Souris

600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur implante des cellules de tumeur cérébrale sous anesthésie, puis on les soumet à une radiothérapie par microfaisceaux de rayons X et à des examens d'IRM répétés, pour mettre au point un protocole d'irradiation transférable en clinique. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques en phase terminale, une perte d'appétit et de poids, et une dermatite radio-induite, les animaux étant tués quand les points limites de poids et de comportement sont atteints. Il affirme que "la seule alternative aux études animales est l'étude in vitro", jugée insuffisante pour rendre compte du tissu tumoral vivant.

Objectifs

Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies intéressantes (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique est étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches expérimentale comme l'irradiation de cellules en culture ou des calculs dosimétriques. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie par rayonnements X de haute énergie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux microfaisceaux, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique. En effet, la radiothérapie par microfaisceaux est une méthode innovante et prometteuse, permettant de détruire efficacement le tissu tumoral tout en préservant le tissu sain environnant. Elle répresente donc une bonne alternative de la radiothérapie conventionnelle et ses effets secondaires. Ce projet est un facteur clé pour promouvoir notre méthode en clinique humaine et pour pouvoir proposer aux patients de tumeur cérébrale un meilleur rapport entre l'efficacité thérapeutique et effets secondaires, une meilleure qualité de vie et une survie prolongée.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; radiothérapie par microfaisceaux ou par irradiation conventionnelle sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure

Impact sur les animaux

Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit). Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une perte d'appétit. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’après les connaissances actuelles (littérature) et notre expertise, un délai de 2 semaines entre la radiothérapie et le prélèvement cérébral pour analyse histologique permet une bonne évaluation des réponses tissulaires différentielles entre l’irradiation par microfaisceaux ou champ plein auxquelles nous nous attendons. Cette analyse histologique est complémentée par la courbe de suivi long terme qui est indispensable pour évaluer l’efficacité de notre traitement et pour pouvoir proposer un protocole d’irradiation optimisé et transférable à un futur essai clinique.

Remplacement

La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont mis à mort à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique. Par ailleurs, des études ex vivo ont déjà été menées dans le passé mais elles ne correspondent pas suffisamment aux buts recherchés lors d'irradiations d'un organisme vivant comme mentionné ci-dessus. Ces études incluent des simulations informatiques pour simuler les interactions entre photons et matière et des irradiations de cellules en culture.

Réduction

Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.

Raffinement

Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par un transport d'animaux groupés en cage filtrée et nous allons mettre à disposition de l'hydrogel. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes et basés à la fois sur le comportement et le poids, sont atteints.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. L'utilisation de rongeurs d'un même patrimoine génétique permet une grande réproductibilité de résultats. Les souris sont favorisées car elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.

1 485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cent soixante-cinq femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale pour poser une mini-pompe sur l'utérus, des injections intrapéritonéales et une ponction intracardiaque terminale, et leurs souriceaux sont comptés dans le total, pour étudier le rôle de protéines placentaires dans l'infection déclenchant la prématurité. Le porteur indique que les injections et la chirurgie peuvent provoquer un léchage, une automutilation de la zone douloureuse et une position recourbée, ainsi qu'une perte de poids pendant l'allaitement. Il affirme que les mécanismes de la pathologie ne peuvent être étudiés que dans un "organisme entier", en gestation.

Objectifs

La chorioamniotite (CA) est une infection des membranes placentaires pendant la grossesse, souvent consécutive à une infection bactérienne de la mère, notamment par le streptocoque du groupe B (SGB) et Escherichia coli. La CA est une cause majeure de prématurité. Elle concerne approximativement 5-11% des naissances dans le monde, reste sans traitement efficace et coute très cher au système de santé publique. L'inflammation importante du placenta causé par la CA libère des facteurs de l’inflammation dans la circulation maternelle et fœtale, responsables de dérégulations dans le développement et fonctionnement de plusieurs organes, en particulier le cerveau chez le fœtus et/ou chez l’enfant après la naissance. Dans le projet proposé, nous étudierons le rôle potentiel des prokinéticines (PROKS), dans la CA. Les membres de cette famille jouent un rôle important dans le développement placentaire et dans le contrôle des pathologies de la grossesse, y compris celles associées aux processus inflammatoires. Le mécanisme d'action des PROKS fait intervenir des récepteurs qui contrôlent plusieurs fonctions biologiques en particulier celles de la reproduction. Par ailleurs, hors contexte de grossesse, les PROKS régulent les processus inflammatoires et induisent des réponses immunitaires innées. L’ensemble de ces observations suggère que les PROKS pourraient jouer un rôle régulateur dans les mécanismes qui conduisent au déclenchement de l’accouchement. Jusqu’à présent, le rôle de la famille des PROKS dans un contexte infectieux de la grossesse a été peu étudié, alors que l'on sait que ce contexte provoque des effets indésirables importants sur l'issue de la grossesse et au-delà sur la fonction cérébrale des enfants issus de ces grossesses. Ce projet a pour objectif de caractériser le rôle des PROKS dans la prématurité induite et de vérifier leur valeur informationnelle pour le diagnostic et/ou le pronostic de la prématurité.

Bénéfices attendus

Les troubles fonctionnels dus à une atteinte inflammatoire du placenta et ceux qui en découlent au niveau du cerveau du fœtus restent encore mal connus. Il n’existe à ce jour pas de marqueur biologique de la prématurité ni de traitement spécifique protecteur pour le neuro-développement fœtal dans ces situations d’infection / inflammation anténatale. Nous proposons ce projet pour tenter de démontrer que des PROKs pourraient constituer un marqueur biologique de la prématurité et pour caractériser leur rôle dans l’inflammation liée à une CA. A terme le projet pourrait permettre d’identifier une nouvelle méthode pour diagnostiquer et/ou traiter la chorioamniotite au cours de la grossesse infectieuse.

Procédures

Une seule chirurgie avec incision au niveau de l’abdomen est prévue par souris. Cette chirurgie est effectuée au niveau de l’abdomen pour poser la mini-pompe au niveau de l’utérus. La chirurgie durera dix minutes et s’effectuera sur animal anesthésié/analgésié. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur chaque animal, au minimum une fois et au maximum 3 fois pendant toute l’expérimentation. Celle-ci durera 5 min et s’effectuera sur animal anesthésié. Une ponction intracardiaque entrainant la mort de l’animal sera réalisée dans toutes les procédures, pour permettre le prélèvement de tissus et organes. Cette intervention sera effectuée sur l’ensemble des souris adultes. Celle-ci durera 5 min et s’effectuera sur animal anesthésié/analgésié.

Impact sur les animaux

Une injection intrapéritonéale est susceptible de provoquer un stress, un léchage de la région d’injection et/ou l’adoption d’une position recourbée de l'animal. Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront également perdre du poids. Pour les animaux recevant deux injections intrapéritonéales, une automutilation au niveau de la région douloureuse peut également être observée. La chirurgie suivie d’une injection peut provoquer léchage et automutilation au niveau de la région opérée, ainsi qu'une mobilité réduite et une position recourbée de l'animal. Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront également perdre du poids. Par ailleurs, une surveillance plus rapprochée sera mise en place dans les groupes injectés avec du LPS. Cela nous permettra de tenir la bonne conduite en cas de mise bas prématurée.

Devenir

Afin de valider les PROK comme marqueurs biologiques de la prématurité et caractériser leur rôle dans l’inflammation liée à une CA, le sang ainsi qu’un ou plusieurs organes seront prélevés sur les animaux pour être analysés, ce qui implique que les animaux devront être euthanasiés avant de réaliser ces prélèvements.

Remplacement

Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle de certaines PROK dans le développement de la CA. Les PROK sont des molécules majoritairement libérées par le placenta dans la circulation sanguine, en particulier en cas de stress placentaire. Leur libération et leur circulation ne peuvent pas être modélisées dans des systèmes in vitro qui ne représenteraient que partiellement un organisme. Les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie ne peuvent apparaitre et être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo de gestation.

Réduction

Il est prévu d’utiliser 165 souris femelles qui donneront naissance à environ 8 souriceaux chacune, soit 1485 souris au total sur une durée de 5 ans. Le nombre de souris femelles a été calculé et réduit au minimum de façon à ce que les résultats puissent être exploités et interprétés de façon fiable d'un point de vue statistique. Avant de passer sur le modèle animal, nous avons réalisé des études in vitro qui confortent nos hypothèses et nous incitent à considérer un modèle in vivo pour ensuite passer à la clinique.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement, 7 jours sur 7, pour s’assurer de leur bon état général. Différents paramètres permettant le suivi de l'aspect général comme le comportement, la locomotion, ainsi que la perte de poids seront estimés de façon régulière. Les interventions seront effectuées sous anesthésie. Des critères d'arrêt sont prévus dans le projet en cas de survenue d’effets inattendus.

Choix des espèces

Le modèle choisi pour cette étude est le modèle animal souris gestantes OF1, âgées de 8 à 14 semaines, qui permettra de suivre toutes les étapes de la gestation. Le modèle souris est choisi pour sa gestation courte et proche de la gestation humaine. Comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale, c’est-à-dire que les échanges entre la mère et le fœtus se font à travers la barrière placentaire à travers la barrière trophoblastique et endothéliale fœtale, sans que le sang de la Maman et de son fœtus ne soient mélangés. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon. Le modèle souris OF1 est choisi en particulier car nous l’avons utilisé dans le passé comme modèle pour l’étude du rôle la protéine PROK1 dans la placentation normale. Nous souhaitons nous appuyer sur ces résultats pour poursuivre avec la présente étude.

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par voie intraveineuse par la levure Candida albicans à des doses calibrées pour tuer une partie des animaux, puis reçoivent des antifongiques et des produits d'immunothérapie, avec prise de température rectale quotidienne pendant jusqu'à 21 jours. Le porteur indique qu'une proportion des souris ne survivra pas, soit de l'infection soit par mise à mort en raison d'un état dégradé, avec perte de poids et troubles de la température. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour modéliser une infection fongique systémique sur un "organisme vivant, entier".

Objectifs

Chaque année, environ 250000 personnes dans le monde sont atteintes de candidémie (forme la plus courantes des candidoses invasives) et 50000 en meurent en raison de sa détection tardive, du nombre limité d’antifongiques utilisables et de l’accroissement de l’apparition de souches résistantes. Candida albicans est une levure commensale de la peau et des muqueuses. Elle utilise donc notre organisme à son avantage sans que nous y trouvions un quelconque bénéfice ou inconvénient. Ce commensalisme repose sur un équilibre entre levure/microbiote et défenses immunitaires de l’hôte. En cas de rupture de l’équilibre, la levure colonise de manière excessive l’organisme hôte. Les causes sont : -utilisation à long terme/de façon répétée d’antibiotiques à large spectre -rupture de la barrière cutanée/gastro-intestinale (chimiothérapie/chirurgie gastro-intestinale/perforation/utilisation de cathéter veineux). Ces ruptures provoquent une colonisation de l’intestin permettant le passage des levures dans le sang (candidémie) et la dissémination dans les organes (candidose disséminée). Candida fait partie des 10 causes les plus fréquentes de candidémie, et leur taux de mortalité est de 42% à 30 jours, résultant d’un diagnostic souvent tardif du pathogène impliqué. Le traitement est basé sur 3 classes d’antifongiques. La résistance naturelle des souches de Candida est à prendre en compte lors du traitement des candidoses invasives ainsi que le problème du développement des résistances acquises qui est de plus en plus présent depuis les 20 dernières années. Il est donc urgent de trouver des thérapies alternatives à ces antifongiques et/ou d’en limiter la consommation afin de réduire l’émergence de nouvelle résistance. Ce projet vise à tester différents produits d’immunothérapie seul ou en combinaison dans deux modèles de candidose invasive avec ou sans antifongiques qui ont été préalablement mis au point dans un précédent projet. Cela permettra soit de diminuer la dose/durée du traitement antifongique, soit d’être une alternative à ce traitement afin de limiter le développement de résistance aux antifongiques. Dans notre programme différents produits seront donc testés pour vérifier leur capacité à éliminer/contrôler l’infection, et comprendre in fine les mécanismes immunitaires mis en jeu suite à leur administration, en présence et en absence d’antifongiques.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements contre la candidose invasive basés sur la stimulation du système immunitaire des patients, afin de venir en support ou en remplacement des antifongiques, dont l’utilisation excessive aboutit à l’émergence de souche résistante(s)/multi-résistante(s). Les bénéfices attendus à court terme sont : -de mettre en place les modèles animaux pertinents pour tester un premier produit d’immunothérapie, -d’améliorer la survie des animaux atteints de candidose invasive avec ou sans antifongiques, -l’avancement des connaissances scientifiques sur le produit d’immunothérapie injecté par voir intraveineuse dans un modèle de candidose invasive sensible mais également résistante aux antifongiques, -d’utiliser un tel produit d’immunothérapie, comme traitement dans les candidoses invasives sensibles ou comme alternative aux antifongiques. Les bénéfices attendus à long terme sont : -de tester différents produits d’immunothérapie dans l’indication de la candidose invasive sensible, - de présenter des données robustes aux autorités réglementaires afin de soutenir le développement clinique d’un ou plusieurs produits d’immunothérapie pour espérer obtenir ensuite une autorisation de mise sur le marché de développer une nouvelle forme de thérapie pour soigner les patients atteints de candidose invasive seul ou en association avec des antifongiques -de se substituer aux antifongiques ou d’en diminuer leur consommation dans les soins intensifs.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Infection à Candida albicans par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 100% des animaux -Administration des antifongiques par injection intrapéritonéale pour 50% des animaux (2 fois maximum/souris et 2-3 min/souris) -Injection d’un tampon par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 10,5% des animaux -Injection d’un produit d’immunothérapie, parmi les 6 produits à visée thérapeutique à tester, par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 79% des animaux -Suivi quotidien des animaux : prise de température interne par voie rectale (30 secondes/souris) pendant 21 jours maximum pour 100% des animaux -Prélèvement de sang sous anesthésie locale (30secondes/souris) pour 100% des animaux

Impact sur les animaux

Les souris vont être inoculées par voie intraveineuse par Candida albicans à différentes doses afin de mimer la pathologie humaine, après anesthésie locale et générale gazeuse. La candidose invasive étant une infection mortelle chez l’homme dans 42% des cas, Il est donc attendu qu’une proportion de nos animaux ne survive pas, soit directement de leur infection, soit par mise à mort en raison de leur état général dégradé. Il est probable que la proportion d’animaux ne survivant pas, soit plus importante dans la première procédure que dans les deux suivantes, le but de ces dernières étant de trouver un équilibre entre mortalité et survie afin de pouvoir répondre aux questions posées. On peut s’attendre à ce que l’état général des animaux se dégrade, avec par exemple un perte/baisse de leur mobilité, une perte de poids et à une élévation ou une diminution de la température chez ces animaux, suite au développement de la candidose invasive, pendant 2-3 jours. Une partie des animaux va recevoir un traitement antifongique par injection intrapéritonéale, engendrant une légère douleur au point d’injection au moment de celle-ci. Puis certains animaux recevront une injection d’un produit d’immunothérapie parmi les 6 produits à tester, par voie intraveineuse après anesthésie locale et générale gazeuse. L’injection de ces produits n’a causé aucun dommage chez la souris naïve, mais dans le contexte de candidose invasive traitée ou non aux antifongiques, une augmentation de la température corporelle interne est potentiellement envisageable dans les 24h suivant l’injection. Un prélèvement de sang sera réalisé après anesthésie locale au moment de leur mise à mort. La douleur relative au prélèvement devrait être réduite par l’anesthésie et ne pas durer plus de 5-10 minutes, entre le moment du prélèvement et celui de la mise à mort de l’animal. Il est envisageable que l’on puisse observer une apparition de lésion ou une infection bactérienne suite à l’injection par voie intraveineuse ou au prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort car pour chaque procédure un certain nombre d’organes seront prélevés, ce qui nécessite la mort de l’animal, afin de caractériser ceux touchés par l’infection et ceux qui ont été impactés par le traitement d’immunothérapie. Cela permettra de déterminer les organes dans lesquels la réponse immunitaire sera étudiée plus précisément dans la suite du programme.

Remplacement

Les objectifs de ce projet sont de tester plusieurs produits d’immunothérapie dans deux modèles de candidose invasive avec ou sans antifongiques afin d’évaluer leur capacité à améliorer l’état général de ces animaux, dans le but à plus long terme d’en étudier les conséquences immunologiques sur un organisme vivant, entier. Afin de répondre à ces objectifs, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser une infection fongique systémique, ni les réponses immunitaires mises en jeu lors de ces infections avec ou sans traitement antifongiques et/ou d’immunothérapie.

Réduction

Tout au long du projet, nous essaierons de réduire le nombre d’animaux sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le nombre de souris par groupe a été déterminé par des modélisations statistiques à partir d’hypothèses de l’efficacité potentielle des différents produits testés à améliorer la survie des animaux. Le nombre de souris pour répondre à chacune des questions posées est trop important pour être manipulé en une seule fois. Un premier lot de 10/6 souris pour chaque groupe sera manipulé en même temps. Si ce nombre ne suffit pas pour répondre à la question posée, une autre série de 10/6 souris par groupe sera réalisée jusqu’à atteindre les 30 souris théoriquement suffisantes pour répondre cette question avec une différence statistique entre les groupes. Si toutefois, un problème technique devait intervenir sur un ou plusieurs groupes de ces 3/5 séries et qui empêcherait d’obtenir une différence significative entre certains groupes (ce qui rendrait la conclusion incertaine), ces groupes seraient répétés en procédant de la même manière que décrite précédemment. De cette façon, dès que le nombre d’animaux traités est suffisant pour y répondre avec une différence statistique entre les groupes, l’expérience s’arrête. Le nombre de souris restant, prévu pour répondre à la question mais n’étant pas encore commandé ne sera donc pas utilisé. De plus, si nous n’arrivons pas à trouver les conditions d’injections des produits d’immunothérapie pour qu’ils augmentent la survie des animaux de 20% minimum, le projet sera arrêté. Les résultats obtenus seront également utiles pour la suite du programme. En effet, un certain nombre d’organes seront prélevés post mortem afin de caractériser ceux touchés par l’infection et ceux qui ont été impactés par le traitement d’immunothérapie et donc détermineront les organes dans lesquels la réponse immunitaire sera étudiée dans la suite du programme. Enfin, s’il nous ait impossible d’obtenir les résultats souhaités dans l’un des deux modèles de candidose invasive, il sera alors abandonné dans le reste du projet.

Raffinement

Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie générale gazeuse après application d’un anesthésique local. Les prélèvements sanguins se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. La mort des animaux intervient minimum 3 jours après l’infection par Candida albicans. Les animaux seront donc suivis une fois par jour pendant les 2 premiers jours post-infection. Pendant la durée présumée durant laquelle la mortalité est attendue, entre J3-8, les animaux seront suivis matin et soir. Enfin, une fois passé cette période critique et en fonction de l’état général des animaux observé, la fréquence de suivi sera adaptée jusqu’à la fin de la procédure. En période critique, J3-8, le suivi du matin, consistera en une surveillance de l’état général des animaux (poils, posture, mobilité…), leur poids, leur température prise par voie rectale, ainsi que le site d’injection de Candida albicans et des produits d’immunothérapie. Le suivi du soir consistera en une évaluation visuelle de l’état des animaux. En période non critique (J0-2 et J9-21), le suivi du matin, consistera en une surveillance de l’état général des animaux (poils, posture, mobilité…), ainsi que le site d’injection de Candida albicans et des produits d’immunothérapie. Le suivi du soir consistera en une évaluation visuelle de l’état des animaux. Tout animal dont le comportement est anormal, sera sorti de la cage et sera traité comme le matin en période critique, afin de déterminer si son état requiert ou non une mise à mort anticipée. En cas d’hyperthermie ou de tout doute sur le bien-être animal, le vétérinaire de la structure sera consulté pour entreprendre le traitement adapté. En cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au sérum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si une infection bactérienne et/ou une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort. Et en cas d’hypothermie les animaux seront mis à mort. De l’aliment humide est placé au fond des cages pour faciliter la prise alimentaire.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle animal établi et reconnu pour réaliser de premières études de preuve de concept mettant en jeu un système immunitaire complet. En effet, le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, après avoir mis au point les 2 modèles d’étude dans cette espèce, il nous semble pertinent de poursuivre les investigations dans les mêmes modèles. Les produits d’immunothérapies qui sont développés dans ce programme ont pour visée d’être utilisés chez l’homme. Ils cibleront des patients adultes. Nous cherchons à faire une preuve de concept de l’efficacité des produits d’immunothérapie dans des animaux ayant un système immunitaire fonctionnel. Pour cela nous utiliserons des souris d’au moins sept semaines pour ces études précliniques.

227 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une instillation intra-rectale de TNBS pour déclencher une inflammation de type colite, décrite comme "particulièrement douloureuse", puis subissent mises à jeun, prises de sang répétées et ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que cette étude est une "prestation contractuelle" pour un client, destinée à constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un composé contre la maladie de Crohn. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" n'utilisant pas l'animal de laboratoire.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre d’une prestation contractuelle pour le compte d’un client qui développe notamment des médicaments ayant un intérêt thérapeutique dans le domaine de l’inflammation chronique de l’intestin (maladie de Crohn). Le principal objectif de l’étude est d’évaluer les effets d’un traitement chronique par un composé client sur un modèle d’inflammation de type colite chez la souris. Les données obtenues devraient permettre à la société cliente de détailler l’efficacité et les mécanismes d’action de leurs composés. Le modèle d’inflammation de type colite qui sera utilisé est un modèle d’inflammation induite par une instillation annale unique de TNBS (2,4,6-TriNitroBenzeneSulfonic acid).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'inflammation de type colite.

Procédures

Nuisances communes aux deux procédures : - Mise en place du modèle [Mise à jeun 16h (16h, à D1) + Anesthésie par mélange kétamine/xylazine ou gazeuse par isoflurane (de 2min à 1h, à D1) + Instillation intra-rectale (1min, à D1)] Nuisances spécifiques à la Procédure "Mise en place du modèle de colite" : - Hébergement individuel (continu, sur toute l’étude) - Pesée des animaux (1min, 2-3 fois par semaine, sur toute l’étude) Nuisances spécifiques à la Procédure "Etude de l'efficacité de composés" : - Pesée des animaux (1min, 2-3 fois par semaine, jusqu’à D-1 ; 1min, quotidiennement, à partir de D1) - Habituation per os et sous-cutanée (sur tous les animaux, 2min, quotidiennement, de D-7 à D-2) - Traitement per os ou sous-cutané (sur 8 groupes, 1min, 2 fois par jour, de D-1 à D7) - Traitement en intraveineux [Anesthésie gazeuse (sur 1 groupe, 2min, à D-1) + Injection rétro-orbitale (sur 1 groupe, 1min, à D-1)] - Mise à jeun de 12h (12h, à D7) - Prélèvements sanguins par la veine caudale [Mise à jeun (4h, à D-1) + Prélèvement de 100µL (10min, à D-1)] - Challenge perméabilité intestinale [Mise à jeun (6h, à D5) + Administration per os FITC-Dextran, 4Da (1min, à D5) + Prélèvements sanguins de 75µL par la veine caudale (10min, sur 5 temps, pendant 2h, à D5)] - Mise à jeun (16h, à D7) - Prélèvement sanguin par ponction cardiaque [Anesthésie gazeuse (2min, à D7) + Prélèvement d’1mL (1min, à D7) + Dislocation cervicale (10sec, à D7)]

Impact sur les animaux

L'hébergement individuel de la procédure "Mise en place du modèle de colite" est nécessaire de par la nécessité de la mesure individuelle de la prise alimentaire afin de mieux caractériser le modèle. L'anesthésie pour l'instillation intrarectale du TNBS constituera une nuisance sur les animaux. Le TNBS induit une inflammation de type colite qui en elle-même pourrait être responsable de douleur chez l’animal au cours des 7 jours suivant son instillation. Les prélèvements sanguins de la procédure "Etude de l'efficacité de composés" en vigile constituent également un effet indésirable attendu sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure, le colon doit être prélevé pour des expériences ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur un modèle d'inflammation de type colite sur le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'analyse bibliographique sur ce modèle en considérant la sévérité du modèle où 10% de perte est attendue. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et en %), prise alimentaire (individuelle ou collective selon la procédure), prise alimentaire cumulée, cytokines (serum), longueur du colon, poids du colon, ratio longueur/poids du colon et dégénérescence du colon (histologie). Les paramètres majeurs pour la variabilité sont le ratio longueur/poids du colon et la dégénérescence du colon (histologie). La variation du ration longueur/poids du colon est de 11+/-3% et celle de la dégénérescence du colon est de 25+/-10%. Ceci nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation de type colite induite par le TNBS chez la souris, qui est un modèle particulièrement bien caractérisé dans la littérature. En particulier, ce modèle présente une inflammation de type colite aux caractéristiques proches de celles observée chez les patients humains atteint de la maladie de Crohn. Le protocole sera planifié de façon à réduire le nombre d'animaux et à limiter au maximum tout stress induit aux animaux (périodes d’acclimatation et d’habituation des animaux aux procédures d’administration, anesthésie si nécessaire [instillation intra-rectale et injection rétro-orbitale]) en surveillant les animaux de manière accrue et en établissant des points limites appropriés. L'instillation étant particulièrement douloureuse, une injection en sous-cutané de buprénorphine (0,05mg/kg) sera réalisée 30min avant anesthésie afin de couvrir toute douleur liée à l'instillation. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, ils seront anesthésiés avec un mélange kétamine/xylazine (respectivement 100mg/kg ; 15mg/kg ; 10mL/kg ; i.p) avant la réalisation d'une une ponction cardiaque sera réalisée. Par ailleurs, si une souffrance modérée est décelée, une injection en sous-cutané de buprénorphine (0,05mg/kg) sera administrée. Les souris seront ensuite euthanaisées par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle de souris Balb/cJRj est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans l'inflammation de type colite. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (âgées de 10 semaines à l'instillation intra-rectale). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par le composé testé, à savoir une population adulte.