Souris

2444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux et des adultes reçoivent des vaccins, des injections d’anticorps et une infection nasale par un grand nombre de bactéries de la coqueluche, avant le prélèvement de leur nez, de leurs poumons et de leurs organes lymphoïdes, pour identifier des anticorps maternels protecteurs. Le porteur indique que l’infection peut tuer l’animal, souiller son pelage et gêner sa respiration, la perte de poids survenant juste avant la mort. Il précise que les mères sont tuées au sevrage et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude.

Objectifs

Prévenir les maladies infectieuses chez l’enfant par l’immunisation maternelle et l’immunisation de l’enfant s’avère être une nécessité pour les maladies à taux infectieux (R0) élevé. Le nombre de maladies que l’on peut prévenir par la vaccination a considérablement chuté ces dix dernières années. Néanmoins, les maladies infectieuses constituent la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, en particulier dans les pays en voie de développement. Le développement de nouveaux vaccins fondés sur l’identification d’anticorps protecteurs est nécessaire pour parvenir à réduire la mortalité infantile. La coqueluche figure parmi les maladies avec un R0 très élevé et pour lesquelles le taux de mortalité infantile est élevé. Les formes graves de la coqueluche touchant les nouveau-nés sont associées à une augmentation du nombre de globules blancs dans le sang (hyperleucocytose) entraînant une hypertension artérielle pulmonaire, conditionnant le pronostic vital notamment lorsqu’une défaillance cardiovasculaire apparaît. Par le passé la mise en place d’un modèle d’hyperleucocytose chez le souriceau a permis de montrer le rôle de la toxine pertussique (PT) dans ce phénomène. Les objectifs de ce projet sont les suivant : - Objectif 1 : Identification d’anticorps anti-PT conférant une immunité contre la coqueluche. - Objectif 2 : Etude du passage sélectif des anticorps de la mère à la progéniture et de la contribution des anticorps à la clairance du pathogène chez la progéniture infectée. - Objectif 3 : Immuno-modulation de la réponse immune de la progéniture par les anticorps maternels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous caractériseront les anticorps anti-PT protecteurs contre la coqueluche et contribuant à la clairance du pathogène. Nous déterminerons l’impact du transfert d’anticorps anti-PT sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination contre la coqueluche ou à un challenge infectieux. Dans cette optique, nous étudierons l’effet de différents vaccins anticoquelucheux dans le but d’identifier la meilleure stratégie vaccinale et de concevoir des vaccins plus performants.

Procédures

Les vaccinations seront réalisées sur animaux vigiles, par injection sous-cutanée, qui est l'injection la plus indolore ayant prouvée son efficacité. L'injection en sous-cutané dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection). Deux séries de vaccinations à 4 semaines d'interval sont réalisées. Cela concerne 174 animaux. Les injections d'anticorps sont réalisées sur des souriceaux vigiles, en intrapéritonéal et dans un volume minimal de 50 uL ou bien à des souris adultes endormies, en retroorbital, dans un volume minimal de 100 uL de façon à limiter la douleur de l'animal. L'injection dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection) Une seule injection par animal est réalisée. Cela concerne 1860 animaux. Les infections en intranasal sont réalisées sur des souris endormies et dans des volumes minimaux pour éviter que l'animal se noie. L'injection en intranasal des bactéries prend 2 minutes/animal (temps de la contension et du maintien de l'animal après inoculation pour éviter qu'il se noie et vérifier son rythme cardiaque). Un animal est infecté une seule fois au cours des expériences. Cela concerne 2444 animaux. Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sur des animaux euthanasiés à l'issu des expériences. L'euthanasie dure 1 à 2 min/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection et le temps que le produit fasse effet). Cela engage la totalité des animaux inclus dans les expériences (2444).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, seule l'infection est susceptible d'induire de fortes nuisssances aux animaux. En effet, pour induire une hyperleucocytose chez les souris nous devrons inoculer un nombre élevé de bactéries virulentes ce qui peut causer la mort de l’animal. Les souris malades ont le pelage souillé et des difficultés à respirer et elles perdent du poids.

Devenir

Pour évaluer la protection des anticorps glycosylés anti-PT contre la coqueluche dans le modèle murin nous devons euthanasier l'animal et prélever son sang afin de mesurer l'augmentation du nombre de leucocytes circulants, symptôme le plus précoce associé à la maladie dans le modèle murin. La perte de poids apparaît tardivement et quasi de façon concommitente avec la mort de l'animal. De plus, nous récolterons le nez et les poumons des animaux euthanasiés pour mesurer la charge bactérienne ou la réponse immune locale. Des organes lymphoides primaires ou secondaires tels que la rate et le thymus seront également prélevés pour étudier la réponse immune en périphérie. Les mères sont euthanasiées au moment du sevrage (4 semaines) et leur sang est collecté pour mesurer le taux d'anticorps circulant et les caractériser.

Remplacement

L’étude des effets de la vaccination maternelle sur la réponse immune de la progéniture ne peut être substituée par des modèles in vitro.

Réduction

Différentes mises au point seront réalisées afin d’identifier les conditions optimales pour répondre aux problématiques posées; ce qui permettra de réaliser les expériences de grande échelle (telle que le criblage d’une banque d’anticorps glycosylés) sur un nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Des points limites ont été définis, qui seront surveillés quotidiennement tels que le comportement apathique des souris, leur pelage souillé, leur difficulté à respirer et la perte de poids. Les souris gestantes ne seront pas transportées pour limiter le stress à l’animal. Les souris gestantes auront un régime alimentaire adapté (croquettes enrichies). Du coton sera mis dans les cages pour permettre aux souris de faire un nid.

Choix des espèces

Dans un but d'étude de potentialité vaccinale et d'immunorégulation induite par les anticorps, il n'existe pas d'autres possibilités que le recours à l'In vivo, et donc aux souris dans notre cas puisqu'elles représentent un bon modèle adapté à nos études. Il est connu que la coqueluche touche tous les âges de la population et elle est mortelle chez les nourrissons non encore correctement protégés par la vaccination. Pour faire le parallèle avec le modèle murin, nous travaillerons sur des souriceaux de 7 à 9 jours, âges auquels le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un nouveau-né. Nous emploierons des souris de 4 semaines, âge auquel le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un enfant pour étudier l'effet des anticorps maternels sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination. Des souris adultes de 7 semaines, au système immunitaire mature, seront également employées comme outil de criblage, la reproductibilité et la faisabilité des expériences étant meilleure comparé au modèle d'infection néonatale.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, d’autres subissent une chirurgie du cerveau de plus de trois heures pour implanter une fibre optique, avec un isolement de quatorze jours et des tests de peur et d’anxiété, pour tester une stimulation cérébrale censée accélérer l’extinction de la peur. Le porteur reconnaît que l’isolement prolongé ajoute un stress et que le modèle n’est pas transposable directement à l’humain. Il affirme qu’aucune méthode in vitro ne permet d’étudier ce trouble reposant sur le comportement de l’animal vivant.

Objectifs

Il existe plusieurs modèles murins permettant de mimer différents aspects du trouble de stress post-traumatique (PTSD). Le plus utilisé est basé sur le principe de conditionnement de peur au contexte où un contexte nouveau est associé à un événement aversif (chocs électriques). Les souris se rappelleront que l’évènement aversif a eu lieu spécifiquement dans ce contexte et en auront peur lorsqu’elles y seront réexposées. Dans le cas d’un évènement aversif léger, en réexposant l’animal de façon répétée au contexte sans choc électrique, l’expression de la peur associée devrait diminuer jusqu’à disparaitre. Les souris comprennent qu’il n’y a plus de danger dans ce contexte. Ce processus, nommé extinction de peur, est défaillant dans le cas du PTSD. Il est donc important que, chez la souris, la peur associée au contexte persiste après plusieurs réexpositions au contexte. De plus, des traits caractéristiques du PTSD (anxiété, trouble de la mémoire, évitement, hypervigilance, freezing ou immobilité lié à la peur) peuvent être observés à l’aide de différents tests comportementaux. Pour cette étude, nous voulons montrer qu’en activant le cortex infralimbique (zone du cerveau responsable de l’extinction de peur chez la souris) lors du rappel de l’évènement, nous arrivons à accélérer et accentuer l’extinction et que cette amélioration engendrerait une diminution des symptômes associés au PTSD.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous démontrerons que les symptômes du PTSD persistent après plusieurs rappels de l’évènement aversif confirmant la qualité du modèle murin de PTSD. De plus, Le cortex infralimbique a été montré comme responsable de la diminution de l’expression de la peur après l’occurrence d’un évènement aversif léger et que, dans le cas d’un PTSD, son activité est largement diminué. Pourtant un nombre très limité d’étude cherche à rétablir cette activité. La technique de stimulation choisie nous permettra d’être spécifique quant à la région ainsi que les neurones stimulés, à l’inverse d’autres techniques de neurostimulations. La stimulation pouvant être effectuée sur l’animal libre de ses mouvements, nous pourrons montrer son importance au cours du rappel de l’évènement aversif. En clinique, parmi les techniques thérapeutiques utilisées aujourd’hui, les thérapies d’exposition semblent être de plus en plus pratiquées. En mettant le patient dans une situation où il est obligé de se remémorer le traumatisme de façon répété dans le temps tout en étant dans un endroit où il se sent en sécurité, les psychiatres cherchent à diminuer l’expression des émotions négatives associées. Malheureusement ces thérapies peuvent prendre du temps et ne sont pas aussi efficaces pour tous les patients. Nous voulons monter qu’en stimulant la région responsable de l’extinction, nous pouvons accélérer le processus. Même si non transposable chez l’Homme directement, cette étude nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour montrer l’importance de venir stimuler le cortex infralimbique pendant le rappel de l’évènement. Enfin, à ce jour, on constate qu’aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en compte des animaux femelles, posant un problème majeur dans la mise au point de thérapie chez l’Homme

Procédures

Le projet est composé de 3 expériences ayant des objectifs différents. Au cours de la première expérience, les souris vont être divisées en 3 groupes, en fonction du fait qu’elles sont exposés à un l’administration de chocs électriques (intensité moyenne, intensité faible, pas de choc) dans un lieu donné. Trois semaines plus tard, toutes les souris sont réexposées au même lieu pendant 20min par jour sur 3 jours. Enfin, le comportement des souris est évalué à l’aide de tests évaluant la peur, l’anxiété, la mémoire, l’activité. Les souris effectueront 2 tests comportementaux par jours maximum. Pour les expériences 2 et 3, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de 3h-3h30 sous anesthésie gazeuse. Elle consiste en une injection dans le cerveau et la mise en place d’une fibre optique permettant d’activer les neurones à l’aide d’une stimulation lumineuse (LED). Au cours de la chirurgie, les souris recevront une injection d’anesthésique local au niveau du crâne, d’analgésique et d’anti-inflammatoire. Pour la troisième expérience, deux semaines après la chirurgie, les souris suivront un protocole de PTSD puis de 3 réexpositions au contexte 3 semaines plus tard. Les jours de réexpositions, les souris suivront ou non un protocole pour activer les neurones : celui-ci se fera sur l’animal éveillé . Il s’agira d’une session unique de 10 min (expérience 2) ou de 3 sessions de 10min (1 session par jour sur 3 jours ; expériences 2 et 3). Cette stimulation n’est pas ressentie par l’animal et n’aura aucun effet néfaste.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé en psychiatrie par une persistance (au moins un mois) de différents symptômes envahissants comme une peur prolongée lorsque l’individu est confronté au stimulus qui a causé le PTSD. Lors de la mise au point du modèle, nous devrons vérifier ce point, et donc confronter à nouveau les animaux avec la source du stress, ce qui peut générer de l’inconfort. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni de signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Le modèle de PTSD a montré son efficacité dans plusieurs études antérieures, en particulier lorsque les souris sont hébergées seules au moins 14 jours. Nous devrons donc reproduire ces conditions d’élevage, ce qui risque d’induire un stress supplémentaire prolongé. Toutefois, les cages seront transparentes, rangées les unes à côté des autres : Les souris pourront donc se voir, s’entendre et se sentir. De plus, cette étude nécessite d’effectuer des chirurgies au niveau du cerveau. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera due uniquement à des aspects périphériques. Enfin, la stimulation lumineuse ne sera pas ressentie par les animaux et n’aura aucun effet néfaste mais demandera d’établir une connexion avec l’appareil de mesure à l’aide d’un câble, ajoutant une gêne dans les déplacements tant que l’animal n’y est pas habitué. Les souris seront donc habituées à cette technique dans leur cage d’hébergement plusieurs jours avant la stimulation. Cette habituation sera accompagnée d’une récompense alimentaire.

Devenir

Les 210 animaux de l’expérience 1 seront euthanasiés car ils ont été isolées ce qui peut déclencher des comportements agressifs après regroupement des animaux. En fin de d’expérience 2 et 3 tous les animaux seront destinés à l’étude anatomique et cellulaire. Pour cela, nous devons traiter le cerveau avec une solution de préservation des tissus injectée dans la circulation sanguine de l’animal euthanasié. Cette solution est nécessaire pour éviter la dégradation ou les modifications post mortem. Nous pourrons ainsi confirmer le site d’injection lors de la chirurgie et faire d’autres analyses post-mortem. Sans cela nous ne pourrons pas montrer que les résultats obtenus sont une conséquence de l’activation de la zone cérébrale visée.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite.

Raffinement

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite. Les souris reçoivent un injection de buprénorphine à 0.1mg/kg en IP en début de chirurgie pour une injection de Métacam à 5mg/kg en sous-cutanée après la chirurgie. Une injection de Métacam en sous-cutanée sera effectué une fois par jour pendant les deux jours qui suivent la chirurgie. Les souris seront monitorée tous les jours pendant la semaine qui suit afin de vérifier que nous n’atteignons pas le point limite.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et la neurobiologie murine, par l’expérience du laboratoire dans l’évaluation comportementale des rongeurs ainsi que dans la mise en application de la stimulation optogénétique. La zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) est un équivalent fonctionnel du cortex préfrontal ventromédian chez l’Homme. Les souris C57/BL6N seront adultes (âgées de 10 semaines) à J0 de l’expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

1064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie nasale avec des mycobactéries de la tuberculose, une partie recevant en plus des molécules immunomodulatrices, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier la réponse immunitaire à l’infection. Le porteur indique que certaines lignées perdent rapidement du poids et se prostrent, et précise qu’aucun antidouleur ni anti-inflammatoire n’est administré afin de suivre l’évolution de la maladie. Il affirme qu’aucun système in vitro ne reproduit l’infection du poumon.

Objectifs

La tuberculose est une pathologie majeure en santé humaine et en santé animale (bovins). L’agent pathogène principal de la tuberculose chez l’homme est Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et Mycobacterium bovis (Mb) pour les bovins. Le BCG est le seul vaccin actuellement commercialisé contre la tuberculose chez l'homme mais son utilisation chez les bovins n’est pas autorisée en Europe. Les traitements antibiotiques chez l’hommes sont lourds, et l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques rend les traitements conventionnels inefficaces. Une alternative aux antibiotiques pourrait être l’amélioration des compétences immunitaires, grâce au développement de stratégies d’immunomodulation, préventives ou thérapeutiques, complémentaires des moyens de lutte classiques. Pour cela, il est nécessaire d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes inflammatoires et de la réponse immunitaire de l’hôte (homme, bovin) lors de la tuberculose. Notre objectif est, grâce au modèle murin, d’améliorer nos connaissances des manifestations de la maladie et des fonctions des cellules de l’immunité innée (macrophages, neutrophiles) ainsi que leurs interactions avec l’immunité adaptative (lymphocytes) et d'identifier des facteurs de l’hôte pouvant être immunomodulés afin de mieux lutter contre l’infection.

Bénéfices attendus

Nous espérons, grâce à ce projet, mieux comprendre les rôles de neutrophiles dans la physiopathologie de la tuberculose et de comprendre les interactions de ces cellules avec l’immunité adaptative (Lymphocytes). Ces travaux permettront également d'expliquer les différences de virulence et de dissémination des différentes souches mycobactériennes. Ces travaux, très fondamentaux, pourront permettre développer des stratégies d'immunomodulation en ciblant les facteurs de l’immunité, afin de mieux lutter contre la tuberculose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale et seront ensuite infectées par voie intranasale (durée de l'intervention 15min/animal) . 288 de ces animaux recevront par voie intrapéritonéale des molécules (anticorps ou inhibiteurs) permettant de moduler l'expression de molécules cibles (durée de l'intervention 5 min/animal)

Impact sur les animaux

Nous savons par expérience que les souris C3HeB/FeJ sont beaucoup plus sensibles que les souris C57Bl/6 aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec les souches M.tuberculosis HN878 (souche clinique humaine) et M.bovis (souche référence bovine). Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, ganglion médiastinal, sang). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques d’infections du poumon et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test Mann-Whitney. Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs de type Mann-Whitney ou Bonferroni. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Aucun traitement (antidouleur ou anti-inflammatoire) n'est prévu afin de pouvoir suivre l'évolution de la maladie et comprendre le rôle du système immunitaire inné dans les mécanismes de défense liés à ces infections mammaires.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexite de la reponse immunitaire d'un organisme entier . De plus les modeles murins d'infections mycobacteriennes sont tres bien etablis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. Nous utiliserons des souris adultes agées entre 6 et 12 semaines. Poiur ce projet il nous faut des animaux ayant un systeme mature competent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop agées. De plus nous utilisons un modele validé par la communaute scientifique

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses et insulino-résistantes par un régime gras de huit semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires, la moitié subissant en plus la pose chirurgicale d’un cathéter dans la veine jugulaire, pour comparer l’effet d’une huile interestérifiée de l’industrie agroalimentaire sur le métabolisme du glucose. Le porteur situe la retombée du côté d’une meilleure compréhension de cet additif alimentaire. Il indique explorer des approches in vitro de type organe sur puce, tout en jugeant le modèle animal encore nécessaire.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'effet d'un apport en graisse interestérifiée sur le métabolisme glucidique chez la souris. Les graisses interestérifiées. Les graisses interestérifiées sont issues de l'industrie agro-alimentaires et ont été développées par de nombreux fabricants d’aliments transformés pour trouver un substitut approprié lorsque des études scientifiques ont exposé les dangers inhérents aux acides gras trans pour la santé publique. Les industriels de l'agro-alimentaires devaient trouver une forme de graisse qui offrirait toujours la durée de conservation prolongée des huiles partiellement hydrogénées, mais qui ne contiendrait pas d’acides gras trans. Les graisses interestérifiées ont donc été développées. Il s'agit d'un produit entièrement hydrogéné avec bon nombre des mêmes caractéristiques que les graisses trans, mais chimiquement plus proche des graisses saturées. La graisse interestérifiée est produite par un processus appelé interestérification, qui réorganise la structure moléculaire des huiles végétales grasses. Des données chez l'animal et l'Homme montre cependant qu'un apport de graisse interestérifiée pourrait avoir un effet délétère sur l'homéostasie énergétique (prise de poids, intolérance au glucose voire insulino-résistance). Notre projet a pour but d'étudier l'effet des graisses interestérifiées sur l'homéostasie du glucose par rapport à un régime hyperlipidique n'en contenant pas chez des souris.

Bénéfices attendus

L'ensemble de cette étude permettra de mieux comprendre les effets d'une supplémentations en huile de palme interestérifié sur le métabolisme glucidique dans un modèle préclinique d'insulino-résistance.

Procédures

Quarante souris du lot 1 et quarante souris du lot 2 animaux seront soumises à un régime hyperlipidique pendant 8 semaines qui entraînera une prise de poids et la mise en place d'une insulino-résistance. De plus les animaux subiront des prélèvements sanguins une fois par semaine (10 microlitres) et 30 microlitres la semaine 7 pour le lot 1 un pendant le test de tolérance au glucose (qui dure 120 min, 3 prélévements de 10 microlitres aux temps 0, 15 et 120 min ). Pour le lot 2, un cathéter sera implanté dans la veine jugulaire à la semaine 7 (pour les 80 souris de ce lot 2) et 30 microlitres de sang seront également prélevés à la semaine 8 pendant le clamp hyperinsulinémique euglycémique (la durée du clamp est de 120 min, et les prélèvement s ont lieu aux temps 90, 100 et 120).

Impact sur les animaux

L'étude étant limitée à 8 semaines, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables. Hormis l'apparition d'une prise de poids et d'une insulino-résistance qui sont les effets attendus du régime hyperlipidique. Siur la base de notre expérience de trente ans d'utilisation des régimes obésogènes, il faut noter que la prise de poids attendue n'induit pas une obésité massive (environ 5 grammes pour une souris de 30 g). Il n'y aura pas donc d'effets délétères majeurs. En ce qui concerne la chirurgie, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques. Le point limite est une perte de poids supérieure à 15% en suivi post-chirurgie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type "organ on chips" qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interestérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nos collègues brésiliens ont commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Ils ont aussi réalisé une étude in vivo pour trouver la bonne dose d'HPI à utiliser pendant les 8 semaines de l'expérience. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux donnees de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons sur des modèles de souris obèses depuis une 20aine d'années) nous avons estimé la taille des echantillons ( n=10 par groupe) permettant une analyse statistique efficace (test non paramétrique Mann-Whitney U). En effet les groupes de souris sont généralement très homogènes en terme de tolérance au glucose, des données physiologiques et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénèes dans des milieux enrichis avec des morceaux de bois et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte de poids supérieure à 15 % l'animal sera euthanasié. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline par des kit Elisa ultrasensibles (nécessitant 5µl de plasma), et les tests eux-mêmes seront espacés d'une semaine. Pour la série desitnée à la réalisation des clamps euglyémqiues-hyperinsuliénmiques, l'implantation du cathèter sera réalisée dans des conditions strictes d'asseptie par du personnel hautement qualifié ayant l'habitude de ce type de chirurgie. Les animaux sont anesthésiés par inhalation à l’ISOFLURANE® en 2 temps : la phase d’endormissement pendant laquelle est délivré 3,5% d’ISOFLURANE® dans l’air à un débit de 2L/min puis la phase d’entretien de l’anesthésie avec de l’ISOFLURANE® à 1,5% d’air à un débit de 0,4L/min. L’ISOFLURANE® n’ayant pas de propriétés analgésiques, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. Le cathéter est passé sous la peau et est externalisée au niveau interscapulaire. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques et le point limite est une perte de poids de 15%.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes, partagent avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique et de l’adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d’informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (30 jours) et seront nourris aux différents régimes pendant 8 semaines. La mise sous régime à un âge précoce permet d'avoir des résultats plus marquant qu'une mise sous régime qui se produirait à un âge plus avancé et mime l'apport excessif de calories pendant l'adolescence dans l'espèce humaine.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un transfert de cellules d’une souris donneuse puis des injections et des prélèvements de sang répétés, souvent par voie rétro-orbitaire, avant le prélèvement de leur sang et de leur rate, pour tester deux immunosuppresseurs contre un rejet de greffe médié par les lymphocytes NK. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids et mentionne un risque rare d’embolie lors des injections. Il affirme que l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme ne peut être appréhendé par des modèles in vitro seuls.

Objectifs

La meilleure option thérapeutique pour les patients au stade terminal d'une défaillance d'organe vital est la transplantation, qui consiste à substituer chirurgicalement l'organe défectueux par un greffon fonctionnel prélevé chez un donneur. La principale complication de la greffe d’organe est le phénomène de « rejet » qui demeure la cause majeure d’échec en transplantation. En effet, bien que de la même espèce, les individus sont génétiquement différents. Le système immunitaire du receveur va alors reconnaître des antigènes présents à la surface du greffon comme étrangers, au même titre qu’il reconnaît un agent infectieux. On distingue différents mécanismes conduisant au rejet de greffe, en particulier l’un d’eux découvert récemment fait intervenir des cellules de l’immunité du receveur appelé « lymphocytes NK ». C’est donc autour de la compréhension des mécanismes immunologiques de ce nouveau type de rejet, appelé « rejet NK » que ce projet s’articule, grâce à l’utilisation d’un modèle murin de transplantation simplifié. Dans ce modèle la transplantation sera modélisée par le transfert de cellules de souris dites « donneuses » à des souris « receveuses » issues d’un fond génétique différent, permettant de recréer un rejet NK de manière moins invasive qu’une transplantation chirurgicale. Les patients transplantés sont contraints de prendre toute leur vie un traitement immunosuppresseur qui permet de diminuer la réactivité de leur système immunitaire vis-à-vis du greffon, afin de limiter le phénomène de rejet. Ces traitements, actuellement validés pour d’autres types de rejets, n’ont à ce jour jamais été testés sur le rejet NK. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de 2 familles d’immunosuppresseurs sur ce rejet NK in vivo chez la souris, afin de pouvoir proposer ces traitements aux patients qui en sont atteints. Tout au long du projet, les conditions d'élevage, d'hébergement et de soins seront adaptées aux besoins des animaux. Les procédures utilisées dans ce projet n’occasionnent qu’une douleur et une angoisse minimes pour les animaux. Des points limites précis ont cependant été définis afin d’intervenir si besoin. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie afin de limiter toute souffrance ou stress chez les animaux. Ce projet nécessite le recours à 116 souris, nombre calculé à visée de réduction par des méthodes biostatistiques nécessaire pour répondre à la problématique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider un nouveau modèle murin de rejet NK grâce à une technique de transfert de cellules, beaucoup moins invasif que le modèle chirurgical par transplantation cardiaque. Grâce à ce modèle murin, l’efficacité de 2 familles de traitement immunosuppresseurs (déjà disponibles en clinique) pourra être évaluer spécifiquement dans ce nouveau type de rejet NK. De manière plus concrète, la validation de l’efficacité de ces traitements chez la souris pourra permettre aux patients atteints de ce rejet particulier de bénéficier de ces médicaments pour limiter la perte de leur greffon

Procédures

Deux à 3 prélèvements sanguins (chaque prélèvement sanguin dure environ 30 secondes), et 2 à 10 injections (la durée d’une injection est inférieure à une minute) seront réalisés au cours de l’expérimentation. Ces gestes seront réalisés après anesthésie gazeuse et de manière alternée gauche/droite pour les prélèvements, afin de limiter le stress des animaux. Les procédures dureront entre 5 et 18 jours. L’ensemble de gestes seront réalisés par un opérateur expérimenté de manière à veiller à engendrer le moins de stress possible sur les animaux.

Impact sur les animaux

Au vu de la durée des procédures (maximum 18 jours) et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Les principales nuisances attendues sont le stress et la douleur liés aux prélèvements et injections répétées de façon rapprochée. Les animaux seront anesthésiés par inhalation avant de procéder aux injections, ou aux prélèvements sanguins. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris avant de procéder à une injection intra veineuse par voie rétro-orbitaire ou à un prélèvement sanguin rétro-orbitaire pour limiter au maximum le stress et la douleur liés à ces gestes. L’ensemble des manipulations et gestes seront réalisées par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances pour les animaux. Les souris seront surveillées dans les minutes suivants leur réveil après anesthésie afin de contrôler leur état et comportement.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort après anesthésie gazeuse afin de prélever le sang et les rates des animaux, et procéder à l’analyse des cellules d’intérêt

Remplacement

Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité de 2 traitements immunosuppresseurs dans le traitement du rejet de greffe induit par les lymphocytes NK du receveur. Nous avons précédemment mis en évidence l'effet bénéfique de ces traitements in vitro grâce à un modèle de coculture cellulaire entre des lymphocytes NK de volontaires sains et une lignée de cellules endothéliales. Néanmoins, la complexité des mécanismes immunologiques en jeu, de même que l'effet des traitements immunosuppresseurs à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. C'est pourquoi ce projet nécessite l'emploi d'un modèle in vivo de rejet NK, permettant de confirmer les données que nous avons obtenu in vitro. Par ailleurs ce modèle de rejet NK utilise une méthode simplifiée par transfert de cellules d’une souris donneuse à une souris receveuse, beaucoup moins invasif pour les animaux que la chirurgie pour transplantation d’organe solide.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupes dans chaque procédure expérimentale a été calculé à minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables, basée sur notre expérience passée. Les paramètres de réponse immunitaire étant relativement homogène chez les souris contrôles, nous avons pris le parti de diminuer le nombre d'animaux contrôles à 5 plutôt que 8. En cas d'échec de l'une des expérimentations dû à problème technique, nous gardons la possibilité de renouveler une fois les procédures.

Raffinement

Au vu de la durée des procédures et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris anesthésiées par inhalation avant de procéder à une injection ou un prélèvement sanguin. Les gestes d'injection et les prélèvements seront réalisés par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances liées au geste. Les côtés seront alternés afin de limiter les conséquences de ces prélèvements et dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera rincé quotidiennement par sérum physiologique. Un point de compression sera réalisé au site de ponction après chaque prélèvement. Une hémorragie non contrôlée conduira à la mise à mort de l’animal. Les animaux seront surveillés dans les 15 minutes suivants leur réveil après anesthésie, afin de contrôler leur état et comportement. De plus une surveillance du comportement des animaux sera observée de manière très régulière, avant chaque geste et le lendemain des transferts de cellules. Dans de très rares cas, l’injection intraveineuse peut se compliquer d’une embolie. Les points limites suivants conduiront à la mise à mort de l’animal : coma, convulsions. Si des signes de souffrance ou des modifications de comportement tels qu’une prostration, des yeux mi-clos, un pelage hérissé, un dos vouté ou encore une absence d’interaction avec ses congénères sont observés, cela conduira à une nouvelle surveillance de l’animal le lendemain. En cas de persistance de ces signes de souffrance un antalgique de palier 1 (paracétamol) pourra être administré à l’animal. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera sorti du protocole et sera mis à mort. La perte de poids étant un indicateur clé de l’état de souffrance ressentie par les souris, ces dernières seront pesées 2 fois par semaine durant le déroulé de la procédure. Une perte de poids supérieure à 10% du poids maximum atteint par l’animal conduira à sa réhydratation avec de l’eau gélifiée durant 48h ainsi que la mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage pour favoriser l’alimentation. Une perte de poids supérieur à 20% du poids maximum de l’animal, constitue un point limite à cette procédure. L’animal sera alors mis à mort.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude du rejet de greffe. Afin de reproduire la différence génétique entre un donneur et un receveur d’organe conduisant au rejet, deux lignées de souris de fonds génétiques différents seront utilisées. Les cellules de souris donneuses, qui expriment à leur surface des antigènes différents de celles des souris receveuses, seront reconnues comme « étrangères » par les lymphocytes NK des receveuses, conduisant ainsi à leur destruction. Des souris adultes entre 8 et 15 semaines seront utilisées dans ce projet. Nous avons choisi cette fenêtre afin de laisser le temps au système immunitaire de se développer et d’atteindre sa maturité afin de répondre aux antigènes administrés.