Souris

3 778 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à quatre chirurgies, injections dans la moelle ou un nerf et lésions par pincement du nerf sciatique et de la colonne dorsale, suivies de tests comportementaux nommés, test de Von Frey et test de l'autocollant, pour étudier la régénération nerveuse. Le porteur prévoit d'euthanasier les animaux qui s'automutilent ou se paralysent, signes qu'il désigne comme points limites, et met à mort l'ensemble pour prélever les tissus. Il affirme que le recours à des "organismes entiers" est "non remplaçable" et que la souris est le "standard international" du domaine.

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent plus de 35% de la totalité des maladies en Europe et ce chiffre est en augmentation constante en partie dû à l’allongement de la durée de vie. Toute atteinte au système nerveux central, à la différence des neurones du système nerveux périphérique, conduit à des pertes de fonctions vitales. Les patients doivent endurer une perte irréversible de ces fonctions puisqu’aujourd’hui encore aucun traitement ne permet de guérir ces lésions et de permettre la reformation d’un circuit fonctionnel. La compréhension des mécanismes moléculaires des maladies neurodégénératives et des lésions du système nerveux représente donc un défi majeur en biologie dans le but de développer des médicaments et traitements pour les patients. La principale cause de ces maladies l’incapacité des neurones de régénérer leurs axones après une lésion conduisant dans la plupart des cas à la mort des neurones concernés. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération axonale et à la survie neuronale est donc une étape clef dans le traitement de ces maladies. Le projet a pour but d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires qui peuvent expliquer la perte de capacité de croissance des neurones adultes et leurs susceptibilités à la mort neuronale. Ainsi, nous focalisons sur les neurones eux-mêmes et nous proposons de caractériser le rôle d’une nouvelle famille de protéine dans la régénération du système nerveux périphérique et central

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont extrêmement importants d’un point de vue fondamentale et appliqué. En effet, nos travaux vont permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent la survie des neurones et la régénération du système nerveux centrale. Notre projet va permettre de caractériser en détail une nouvelle voie et de définir précisément les acteurs importants pour la régénération du système nerveux. Non seulement nous allons identifier et valider de nouvelles cibles qui permettront de faire régénérer, mais nous allons aussi mettre en évidence la formation de nouveau circuit après une lésion. Ces données seront essentielles dans une optique de développement thérapeutique. En effet, nos travaux permettront le développement de thérapie innovante dans le domaine des maladies neurodégénératives mais aussi en cas d’atteinte traumatique.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à 4 procédures chirurgicales qui sont de classe modérée. Les souris peuvent subir une ou plusieurs chirurgies (selon la procédure). L'accumulation des chirurgies n'induit pas une gravité supplémentaire. Les animaux subiront: -l’injection intra-thécal : les souris sont endormies environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, injection et suture) est de 5 min, l’injection en elle-même durant 5 secondes - l’injection intra-nerveuse : les souris sont endormies pour environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, injection et suture) est de 10 min, l’injection en elle-même durant 5 minutes - la lésion du nerf sciatique : les souris sont endormies environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, lésion et suture) est de 5 min, la lésion correspondant à 2 pincements de 15 et 10 secondes. - la lésion de la colonne dorsale : les souris sont endormies pour environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, lésion et suture) est de 20 min, la lésion correspondant à 3 pincements successifs de 10 secondes. Les animaux subiront les désagréments liés à l’anesthésie et à la plaie qu'implique les injections et/ou les lésion qui se caractérise essentiellement par une douleur modérée. Les souris participeront à deux tests de comportement pour analyser le retour sensitif. Pour le test de Von Frey, les souris sont acclimatées durant 1h dans la pièce et 10min dans la cage pour le test. Les souris sont testées durant 5min. Pour le test de l’autocollant, les souris sont acclimatées durant 1h dans la pièce, 5min dans la nouvelle cage et elles sont testées 2 fois 5min. Elles sont testées durant 6 semaines avec une fréquence de une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies pratiquées dans le cadre de ce projet sont de classe modérée. Les souris subiront les désasgrements liés à la présence d'une souture qui sera refermée avec des agrafes, potentielles source de stress. Une legère perte de mobilité est observée dans les premières heures suivant le réveil après la lésion du nerf sciatique et/ou de la moelle. Cette diminution ne doit pas excéder les 6h post traitement sinon elle sera comptée comme point limite de la procédure. Une légère douleur est à prévoir pour les injections et la lésion du nerf sciatique. On anticipe une douleur plus importante immediatement après reveil suivant la lésion de la moelle. Les deux cas sont traités de manière spécifique dans chaque procédure. Les tests de comportement sont des tests sensitives qui n'induisent pas de douleurs. Un léger stress peut etre occasionné lors du changement de pièce ou de cage pour les tests.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutiliser.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçable car i) les paradigmes de lésion chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, ii) un très grand nombre de lignées de souris transgéniques sont déjà disponibles pour nos recherches et iii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents acteurs (neurones, cellules gliales, environement de la lésion…) et ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle murin est le standard international reconnu dans le domaine.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -La validation systématique de toutes nos préparations de matériel biologique pour s’assurer de leur efficacitées avant les manipulations -L’entrainement systématique de toutes personnes qui pratiquent les experiences pour ne pas perdre d’animaux du à de mauvaise chirurgie. -L’utilisation de test statistique optimal pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Enfin, seules les candidats validés dans les procédures in vitro seront testés in vivo.

Raffinement

Les animaux qui auront subi une intervention chirurgicale seront observés quotidiennement et seront pesés aux moins deux fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, le poids des souris sera vérifié dans la phase chronique de la lésion soit pendant une semaine post-chirurgie. Si une perte de poids est constatée ou que les souris explorent peu l’environnement, nous fournirons les croquettes de nourriture, de l’eau gélifiée ainsi que de la nourriture enrichie (boost) directement dans la cage. Si la perte de poids excède les 20% la souris sera alors euthanasiée. Nous serons attentifs à leur comportement : pour l’entretien du poil en cas de doutes, nous en discuterons avec le vétérinaire réfèrent. En cas de prostration des souris, nous euthanasierons les animaux. Nous serons vigilants au bien être des souris : elles recevront du paracétamol (4mg/mL) dans leur eau de boisson 24h avant l’intervention et ce pendant 48h. Dans les expériences de lésion du nerf sciatique, notre protocole expérimental prévoit de sacrifier les animaux 3 jours après la lésion du nerf sciatique. Ce délai court ne permet pas de voir les signes d’allodynie. Néanmoins, nous appliquerons les procédures de prise en charge de la douleur et du bien-être animal décrits ci-dessus. Pour les lésions de moelle épinière (pincement de la colonne dorsal), immédiatement après la chirurgie, les souris recevront une injection sous cutanée de buprenorphine (0.05mg/kg) et les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température au niveau de la cage. Les yeux des souris seront protégés tout au long de la procédure par ajout de gel (ocry-gel). Si l’animal s’automutile (cas rares) au niveau des pattes, l’animal sera euthanasié. Dans le cas où les sutures sont effectuées avec des agrafes, une attention particulière sera apportée au suivi de la suture. Si les animaux arrachent et/ou déplacent les agrafes, les animaux seront endormis, la suture sera nettoyée et désinfectée et de nouvelles agrafes seront mis en place. Les interventions sur la moelle (injection et lésion) sont superficielles. Dans ce contexte, nous n’induisons pas de paralysie des pattes arrière, de la queue ou de l’inhibition des fonctions urinaires. Après chirurgie, si nous constatons une paralysie, cela suggère que nous avons touché la mauvaise partie de la moelle épinière et cela représente un point limite où les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le projet consiste à comprendre les mécanismes liés aux maladies neurodégénratives et aux lésions traumatiques de la moelle épinière chez l'homme dans le but de développer de nouveaux traitement. De nombreuses études ont été menées in-vitro dans des modèles de cultures cellulaires primaires. Ces études ont identifié un certain nombre de facteurs avec un potentiel dans pousse axonale. Malheureusement, la plupart des études basées sur ces données ont été un échec une fois testées in-vivo. Ainsi l’utilisation d’organismes entiers est nécessaire. La souris représente le standard dans la communauté scientifique pour étudier les mécanismes de régénération in-vivo avec une grande similitude par rapport à l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autre modèle telle que le poisson zebre dont le système nerveux central régénère spontanement ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les paradigmes scientifiques que nous utilisons. La souris permet aussi l’utilisation de test de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles telle que le rat.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle dès l'âge de 20 jours, elles subissent une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, un placement en obscurité constante pendant deux à trois semaines et des chirurgies cérébrales avec ou sans réveil, injection d'un traceur dans l'œil ou d'un virus dans le cerveau, pour étudier les effets d'une exposition lumineuse à l'adolescence. Le porteur nomme l'isolement, la privation de lumière et la chirurgie comme sources de stress et de douleur. Il affirme que ces tests ne peuvent pas être menés in vitro et exigent des expériences à l'échelle de l'animal entier.

Objectifs

Depuis un siècle, l'éclairage environnemental est passé d'un rythme solaire naturel à un cycle lumineux artificiel et souvent irrégulier. Les sources d'éclairage moderne (LED) sont de plus en plus répandues et sont utilisées dans de nombreux appareils électroniques de notre vie courante (smartphone, tablette, etc...). Selon la fondation nationale du sommeil, 75% des enfants laissent un appareil électronique dans leur chambre quand ils dorment, et 60% des adolescents déclarent interagir avec leur écran durant l’heure précédant leur coucher. L’exposition à la lumière le matin a un effet bénéfique en synchronisant le système circadien avec le cycle environnemental jour/nuit, en augmentant la vigilance et la cognition et dans le traitement de la dépression. A l’inverse, une exposition anormale à la lumière (ALE), la nuit, altère nos rythmes biologiques, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Cet effet est médié par une cellule photosensible spécifique de la rétine : la cellule ganglionnaire à mélanopsine. Les adolescents sont très sensibles à divers facteurs de l’environnement, y compris la lumière. Ils représentent donc une population particulièrement à risque car 1) l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et 2) ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Ce projet propose une analyse multidimensionnelle allant de la cellule au comportement de l’animal. Nous proposons d'étudier si l'exposition anormale à de la lumière, pendant la période de l'adolescence, contribue à l’altération des fonctions circadiennes (rythmiques), affectives et cognitives à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet aura des résultats déterminants tant au niveau fondamental que clinique. Il permettra tout d'abord de décortiquer la relation entre une exposition aberrante à la lumière à l’adolescence et le développement des troubles circadiens / affectifs / cognitifs à l’âge adulte. A plus long terme, de nouvelles stratégiespourront être élaborées et proposées pour limiter les effets négatifs d’une surexposition à la lumière chez les adolescents.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de 20 jours d’âge et jusqu’à la fin de l’expérimentation (P20 à l'âge adulte, procédures 1-4). 2) Ensuite, à l'âge adulte, les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests seront réalisés d'un degré de sévérité légère à sévère et séparés les uns des autres d'au moins 48 h (procédure 1). 3) Les animaux subiront une chirurgie avec (procédures 2 et 4) ou sans réveil (procédure 3) . Différents groupes d'animaux seront définis. Un groupe d'animaux recevra une injection intraoculaire d’un traceur antérograde (procédure 2) sous anesthésie générale et locale renforcée si besoin et l'expérimentation durera environ 30 min ). Un second groupe d'animaux recevra, sous anesthésie générale, l’injection d’un virus en intracérébral (30 à 45 min) pour activer spécifiquement les neurones d'intérêt (procédure 4). Enfin, un dernier groupe sera anesthésié par voie générale afin de mesurer l’activité neuronale par éléctrophysiologie dans les structures cérébrales d’intérêt. Cette intervention durera entre 2 à 2h30, et est sans réveil (procédure 3).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Stress lié à l'isolement des animaux en cage individuelle à partir de 20 jours d'âge et jusqu’à l'âge adulte afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Stress lié à la réalisation d'une batterie batterie de tests comportementaux permettant d'évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests, réalisés chez les souris adultes, seront espacés les uns des autres de 48 h minimum et réalisés d'un degré de sévérité moindre à élevé. 3) Stress lié au placement des animaux adulte à l’obscurité constante pendant 15-20 jours . Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental). 3) Douleur éventuelle liée à la réalisation d'une chirurgie avec ou sans réveil et qunatifiée à l'aide d'une grille de score de la douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements de tissus post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d'évaluer l'impact d'une exposition aberrante à la lumière durant l'adolescence sur le système circadien, la cognition et l'humeur. Ces études ne pouvant êre reproduites in vitro, le projet nécessite la réalisation d'expériences dans un environnement intégral, à l'échelle de l'animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins sauvages et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.

Réduction

Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus sont réalisés chez le même animal, et certaines mises au point techniques seront réalisées en utilisant le même animal.

Raffinement

Durant toute la durée des procédures et afin de mesurer le rythme de l'activité locomotrice, les souris,à partir de 20 jours d'âge, seront placés individuellement dans des cages et mis dans une armoire avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent voir leurs congénères et ont aussi accès à leurs odeurs et bruits. De plus, pour palier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Un igloo ne peut être mis car il interfère avec le signal enregistré par les capteurs infrarouges pour mesurer l'activité. Les procédures utilisées sont de sévérité légère à sans réveil. Une grille de score de la douleur sera utilisée.

Choix des espèces

L’objectif du projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition aberrante à de la lumière bleue chez l’adolescence sur le système circadien, l’humeur et la cognition. Cette période de stimulation lumineuse aura lieu entre 20 à 40 jours d'âge (stades postnataux P20 à P40). L’impact de cette exposition sera ensuite évalué chez des animaux au stade adulte (entre 2 à 4 mois). Ce projet fait appel à un modèle murin sauvage et un modèle murin transgénique déficient en une opsine, la mélanopsine (Opn4-/-). Cette espèce a été sélectionnée car 1) elle est nocturne et sera comparée à une espèce de rongeur diurne et 2) elle permet d'accéder à un modèle transgénique déficient en mélanopsine, photorécepteur connu pour son implication dans le traitement de l'information lumineuse. Elle représente donc un modèle privilégié pour notre projet.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties entre quatre variants du SARS-CoV-2, elles reçoivent deux injections de virus inactivés et subissent des prélèvements de sang à la queue faits au scalpel, pour évaluer une méthode d'inactivation virale mise au point au laboratoire. Le porteur indique que les souris perdant plus de 20 % de leur poids seront mises à mort, les autres l'étant pour récupérer le sérum. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'induire une réponse immunitaire complète.

Objectifs

Notre étude s’inscrit dans une démarche de recherche de nouveaux vaccins pour lutter contre la pandémie de COVID19. Elle cherche à évaluer chez la souris l'efficacité de la réponse immunitaire vis-à-vis de virus SARS-CoV-2 inactivés et rendus inoffensifs par une nouvelle méthode développée dans notre laboratoire. Les vaccins actuels contre le SARS-CoV-2 visent tous à préparer le système immunitaire à se défendre, en utilisant un élément de l'enveloppe du virus : la protéine virale "Spike". Le systéme immunitaire identifie cette protéine "Spike" comme un antigène, puis réagit en fabriquant des anticorps. Cette réponse immunitaire permet au corps de se préparer à lutter contre le virus. Parmi les stratégies vaccinales, on retrouve des stratégies classuques (virus iactivés, protéines "Spike" seules ou présentées par des vecteurs viraux, comme le vaccin Astra Zeneca) et plus modernes (vaccin ARNm, vaccin ADN). Les virus inactivés peuvent être produits rapidement dans un contexte épidémique. Ils engendrent peu de problèmes de tolérance (exemlpe du Sinovac, Chine). Notre laboratoire a établi qu’un traitement chimique nouveau, basé sur un détergent, permet de détruire des virus SARS-CoV-2 et de les rendre inoffensifs. Après ce traitement, les virus apparaissent comme des particules cassées, avec une membrane déchirée, mais qui contient toujours les protéines virales majeures : "Spike", "Membrane" et "Enveloppe". L’innocuité chez la souris et l’efficacité de cette nouvelle méthode dite de ‘fractionnement’ viral ont été démontrées auparavant avec le virus de la grippe, induisant une production importante d’anticorps après injection. Cette nouvelle méthode présente de gros avantages : rapidité, facilité de mise en œuvre et application à tous les variants du SARS-CoV-2. Notre objectif est de développer de nouvelles applications de cette formulation adaptée à la prévention de la COVID19. Dans ce cadre, l’étude de l’efficacité de cette formulation nécessite une approche in vivo, chez un modèle murin très bien caractérisé pour identifier la réponse immunitaire après l'injection des coronavirus inactivés par notre détergent. Nous souhaitons vérifier que cette nouvelle méthode générant des SARS-CoV-2 inactivés mais potentiellement immunogènes permettra d'améliorer l'intensité et la qualité de la réponse immunitaire induite chez la souris. Nous réaliserons ces essais sur les quatre variants les plus importants du SARS-CoV-2.

Bénéfices attendus

Dans le cas du SARS-CoV-2, le développement de vaccins repose aujourd'hui principalement sur la reconnaissance de la protéine "Spike" par le système immunitaire. Cette stratégie a montré ses limites avec l’apparition de variants viraux présentant des mutations sur la protéine "Spike", qui permettent aux variants viraux de s'échapper en partie de la réponse immunitaire. Deux autres protéines membranaires, E (enveloppe) et M (glycoprotéine membranaire), elles aussi immunogènes, sont présentées par le coronavirus. Notre méthode permet de produire des particules virales inoffensives (non infectieuses) enrichies des protéines Spikes et des protéines membranaires "Enveloppe" et "Membrane", lesquelles présentent très peu de mutations chez les variants du coronavirus. Cette stratégie apparaît plus pertinente pour contrôler précocement l’infection virale en multipliant les cibles protéiques immunogènes, dans le cadre de la lutte urgente à mettre en place contre la COVID19.

Procédures

Dans le cadre du projet, les types et durée d'intervention auxquels seront soumis les animaux sont : - Juste avant inoculation (J0) : prélèvement de 10µl de sang (45 secondes y compris contention); - Injections (J0 et J21) de 100µl de suspension virale (5 à 6 secondes, y compris contention). Le nombre total d’animaux s’élèvera à 144 au maximum soit 36 souris par virus inactivé testé (Wuhan, Beta, Delta et Omicron). En fin d'expérimentation, une anesthésie sera utilisée afin de permettre une sédation complète de l’animal avant prélèvement sanguin puis mise à mort par du personnel formé (2-3 minutes de l'injection d'anesthésique à la mort de l'animal)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues peuvent concerner : - Les injections réalisées au niveau du péritoine, qui induisent une douleur légère au moment de l’injection et/ou un léger inconfort très limité dans le temps. - Le prélèvement de sang à la queue réalisé le même jour sur les animaux ce qui induit une douleur de très courte durée au moment de l’incision avec la lame de scalpel. - L’injection de virus inactivés (immunogène) devrait induire chez la souris une réponse immunitaire pouvant conduire à un léger inconfort (limité dans le temps) résultant de la stimulation du système immunitaire, à une éventuelle diminution de l’activité de l’animal ainsi qu’à une légère perte de poids les premiers jours post-injection.

Devenir

Tout animal inclus dans la procédure sera euthanansié soit parce qu'il aura atteint l'un des points limites de l'étude, soit pour récupération du sang en vue de l'analyse de la réponse immunitaire dans le sérum.

Remplacement

L’objectif du projet est d’induire une réponse immunitaire, principalement une réponse en anticorps neutralisant. L’utilisation de modèle in vitro ne permet pas d’induire une réponse immunitaire complète. Aucune alternative à l’utilisation des animaux n’est possible pour ce projet. Nous utiliserons un modèle de souris C57/Bl6, communément utilisé pour l’évaluation de composés immuno- thérapeutiques et de la réponse immunitaire suite à l’injection de virus inactivés. Des études in vitro ont été réalisées en amont et le seront en aval de cette étude afin de limiter au strict minimum les étapes sur animal vivant.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en utilisant des outils statistiques adaptés permettant de démontrer ou non une différence significative entre le groupe de souris traité et le groupe de souris contrôle. Nous obtenons un nombre de 6 souris par groupe pour cette étude. Un total de 12 souris est donc nécessaire pour chaque type d'étude.

Raffinement

Durant ce projet, les souris seront suivies quotidiennement et une grille de scoring permettra de déterminer si un analgésique est nécessaire pour assurer le bien-être animal. De plus une euthanasie sera programmée dès que l’un des point limite sera atteint. Les points limites principalement retenus sont : - Perte de poids supérieure à 20% du poids initial - Réaction inflammatoire sévère et irréversible au point d’injection - Diminution d’activité prolongée ou difficultés à se nourrir ou à boire

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Les animaux nécessaires à cette étude devront être des adultes de 8 à 10 semaines afin de garantir un système immunitaire mature.

Gavées de sucrose ou injectées d'insuline, maintenues environ trois heures dans un tube de contention pour cinq prises de sang à la queue, puis isolées 72 heures pour une mesure de calorimétrie, les souris de ce projet subissent jusqu'à trois fois cette série de tests en 20 à 30 semaines. 900 souris, porteuses d'un gène inactivé ou témoins, vont être utilisées, toutes tuées en fin de protocole pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un régime enrichi en graisses ou en sucre, qui peut provoquer des lésions cutanées par toilettage excessif, et certaines passent jusqu'à deux fois 30 minutes sous anesthésie pour un enregistrement cardiaque par électrodes piquées dans la peau des pattes. Aucun des gènes visés n'est nommé, le protocole devant être répété sur cinq lignées différentes chaque année, et le résumé ne dit rien des effets que leur suppression peut avoir sur les souris elles-mêmes.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux)

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

670 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles des deux premières procédures, âgées de 8 semaines ou de 12 mois, reçoivent un régime riche en graisses, des composés libérant du monoxyde de carbone par voie orale ou intrapéritonéale, et des prises de sang à la queue sans anesthésie. Les 220 autres, dont 110 souris diabétiques db/db, subissent sous anesthésie l'ablation d'un morceau de peau pour créer une plaie, et leurs organes sont prélevés 21 jours plus tard. Le porteur affirme que ce régime "n'implique pas de procédures invasives" et, avec l'une de ses molécules, ne provoque "aucun stress ni impact sur la santé des animaux", alors qu'il l'emploie pour rendre les souris obèses et qu'il qualifie lui-même leurs prises de sang d'"intervention invasive".

Objectifs

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz produit par les cellules à de très faibles concentrations. Il a été démontré qu'il régule d'importants processus physiologiques chez les mammifères, y compris les humains. Plusieurs études ont mis en évidence les actions pharmacologiques polyvalentes du CO et les scientifiques ont donc commencé à exploiter ce gaz pour des applications thérapeutiques. Dans ce contexte, une nouvelle génération de composés capables de libérer du CO a été développée. Le grand avantage de ces composés est que la quantité de CO qu'ils libèrent peuvent être mieux contrôlés en comparaison au CO gazeux. En fait, dans des expériences utilisant des rongeurs, il a été rapporté que ces composés exerçaient des actions thérapeutiques prometteuses contre diverses maladies telles que l’infarctus du myocarde, l’inflammation et les dysfonctionnements métaboliques. Plus récemment, il a été publié que l'administration orale de ces composés qui libère du CO avec une très grande efficacité chez des souris nourries avec un régime riche en graisses mène à une réduction significative du gain de poids corporel associée à une amélioration de la glycémie et à une diminution de la résistance à l'insuline. Le présent projet consiste à utiliser le même modèle d'obésité pour tester l'effet de nouvelles molécules développés récemment et qui ciblent plus efficacement le tissu adipeux. L'objectif principal est d'évaluer l'action thérapeutique de ces nouvelles molécules chez les jeunes souris et les souris âgées, puis d'évaluer si le CO possède également un effet thérapeutique sur l'obésité au cours du vieillissement. De la même manière, seront étudiés les effets protecteurs de ces nouvelles molécules, mais aussi une nouvelle technique générant localement du gaz CO dans le traitement des plaies cutanées. En effet, il est bien connu que la cicatrisation cutanée est altérée dans les maladies affectées par un dysfonctionnement métabolique tel que le diabète.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques de composés novateurs. Les résultats de cette étude nous fourniront des notions importantes sur le mécanisme d'action et l'applicabilité thérapeutique de ces molécules dans le contexte du dysfonctionnement métabolique et des plaies cutanées.

Procédures

Dans les modèles de régime riche en graisses, les animaux seront soumis à plusieurs reprises (0, 7 et 14 semanines) à un prélèvement de sang sans anesthésie (cela ne prend que 5 minutes) au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive. Dans le modèle de plaie cutanée, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour retirer un morceau de peau afin de créer la plaie. Cette chirurgie est très rapide, modérément invasive et ne nécessite pas plus de 20 à 30 minutes. Pour cette intervention, 220 animaux seront utilisés (110 souris C57BL/6 + 110 souris C57BLKS/J db/db). Après 21 jours à compter de la création de la plaie, un prélèvement de sang sans anesthésie (20 μl) sera effectué avant le prélèvement des organs.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé, il est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. Le degré de sévérité de la procédure de plaie de la peau, bien maîtrisée, est considéré de classe modérée. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et les animaux se rétablissent complètement avec peu ou pas de douleur puisque la cicatrisation de la peau est très rapide. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les 3 protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse mais seulement 4 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 4 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses (procédures 1 et 2), nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée (procédure 3), nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés (groupes contrôles vs groupes traités) dans les procédures 1 et 3 (souris jeunes), nous utiliserons 10 souris, en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Après collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d’un post test de type Bonferroni. Les résultats seront considérés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05 et si la différence entre les lots témoin et traité est inférieure ou égale à 2 avec une puissance de 0.9, comme déjà publiée, et ceci avec des effectifs de 10 animaux dans chaque groupe. Notez que la stratégie expérimentale implique l'administration par voie orale ou i.p. de différentes doses aux souris, suivi par le prélèvement de tissus. Et ce, dans le but d’effectuer des mesures de paramètres fonctionnels et biochimiques et de déterminer quelle voie d'administration et quelle dose fournit les effets thérapeutiques les plus efficaces. Dans la procédure 2, nous avons besoin d'un minimum de 30 souris par groupe pour obtenir une puissance significative afin d’étudier la longévité et la survie de souris âgées.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons essayé autant que possible d'utiliser des approches qui ne sont pas trop invasives et ainsi minimiser la douleur, la souffrance et la détresse que peuvent ressentir les animaux. Nous avons déjà montré que le régime alimentaire riche en graisses pendant 14 semaines et le traitement avec l'une de nos molécules ne provoquent aucun stress ni impact sur la santé des animaux. Par contre, si nous remarquons que pour une raison quelconque les animaux vont perdre plus de 15% de leur poids en 1 semaine nous procéderons à leur sacrifice. Concernant le protocol de plaie de la peau, les animaux subiront une euthanasie compassionnelle pour éviter la souffrance s'ils présentent une surinfection de la plaie ou un des signes suivants: prostration, dos voussé, pelage terne et hérissé, animal ne se nourrissant ou ne s’abreuvant plus, et ayant une perte de poids >15%.Nous avons également sélectionné un nombre limité de composés en utilisant moins de doses pour chacun. Nous sommes assurés que le logement et l'élevage seront effectués en prenant en compte le bien-être des animaux. Nous utiliserons des anesthésiques appropriés, et, en cas de nécessité, des analgésiques efficaces afin de minimiser la douleur des animaux. Les souris seront logées à 3 par cage, en nettoyant la cage une fois par semaine et en s'assurant qu'elles ont accès à de la nourriture et de l'eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). De manière analogue, les modèles de cicatrisation de la peau chez la souris ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris diabétiques (C57BLKSJ db/db) et les souris avec un régime alimentaire riche (HFD) ont été largement utilisées pour déterminer l’effet des drogues et des réponses inflammatoires suite à des désordres métaboliques liés au diabète et á l’obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses (procédures 1 et 2), nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée (procédure 3), nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.