Souris

600 souris, dont des souris au foie humanisé, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de virus des hépatites B et C, des plasmides et des composés par gavage jusqu'à deux fois par jour, puis des prélèvements sanguins répétés, pour tester des candidats médicaments. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer douleur, perte de poids et difficultés à se déplacer. Il affirme que les modèles murins constituent une approche "indispensable" quand la culture in vitro ne recrée pas les interactions d'un organe fonctionnel.

Objectifs

Bien qu’un vaccin et des traitements anti-viraux existent contre le virus de l’hépatite B et de l’hépatite C, plus de 250 millions de personnes dans le monde vivent avec une infection chronique, ce qui les exposent à un risque grave de cirrhose voire de cancer. La recherche de nouveaux traitements pour ces maladies est donc essentielle. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d'étude de l'hépatite B et de l’hépatite C, en inoculant le virus à des souris, en particulier des souches possédant un foie humanisé. Ce modèle sera utilisé, non seulement pour la compréhension de cette pathologie, mais aussi pour le développement de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

En utilisant des souris au foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier l'hépatite B et l’hépatite C et d'évaluer les effets toxicologiques et thérapeutiques de candidats médicaments déstiné à lutter contre cette pathologie avec davantage de spécifité de l'espèce cible de ces recherches : l'Homme.

Procédures

Injection intraveineuse d’adénovirus, injection hydrodynamique de plasmides, injection intraveineuse de surnageant. Chacune de ces injections sera d’une durée de 10 à 15 secondes. Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes d'administration seront déterminés sur base du poids de la souris. A titre d’exemple, le volume maximum prélevé sera de 100 μL par semaine pour une souris de 25 gr. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. L’administration de composés de recherche : réalisée par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-musculaire). Les volumes à administrer seront préétablis par le vétérinaire d’établissement et le comité de bien-être. A titre d’exemple, pour une souris de 20 g, la limite d’administration sera de 400 μL per os; 200 μL par voie sous-cutanée; 200 μL par voie intrapéritonéale; 50 μL par voie intramusculaire et 200 μL par voie intraveineuse. La durée des administrations est de 10 à 15 secondes. Le nombre de gavage maximal autorisé sera de 2 par jour.

Impact sur les animaux

De la douleur peut être induite par : l'inoculation virale intraveineuse, l'injection hydrodynamique intraveineuse de plasmides, les prélèvements sanguins et l'injection et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux étant infectés par des virus humains, ils seront euthanasiés.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, lorsqu’il n’est pas possible de recréer in vitro les interactions complexes qui peuvent exister entre un organe fonctionnel, une pathologie et les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux les impliquant, les modèles murins constituent une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 600 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 20 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Celle-ci sera objectivée par une échelle de score adaptée aux études en infectiologie. Le vétérinaire aura pleine autorité pour envisager un traitement anti-douleur ou une euthanasie de la souris pour raison éthique s’il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Deux modèles murins d’infection par le virus de l’hépatite B sont décrits dans la littérature et ont démontré leur efficacité pour prédire l’activité thérapeutique de candidats médicaments. De plus, nous maîtrisons l'humanisation du foie chez les souris. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. La procédure expérimentale requiert des animaux adultes utilisés à l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non- humanisés et 15 à 18 semaines pour les animaux humanisés.

40 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime obésogène induisant une obésité, à des gavages de glucose, à des prélèvements sanguins répétés et à un isolement, pour étudier le rôle d'un récepteur lingual dans la préférence pour le gras. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à la mise à disposition d'une nouvelle souche de souris. Le porteur indique avoir déjà testé les molécules sur des lignées cellulaires, sans effet toxique, avant de recourir aux souris.

Objectifs

Des études récentes chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon est constitué par un amas cellulaire constitué de 4 types cellulaires. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Il existe des récépteur aux acides gras, dont l'un est appelé CD36. Il est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Le but de cette étude est de démontrer l’implication in vivo, du CD36 situé au niveau de la langue dans l’action de nos molécules « faux lipides ». Pour mener à bien les objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle souche génétiquement modifiée, qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris subira une mise sous régime (obésogène ou standard), une pesée hebdomadaire, une glycémie toutes les deux semaines (prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale, nécéssitant une contention inférieure à une minute), une mesure en echoMRI toutes les deux semaines (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 minutes). A la fin du régime, les organes seront prélevés, après mise à mort. Les souris seront individualisées pendant 5J pour réaliser des doubles choix. Les mesures de dépenses énergétiques nécessiteront également une individualisation pendant 5J dans les cages de mesures. Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose nécessitant un gavage au glucose (contention de quelques secondes) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale, nécéssitant une contention inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité, ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. De même, les animaux peuvent subir un stress, lors des prélèvements répétés ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix). Les animaux disposeront d’un enrichissement supplémentaire dans leur cage de vie afin de minimiser le stress induit.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements d’organes.

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux pour cette étude. De plus, nous avons déjà étudié les mécanismes sur des lignées cellulaires in vitro, et ces tests n’ont montré aucun effet toxique, tératogénique ni mutagénique jusqu’à la concentration de 100µM.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté. Lors de prélèvements, comme la glycémie ou le prélèvement de sang, les souris seront sous anesthésie locale à la lidocaïne afin de minimiser la douleur. Enfin, les animaux étant observés quotidiennement, si un signe clinique fait apparaître un mal-être ou une douleur, ils seront euthanasiés par asphyxie au CO2.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction du KO étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un peptide amyloïde est injecté dans leur cerveau pour reproduire une perte de mémoire, puis elles reçoivent un composé pendant sept jours et passent des tests de mémoire, dont un test d'évitement où elles reçoivent un choc électrique. Les retombées attendues, l'arrivée en clinique d'un traitement contre des maladies rares, sont renvoyées au long terme. Le porteur affirme que le recours à un modèle murin de la maladie d'Alzheimer est "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est de déterminer les effets neuroprotecteurs d'un composé. Ce produit à visée thérapeutique cible un mécanisme de neuroprotection novateur et peut permettre le développement de candidats-médicaments pour le traitement de maladies rares.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant une preuve de concept d'efficacité d'un composé sur notre modèle de toxicité amyloïde. Le bénéfice attendu est à terme d'amener en clinique ce composé à visée thérapeutiques pour des pathologies rares / orphelines pour lesquelles il n'y a actuellement pas de traitement.

Procédures

Les animaux auront au cours de leur vie des injections IP (30 minutes avant) et sous cutanée 10 min avant l' inoculation du peptide amyloide 25-35 dans le ventricule cérébral droit sous anesthésie (en moins d'une minute). Ensuite durant 7 jours les animaux recevront une injection intrapéritonéale du traitement combinatoire mis en place (durée de l'injection maximum 1 minute). Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec 3 tests de mémoire d'une durée de 5 à 8 minutes maximum plus le test d'enfouissement d'une durée de 30 minutes pour tester l'anxiété des souris

Impact sur les animaux

Un certain stress lié aux injections pourra être engendré. Une perte mnésique voulue, et dûe à la diffusion du peptide amyloide dans le cerveau sera également observée. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress et pour le test d'évitement passif, les animaux recevront un choc électrique léger, (0.3 mA pendant 3 sec) afin d'évaluer leur performance mnésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieurs réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant l'année du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra plus de 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères.

Choix des espèces

Afin de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jour le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines.

924 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des vecteurs viraux codant des molécules immunothérapeutiques puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour analyse de leurs organes, afin de comparer des candidats contre l'immunosuppression qui suit un sepsis. Le porteur indique n'attendre aucune toxicité des produits testés. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative capable d'apporter le même niveau d'information.

Objectifs

Nous nous interessons au développement de molécules agissant sur le système immunitaire exprimées par des vecteurs viraux notamment pour traiter l’immunosuppression post-sepsis. De nombreuses molécules existent sous forme de protéines recombinantes dont certaines d’entre elles sont déjà en développement clinique dans le traitement de l’immunosuppression post-sepsis. L’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur viral pourrait permettre une expression prolongée, une distribution différente dans l’organisme, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme soluble et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat basé sur un vecteur viral codant pour une molecule agissant sur l’immunité adaptative, administré par voie intraveineuse. Dans le but d’optimiser ce 1er candidat, nous voulons évaluer dans une étude préclinique exploratoire, la possibilité de co-exprimer dans ce vecteur, une molécule agissant sur l’immunité innée avec la molécule agissant sur l’immunité adaptative déjà validée, chez la souris naïve puis dans un modèle murin de souris spécifique de l’immunosuppression induite par le sepsis. Agir à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative pourrait permettre une meilleure restauration du système immunitaire et ainsi diminuer le temps d’hospitalisation, le taux d’infection secondaire et in fine le taux de mortalité post-première infection et/ou seconde infection. Plusieurs candidats ont été développés : un pour chacune des molécules seules et un pour les deux ensembles. L’objectif final est de démonter l’intérêt de co-exprimer deux molécules agissant sur les deux pans du système immunitaire pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis, dans un même vecteur. Cependant, le modèle murin de sepsis utilisé étant classé sévère, il est primordial de vérifier l’efficacité des produits dans des souris naïves au préalable. En effet, si le(s) produit(s) n’avai(en)t pas l’effet escompté sur le système immunitaire, ou que l’ajout de la seconde cytokine s’avérait délétère pour l’activité déjà connue du produit, il ne serait alors pas testé dans le modèle sepsis.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression induite notamment par le sepsis en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est de permettre l’avancement des connaissances scientifiques sur les différents produits d’immunothérapie injectés par voie intraveineuse chez la souris naïve. Les objectifs à long terme sont de tester ces produits d’immunothérapie dans un ou plusieurs modèles de souris immunodéprimées à la suite d’une infection (sepsis). Si un/plusieurs de ces produits permettent de restaurer l’immunosuppression induite chez la souris, ils pourraient faire l’objet d’un développement clinique afin d’espérer obtenir une autorisation de mise sur le marché afin de soigner l’immunosuppression chez l’homme dans l’indication du sepsis.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injection d’un tampon par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 14% des animaux -Injection d’un produit d’immunothérapie, parmi les 4 produits à visée thérapeutique à tester, par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 86% des animaux -Prélèvement de sang sous anesthésie locale (30secondes/souris) pour 100% des animaux

Impact sur les animaux

Aucune toxicité des produits testés n’est attendue. Les animaux subiront en plus de l’injection des produits d’immunothérapie des prélèvements sanguins après anesthésie locale.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort puis le sang et/ou organes sont prélevés nous permettant d’évaluer l’efficacité de notre produit d’immunothérapie. Aucune souris restante à la fin des deux procédures.

Remplacement

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la durée et le taux d’expression de plusieurs produits d’immunothérapie chez l’animal et de mesurer les activités immunologiques sur différents types cellulaire provenant de différents organes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs.

Réduction

Tout au long du projet, nous essayerons de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le sang de 3 souris/groupe/temps sera prélevé pour la réalisation de la pharmacocinétique (nombre d’animaux suffisant, basé sur les résultats des procédures précédemment réalisées dans le cadre du projet global), pour limiter le nombre d’animaux. Six souris/groupe sont prévues pour couvrir l’éventuelle variabilité des tests immunologiques (variabilité plus importante pour ces tests immunologiques déjà observée au préalable) et permettre l’analyse statistique. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, le nombre d’animaux proposé ici pour chacun des types de tests est le minimum requis pour obtenir un résultat fiable. Dans ce projet, pour chaque procédure nous prélèverons post mortern la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans nos procédure : Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie générale gazeuse après application d’un anesthésique local. Les prélèvements sanguins se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long des procédures nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue après injection de nos candidats (2h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de nos produits sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du paracétamol sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au sérum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si une infection bactérienne et/ou une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse immunitaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité d’un des candidats dans ce modèle murin, il nous semble pertinent de valider les autres candidats dans le même modèle, puisqu’une comparaison entre ces différents produits sera réalisée ici. Ces produits d’immunothérapies sont développés pour être utilisés chez l’homme et ils devraient cibler des patients adultes. Pour réaliser les tests préliminaires chez la souris naïves, nous utiliserons des souris avec un système immunitaire fonctionnel. Nous utiliserons donc des animaux d’au moins sept semaines pour ces études précliniques.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris juvéniles et adultes reçoivent par gavage une souche hyper-virulente de streptocoque du groupe B puis un marqueur fluorescent, avant une prise de sang et la mise à mort, pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par la bactérie. Le porteur indique que les souris peuvent développer une méningite dès douze heures après le gavage, et évoque un risque de fausse route ou de perforation de l'œsophage lors du gavage. Il affirme que la complexité de la barrière intestinale n'est "pas modélisable in vitro" et que seule l'expérience sur l'animal permet cette étude.

Objectifs

Le Streptocoque du groupe B (SGB) est une bactérie appartenant à la flore vaginale et digestive, présente chez 15 à 30% des individus. Cette bactérie est inoffensive pour l’adulte en bonne santé, mais elle est la première cause d’infection bactérienne néonatale dans les pays industrialisés. La première étape dans l’infection par SGB est le franchissement des muqueuses et notamment de la muqueuse digestive pour atteindre la circulation sanguine. Les infections néonatales à SGB sont rares (300 cas par an en France), mais sont associées à un taux de mortalité important et à des séquelles significatives, notamment sur le plan neurologique. Les souches de SGB retrouvées dans 70% des méningites appartiennent à un clone hyper-virulent CC17. Ce projet vise à étudier les mécanismes de virulence de SGB, et notamment de comprendre comment cette bactérie peut franchir la barrière intestinale. La complexité de la barrière intestinale n’est pas modélisable in vitro à l’heure actuelle. De même les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions hôte/pathogène à différents stades de développement (nouveau-né/jeune, adulte). Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra d’étudier les mécanismes permettant à SGB de franchir la barrière intestinale. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par le SGB. Nous effectuerons une étude préliminaire (avec 120 souris) afin de déterminer si le sexe de la souris influe sur la réponse à l’infection bactérienne et nous testerons 2 doses différentes de bactéries ainsi que 2 souches de souris (Balb/c et C57Bl/6). Ensuite, des souris balb/c ou C57BL/6 (en fonction des résultats de l’expérience préliminaire) jeunes (3-4 semaines) ou adultes (8 semaines) seront infectées par voie orale avec une souche de SGB appartenant au clone CC17. Le franchissement de la barrière intestinale par la bactérie sera étudié par dénombrement des bactéries dans différents tissus (intestin, ganglion, sang, rate) et l’étude de l’intégrité de la barrière (perméabilité, inflammation) sera réalisée sur différents segments gastrointestinaux. Le nombre de souris utilisées sera de 120. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes responsables du franchissement de la barrière intestinale par le SGB et utilisera au total 240 souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des mécanismes responsables du franchissement de la barrière intestinale par le SGB. C’est une 1ère étude et selon les résultats attendus, nous pourrons adapter nos prochaines expériences (âge, durée d’infection par ex).

Procédures

Les animaux seront gavées 2 fois. Une 1ère fois pour le gavage de la bactérie (ou du PBS ; 100 µl) et une 2nde fois avec le marqueur fluorescent (120 µl de solution) pour la mesure de la perméabilité intestinale in vivo. Chaque gavage durera quelques secondes. Nous réaliserons un prélèvement sanguin (max 500 µl) sous anesthésie à l’isoflurane et juste avant la mise à mort et ce geste durera max 30 secondes.

Impact sur les animaux

Ces expériences seront très courtes, 24h maximum. Dans la littérature, il est décrit la possibilité de développer une méningite 12h après l’infection par gavage chez des souris Balb/c tandis que les souris C57Bl/6 sont moins sensibles à cette souche bactérienne. Nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire pour comparer les effets sur ces 2 souches en utilisant 2 doses. Nous espérons que nos souris ne développeront pas de méningite trop rapidement. Néanmoins, une attention particulière sera portée sur nos animaux tout au long de l’expérimentation. Les gavages (bactéries ou marqueur fluorescent) seront réalisés par une personne expérimentée en vue de réduire et/ou identifier un risque de fausse route ou de perforation de l’œsophage.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter différents organes pour des études ex vivo : étude de perméabilité, analyses des protéines et ARN, immunohistochimie, études bactériennes, …

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent restituer ni la complexité des barrières physiologiques, ni l’intégralité du processus infectieux allant de la colonisation digestive jusqu’à la méningite, ni les interactions bactéries-hôte mises en jeu lors de l’infection. Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra de déterminer l’impact de l’infection bactérienne sur la perméabilité intestinale et le Système Nerveux Entérique. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale.

Réduction

Compte-tenu de la littérature existante, le nombre d’animaux est réduit au minimum (5/groupe pour les tests préliminaires et 10/groupe/temps et par âge pour l’étude finale).

Raffinement

Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Un enrichissement sera apporté par l’ajout de frisottis. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude (24h max). Des points limites (décrits en annexes) seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront euthanasiés par une personne compétente ou une analgésie sera envisagée si l’on considère que cela sera nécessaire et suffisant. Si la douleur peut être traitée localement, nous administrerons un analgésique local (50 µl, toutes les 6h en s.c sur le site de la blessure ou du point douloureux), sinon, nous traiterons avec un anti-inflammatoire non stéroïdien (50 µl en s.c. d’une solution à 2 mg/ml une fois/jour pendant 48 à 72h maximum).

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale. Nous utiliserons des souris juvéniles de 3-4 semaines et des souris adultes de 8 semaines. Pour ce projet, nous avons besoin de comparer les effets entre des souris jeunes et adultes.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, qui produisent des IgA humaines dans le sang, subissent un prélèvement d'oreille pour le génotypage, des prises de sang, des gavages et des injections, et certaines une infection des muqueuses par Salmonella, qui peut provoquer diarrhées et amaigrissement. Les expériences visent à reproduire chez la souris une maladie rénale humaine, la néphropathie à IgA, et à mesurer le rôle du facteur de croissance APRIL dans sa sévérité, mais le résumé ne donne que la durée de chaque geste, sans leur nombre ni leur fréquence. Sur le remplacement, le porteur s'en tient à une phrase : "aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle".

Objectifs

Le but du projet est le développement d'un modèle de maladie rénale : la néphropathie à immunoglobuline A, chez la souris. Cette maladie rénale humaine est responsable d'une évolution vers l'insuffisance rénale terminale (dialyse ou transplantation rénale) chez 30% des patients qui en sont atteints, alors que la fréquence de la maladie est autour de 0,5% de la population. Il s'agit d'une maladie à plusieurs facteurs, génétique en partie, et faisant également intervenir le système immunitaire des muqueuses (intestin, bronches) via la production d’un type d’anticorps, nommées IgA, au niveau de ces muqueuses. Une des anomalies au cours de cette maladie est le fait que ces anticorps soient déversés anormalement dans le sang. Parmi les facteurs impliqués dans cette anomalie, le rôle d’un facteur de croissance de globules blancs produisant cet anticorps semble être très important. En effet, les patients atteints de cette maladie présentent des concentrations de ce facteur de croissance plus élevées que les volontaires sains et d’autre part une particularité génétique portant sur la production de ce facteur est plus souvent présente chez les patients. Nous disposons d'un modèle de souris produisant des IgA humain dans le sang mais aucune production de cet anticorps dans les muqueuses. Ces souris présentent des dépôts d'IgA humain dans leurs reins avec un début d'inflammation. Il s'agit au cours de ce projet, d’étudier les souris mutantes afin d'évaluer l'impact du facteur de croissance sur l’apparition d’une maladie plus sévère.

Bénéfices attendus

Si le rôle d'APRIL sur la sévérité de la néphropathie à IgA se confirme dans ce modèle, cette cytokine ainsi que ses récepteurs deviendront une cible thérapeutique évidente dans cette maladie. Des molécules visant cette voie sont déjà disponibles (ex: belimumab) pour le traitement d'autres pathologies inflammatoires (lupus). Elle permettra de mieux comprendre le rôle de l'immunité muqueuse au cours de la maladie.

Procédures

Prélèvement d'oreille pour génotypage : 30sec par animal Prélèvement sanguin: 1 mn par animal Gavage par tubage gastrique: 2mn par animal Injection: 30sec par animal

Impact sur les animaux

Possibles douleurs liées aux prélèvements sanguins et prélèvements d'oreille, classe légère, pratique courante en laboratoire Possible douleur et inconfort lié au gavage Possible troubles digestifs dont diarrhées et amaigrissements dans la procédure de challenge muqueux par Salmonella, points limites définis

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements de sang et d'organes afin d'analyser les données et obtenir les résultats.

Remplacement

Il s'agit d'un modèle physiopathologique, nécessitant un environnement in vivo, aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle

Réduction

Le nombre d'individus utilisés par génotype est le minimum d’individus indispensable pour effectuer la procédure d’expérimentation et obtenir des résultats pertinents interprétables. Le nombre d'animaux par génotype est le nombre minimal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Afin de minimiser le nombre d’individus nécessaires, un test statistique a permis à partir d’une hypothèse réaliste de prévoir le nombre de souris le plus pertinent.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée qui possède tous les éléments du raffinement. Toutes les mesures de réduction de l’inconfort animal sont prévues, à savoir la mise en place d’une anesthésie générale avant tout geste invasif, une analgésie lors des interventions potentiellement douloureuses et la mise en œuvre de points limite adaptés, conduisant à la mise à mort en cas de souffrance. Des observations quotidiennes seront mises en place tout au long du projet, et adaptées pour chaque individu.

Choix des espèces

L'expérimentation sur animaux de petite taille apporte des éléments de connaissance physiopathologique impossible à atteindre en expérimentation in vitro seule ou en clinique humaine car: - elle permet d'être à l'initiation de la maladie ce qui n'est pas possible chez l'homme (maladie peu symptomatique, souvent diagnostiquée après de longues années d'évolution). La mécanistique pathogénique ne peut donc être appréhendée qu'en expérimentation animale dans le cas de cette maladie. - le développement d'un modèle animal permettra d'identifier des cibles thérapeutiques, de tester des interventions thérapeutiques chez l'animal en vue de dégager des traitements candidats transférables en clinique humaine. - Les souris utilisées dans ce projet auront 3 mois: cet âge choisi est optimal pour l’étude de la réponse de l'anticorps (IgA) car il correspond à la phase de développement du répertoire immunologique muqueux.

4 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales et des injections abdominales quotidiennes, une partie étant irradiée avant une injection de moelle osseuse, pour tester deux molécules censées stimuler la migration des cellules dendritiques et l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les tumeurs restent de taille modérée et que l'irradiation peut provoquer diarrhée et perte de poids. Sur la réduction, il écrit qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée" pour justifier ce nombre de près de 4 900 souris, tout en affirmant que le modèle murin reste "indispensable".

Objectifs

Les cellules dendritiques véhiculent des informations provenant de tissus périphériques, qui sont souvent exposés à des menaces microbiennes, ou au développement de tumeurs, vers les ganglions lymphatiques dans lesquels les lymphocytes T nichent. Au stade immature, les cellules dendritiques échantillonnent les tissus, arborant une migration lente associé à l'internalisation de leur environnement. Lorsqu'elles rencontrent un signal de danger, elles maturent, ce qui induit la baisse de l’activité d’échantillonnage et induit la migration rapide vers les ganglions lymphatiques pour l'activation des lymphocytes T. Ce processus migratoire est strictement nécessaire pour la mise en place de réponses immunitaires adaptatives, notamment contre les tumeurs. Nous avons identifié une protéine qui est activée lors de la maturation des cellules dendritiques et qui augmente la migration des cellules dendritiques in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (immunothérapie par anti-PD1). Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, mais aussi d’une version modifiée de ce composant, A5, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seuls ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si les deux molécules A1 et A5 peuvent être utilisées pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminant dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans une première procédure visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux anesthésié (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé et de son dérivé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, la première procédure servira à déterminer la dose de A1 e A5 montrant le meilleur effet. Les procédures suivantes seront alors réalisées avec ces doses optimales. De même seuls les modèles ayant donné des résultats prometteurs seront utilisés dans la suite du projet Aucune approche statistique n’a été réalisée

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score permettra de d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de part la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1 et A5). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.