.

Réduction

Cette étude pilote vise à acquérir le geste technique ainsi, pour la reproductibilité du geste technique et la justesse des coordonnées d'injections ainsi que l'étude de la survie des animaux, nous utiliserons 80 souriceaux : 60 sacrifiés immédiatement après les injections et 20 maintenus en vie jusqu'au sevrage. Il n'y aura pas d'analyse statistique.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites suivants : -Si une souris présente des difficultés respiratoires, se réveille et/ou présente des signes de douleur durant l'injection ou au réveil, elle sera mise à mort. Les animaux maintenus en vie jusqu'au sevrage seront surveillés quotidiennement. -Si 24h après les injections une souris ne présente pas de "poche de lait" dans l'abdomen, c’est-à-dire qu'elle n'a pas pu s'alimenter avec le lait de sa mère, elle sera mise à mort -Si une souris ne retrouve pas une température corporelle normale c’est-à-dire présente une couleur bleue/violacée après les injections ou lors du retour à la mère, elle sera mise à mort. Durant le développement des souris nous contrôlerons la présence de signes cliniques d’affaiblissement (poil hirsute, prostration, difficultés à se déplacer, difficultés à s’alimenter...) Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, pour valider notre protocole et confirmer les sites d'injection.

136 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans la glande mammaire sous anesthésie, puis un gavage répété d'une molécule, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à établir un lien entre sénescence cellulaire et invasion tumorale, avec des retombées thérapeutiques renvoyées au long terme et à une "preuve de concept". Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

La sénescence cellulaire ou vieillissement cellulaire est associée à un arrêt de la croissance cellulaire. Le cancer est considéré le plus souvent comme une maladie du vieillissement. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) au cours de la cancérogenèse consiste à faire passer les cellules cancéreuses d’un état non agressif à un état agressif caractérisé par la capacité des cellules cancéreuses à se déplacer dans l’organisme et à former des métastases. La formation des métastases est responsable de 90% des décès des patients atteints de cancer. La sénescence et la TEM pourraient ainsi se produire dans les mêmes cellules cancéreuses, ce qui nous fait penser que la sénescence pourrait être un prérequis à la TEM. Notre projet vise à démontrer que la sénescence et la TEM peuvent se produire dans les mêmes cellules cancéreuses, à disséquer les régulateurs communs à ces deux processus, et à étudier si l'élimination des cellules en sénescence empêchera la TEM. Nous utiliserons différents types de cellules cancéreuses que nous cultiverons et que nous injecterons à la souris de façon à reproduire le développement d’un cancer dans un organisme entier. Les résultats obtenus seront validés à l'aide d'échantillons de cancers humains présentant une TEM. Différentes approches de biologie cellulaire seront utilisées pour manipuler la sénescence et la TEM.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet devraient établir fermement le lien entre la sénescence des cellules tumorales et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), et fournir de nombreuses informations critiques sur le processus impliqué dans l'étape précoce de dissémination et d'invasion des cellules tumorales. Les travaux pourraient conduire à la découverte que la TEM et la sénescence cellulaire, pourraient être deux processus coexistant qui apparaissent et participent à une réponse biologique commune impliquée dans la dissémination et l'invasion précoces des cellules tumorales. La « preuve de concept » d'un lien direct entre la TEM et la sénescence cellulaire, aura un impact sur la biologie du cancer en reliant divers domaines d'investigation et en ouvrant de nouvelles voies de recherche. Ces travaux devraient également ouvrir la voie au développement de stratégies innovantes pour prévenir la progression précoce des tumeurs en ciblant la sénescence cellulaire. Les travaux devraient donc fournir des pistes prometteuses pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir ou à retarder la progression tumorale et les métastases, augmentant ainsi la durée de vie des patients atteints de cancer. Ce projet devrait donc permettre de décrypter le rôle de la sénescence dans la TEM. À long terme, cela pourrait aider à identifier des médicaments ciblant les cellules en sénescence pour bloquer l’agressivité d’un cancer et ainsi la formation des métastases. Comprendre comment les métastases se forment est un enjeu majeur de santé publique, et notre projet devrait apporter des éléments dans la compréhension de la formation des métastases.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - une injection unique de cellules cancéreuses humaines dans la glande mammaire sous anesthésie générale (10-12 minutes/animal) ; - un gavage d’une molécule (ou son solvant) qui intervient 3 semaines après l’injection des cellules à raison de 5j/7 ou 3j/7 durant 1 à 7 semaines selon les groupes de traitements (1 minute/animal). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être une inflammation au site d’injection des cellules tumorales, une détresse respiratoire lors de l’anesthésie de l’animal, un amaigrissement de l’animal ou une gêne de l’animal en raison du développement de la tumeur. Les traitements seront administrés par gavage pouvant induire un stress léger mais non traumatique.

Devenir

A l’issue des temps de traitement prévus, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans la progression tumorale qui est au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Le modèle d’injection intraductale des cellules tumorales à la souris SCID reste un des meilleurs modèles à ce jour pour étudier spécifiquement l’invasion tumorale in vivo

Réduction

Le projet impliquera un total de 136 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique (test de comparaison des portions binomiales) a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (surveillance quotidienne 7j/7, contrôle des températures/hygrométrie, nombre d’animaux par cage, etc.), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude la progression tumorale. Description du ou des modèle(s) : La souris SCID est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets d'anti-tumoraux sur des cellules humaines. Stade de développement : Les souris seront utilisées à 10 semaines d'âge après 1 à 2 semaines d’acclimatation au sein de l’établissement utilisateur. Cet âge est optimal pour notre étude. En effet, la formation des tumeurs in situ à 4 semaines et des tumeurs invasives à 10 semaines a été rapportée après injection intraductale des cellules tumorales mammaire à des souris SCID femelles âgées de 10 semaines.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation corporelle totale, une injection de cellules leucémiques ou de moelle humaine, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des cures de traitement injectées dans l'abdomen sur animal vigile, puis sont tuées pour analyser leur moelle osseuse. Le porteur indique que les souris porteuses de leucémie peuvent présenter des signes de souffrance selon la progression de la maladie. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable", le contrôle d'une moelle saine traitée étant selon lui impossible à obtenir autrement.

Objectifs

Le génome silencieux (qui ne permet pas la production de protéines) représente plus de 50% du génome. Il est composé de fragments d’ADN capables de se déplacer dans le génome. Chez l’homme comme dans d’autres espèces animales, il est démontré que ces séquences peuvent interférer avec le génome codant pour des protéines avec un retentissement fonctionnel. Dans le cancer, les insertions de ces séquences dans des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être responsables de la cancérogénèse mais elles peuvent également interagir avec des séquences codantes de l’ADN pour produire de nouveaux antigènes (néoantigènes) spécifiques de la tumeur. Lorsqu’une séquence d’ADN ne doit pas être exprimée, la cellule le signale en marquant cette séquence avec une étiquette appelée méthylation. Ce phénomène de marquage est très présent sur le génome silencieux dans des maladies comme les leucémies aigues myéloïdes (LAM) limitant sa capacité d’interaction avec le reste du génome. A l’heure actuelle une partie des traitements utilisés dans ces maladies est connu pour avoir la capacité de retirer ce marquage. Notre hypothèse principale soutenue par des travaux préliminaires est que ces traitements pourraient favoriser l’interaction du génome silencieux avec le reste de l’ADN induisant des erreurs qui seraient faciles à repérer par le système immunitaire afin d’éliminer la maladie. L’objectif de ce projet est d’étudier de manière systématique l’expression du génome silencieux dans les leucémies aigues myéloïdes (LAM) soumis à un traitement. Il permettra tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes d’actions de ces traitements mais les erreurs favorisées par le traitement peuvent également constituer une source de cibles pour des thérapies spécifiques et contribuer à améliorer le pronostique effroyable de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Sur le plan scientifique, il permettra la description fine des mécanismes d’action des traitements qui retirent les marquages sur l’expression du génome silencieux dans les LAM et permettra une comparaison à des moelles saines traitées, impossibles à obtenir en dehors du cadre murin. Il permettra également d’établir un modèle de souris atteintes de LAM d’origine humaine afin de pouvoir tester d’éventuels traitements spécifiques des cibles identifiées dans le cadre d’un autre projet. Sur le plan médical, il peut permettre la découverte de cibles thérapeutiques permettant l’amélioration du pronostic de ces hémopathies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation corporelle totale (1 fois) suivie d’une injection de cellules tumorales ou de moelle saine. Des prélèvements sanguins hebdomadaires seront réalisés sur une partie des animaux. Des traitements seront administrés aux autres animaux. Ces traitements seront injectés directement dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux cures seront réalisées avec 2 jours de repos entre chaque cure. Tous ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles. Les gestes seront inférieurs à 2 minutes pour les injections/prélèvements. L’irradiation des animaux n’excédera pas 5 minutes au total

Impact sur les animaux

La réalisation des injections et prélèvements peut être source de douleur pour les animaux au moment de la piqûre. Les souris étant irradiées, le risque de toxicité en particulier digestive est présent avec une durée de quelques jours. Cependant, la dose d’irradiation étant faible, ce risque est très modéré. Les souris étant injectées avec des leucémies aigues myéloides, elles peuvent présenter des signes de souffrance dans le cas d’une progression de la leucémie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour analyse post mortem de la composition de leur moelle osseuse

Remplacement

L’analyse transcriptomique sera au préalable réalisée sur les mêmes lignées de LAM traitées in vitro. Cependant, le contrôle nécessaire qui est celui d’une moelle saine traitée par les mêmes agents est impossible à obtenir en dehors de la souris, ce traitement n’étant administré qu’à des patients malades. Par ailleurs, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule tumorale. L’utilisation du modèle Souris reste donc indispensable pour le projet.

Réduction

Le nombre d’expériences et donc d’animaux utilisés seront réduits au minimum pour permettre la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. L’analyse statistique entre les différentes conditions s’appuiera sur l’étude de l’expression différentielle des gènes en utilisant des modèles de régression linéaires. Les organes hématopoïétiques (moelle osseuse et rate) seront analysés chez toutes les souris après mise à mort.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les 2/3jours afin d’assurer leur bien-être et pour monitorer les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre projet, la souris est le modèle de choix pour ces expériences qui étudient la cancérogénèse et la recherche en thérapeutique du cancer. C’est la seule espèce présentant une souche exprimant les facteurs de croissances hématopoïétiques humains permettant une bonne prise de cellules myéloïdes à partir de moelle osseuse humaine saine dans un environnement médullaire proche de celui de l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris sur la croissance tumorale.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant dix jours un gavage ou une injection intrapéritonéale, subissent deux tests de tolérance au glucose, une coupure d'un à deux millimètres au bout de la queue et un prélèvement sanguin, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet vise à comprendre l'effet anti-hyperglycémiant de paraprobiotiques en vue d'un complément alimentaire pour l'homme. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", aucun modèle in vitro ne simulant selon lui les interactions entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

Des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de bactéries non pathogènes naturellement présentes dans l’intestin, inactivées par la chaleur (appelé paraprobiotiques) et d’un métabolite dérivé de la sérine (présent chez les bactéries et les plantes) dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse mais également dans un modèle de souris saine. Un des objectifs de notre projet est de déterminer le mécanisme biologique impliqué dans cet effet anti-hyperglycémiant. Ce projet a pour objectif final le développement d’un complément alimentaire pour prévenir le prédiabète et ainsi le développement du diabète. Pour ce faire, plusieurs paraprobiotiques ainsi que des métabolites dérivés de la sérine seront administrées par gavage ou injection intrapéritonéale à un modèle de souris saines afin d’élucider le mécanisme d’action et les tissus cibles mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner le mécanisme mis en jeu par les bactéries sélectionnées ou le métabolite bactérien dérivé de la sérine pour obtenir cet effet anti-hyperglycémiant. La mise en evidence de ce mécanisme est incluse dans un projet de maturation qui vise, à terme, à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir de ces paraprobiotiques et/ou de ce métabolite. Ce complément alimentaire jouerait un rôle anti-hyperglycémiant au stade de pré-diabète et permettrait ainsi de prévenir le développement du diabète.

Procédures

Les animaux seront gavés ou recevront une injection en intra-péritonéale quotidiennement pour une durée totale de 10 jours (deux fois 5 jours). Les animaux seront soumis également à deux tests de tolérance au glucose (test de tolérance orale (gavage oro-gastrique du glucose, de quelques secondes) ou test de tolérance avec injection de glucose en intra-péritonéale (de quelques secondes). Pour ces tests de tolérance au glucose les souris subiront une petite coupure unique à l’extrémité de la queue de 1 à 2mm (1 seconde). Un prélèvement de sang sera effectué sur animaux vigiles, au niveau de la veine submandibulaire une seule fois avant de l’euthanasie (15 secondes). Les animaux seront mis à jeun des animaux avant les tests (6h) en période diurne.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur un temps très court (moins de 10 secondes) au cours de la contention nécessaire lors des gavages et à de l’injection en IP sur une période de 5 jours. Les gavages et l’IP seront réalisés par du personnel expérimenté. D’après les résultats préliminaires du laboratoire, ces gavages avec les différents composés n’induisent pas de perte de poids. Le poids des souris sera de plus contrôlé deux fois par semaine. Comme nous devrons mettre les souris à jeun avant les tests de tolérance orale au glucose, afin d’éviter une période de jeûne trop drastique, celui-ci ne sera pas réalisée durant la phase nocturne mais en phase diurne durant 6h.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de chaque procédure et certains de leurs organes et tissus seront prélevés pour des analyses, ncessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans la régulation de la gycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus du système digestif (l’intestin) et des organes internes impliqués dans la régulation des taux de glucose dans le sang (pancréas, foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80%) compte-tenu de la variabilité connue du paramètre « glycémie » mesuré. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris contrôles et de souris traitées avec la metformine pour les deux expériences de la procédure 1 et le même groupe de souris contrôles pour les deux expériences de la procédure 2 afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : au total 2 groupes de 12 souris contrôles et 2 groupes de12 souris traitées avec de la metformine sur les deux procédures = 48 souris au lieu de de 4 groupes de 12 souris contrôles et 4 groupes de souris 12 traitées avec de la metformine sur les deux procédures, soit 96 souris (nombre divisé par 2). Des études de biochimie sur des bactéries disponibles au laboratoire nous ont permis d’identifier des protéines de la surface des paroies bactériennes potentiellement intéressantes dans le contexte de la régulation de la glycémie (ces protéines ont des structures proches d’une autre protéine bactérienne connue pour ses effets améliorateurs de la glycémie). Ces protéines sont présentes sur huit souches d’intérêt (alors que nous disposons d’une collection de 40 souches donc cela nous a permis de réduire le nombre de paraprobiotiques à tester). Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d’un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine (surveillance visuelle plus suivi du poids). Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront 3 par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses reproductibles due à une moins grande variabilité individuelle. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

40 souris vont être utilisées, gardées vivantes pour être réutilisées ensuite dans d'autres expériences, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six jours un régime supplémenté en tamoxifène, qui peut leur faire perdre du poids, puis passent un test de mémoire consistant en une tâche motrice d'environ une heure deux jours de suite. Le porteur admet ne pas savoir si la perte de poids tient à l'appétence des aliments ou à des effets métaboliques. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Objectifs

Le TNFα produit par les microglies contrôle l'activité des synapses inhibitrices dans le cortex et de ce fait, modifie certains paramètres du sommeil comme la structure des ondes lentes. Les ondes lentes sont necessaires à la consolidation de la mémoire par le sommeil. L'objectif de ce projet de montrer le TNFα microglial est necessaire à la consolidation de la mémoire par le sommeil

Bénéfices attendus

Quasiment toutes les pathologies du cerveau sont accompagnées de troubles du sommeil. D'autre part, toutes ces pathologies présentent des signes d'inflammation du cerveau, c'est-à-dire d'activation des cellules microgliales. Notre projet propose d'étudier le lien entre l'activation microgliale et les troubles du sommeil.

Procédures

Les souris seront exposées pendant 6 jours à un régime supplémenté en tamoxifen. Il est possible qu'elles perdent du poids pendant cette période. Nous n'avons pas identifié si cette perte de poids est due aux aliments qui seraient moins appétant ou à ses effets métaboliques. Les animaux feront ensuite un test de consolidation de la mémoire qui consiste en une tache motrice pendant environ 1h deux jours de suite

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux perdent du poids de manière transitoire lors du changement de régime. La manipulation des souris et le test d'apprentissage lui même sont susceptibles d'engendrer du stress et de l'inconfort aux souris.

Devenir

À l'issue des tests comportementaux, les animaux seront remis en cage de maintien sans autre manipulation. Aucune euthanasie ou prélèvements ne sera nécessaire dans le cadre de ce projet. Les animaux pourront être réutilisés par la suite dans d’autres expériences.

Remplacement

Il n'est pas possible d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Réduction

Nous utiliserons 40 souris soit deux groupes de 20 animaux. C'est selon l'article sur lequel nous fondons notre étude et les expériences précédentes d'apprentissage réalisées dans le laboratoire, le nombre minimal pour arriver à des résultats significatifs. Les resultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les souris sont stabulées en cages ventilées et leur milieu est enrichi par des copeaux de carton. Elles sont controlées tous les jours par du personnel compétent et seront sorties du protocole si elles atteignent un point limite. Pour réduire au maximum l'inconfort et le stress des souris, elles seront habituées à être manipulées tous les jours de la semaine précédent l'experience. Le jour de l'expérience, elles seront introduites dans la salle d'expérimentation 1h avant le début du test et celui-ci ne dure pas plus d'un heure, pour ne pas perturber trop leur sommeil. Enfin, l'appareil sur lequel se fera le test est concu pour que les souris qui ratent leur essai ne tombent que de quelques centimetres pour diminuer le stress lié à l'essai et les risques de blessures.

Choix des espèces

Travailler sur la souris permet de travailler dans la continuité de nos études précédentes. Puisque notre but est ici d'étudier le role du TNFα produit par la microglie, nous n'avons comme seul outil disponible les outils génétiques chez la souris. Les expériences se feront sur des jeunes adultes entre 2 et 5 mois qui est une période classique d'étude des comportements d'apprentissage liés au sommeil.