Souris

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies de la moelle épinière à un mois d'intervalle, des injections modulant l'activité neuronale, puis des tests moteurs et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le modèle reproduit une sclérose en plaques pour observer si stimuler les neurones aide à réparer la myéline. Les prélèvements de cerveau et de moelle épinière imposent la mise à mort de tous les animaux. Les retombées annoncées pour les patients, limiter la progression du handicap, restent renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, dégénérative du système nerveux central (cerveau et moelle épinière) et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation (il s’agit d’une perte de la myéline, substance permettant de favoriser les influx nerveux et la protection des neurones) dans lesquelles l’organisation des neurones est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière (microglie) sont activées précocement lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Nous avons mis en place une technique permettant de moduler l’activité neuronale lors de la phase de rémission dans un modèle murin de sclérose en plaques pour étudier l’impact de cette modulation sur les interactions entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones, afin de favoriser la réparation tissulaire et la récupération fonctionnelle. Le présent projet vise à mesurer par des tests comportementaux et des mesures de conduction nerveuse chez la souris si la modulation de l’activité neuronale facilite la récupération fonctionnelle dans nos modèles et si cela dépend de l’interaction neurone-microglie.

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques touche plus de 100 000 personnes en France et se déclenche majoritairement chez le jeune adulte. La réparation de la myéline (remyélinisation) est essentielle dans cette pathologie, mais reste partielle, d’où une perte neuronale à long terme et des déficits irréversibles chez les patients. L’activité neuronale a été montrée comme favorisant la remyélinisation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact biologique obtenu de l’activité neuronale sur les interactions neurones-cellules immunitaires et leur rôle dans un modèle murin de sclérose en plaques. A plus long terme, la mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité neuronale sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurones-cellules immunitaires pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée, afin de réaliser une injection au niveau de la moelle épinière (chirurgies séparées d’un mois, durée 15 minutes chacune). Tous les animaux recevront à l’état vigile deux injections (moins d’une minute) séparées de 3h pour moduler ou non l’activité neuronale. Tous les animaux participeront à des tests comportementaux visant à mesurer leurs compétences motrices (sessions de 2h30 incluant des pauses entre les tests). Des mesures de la vitesse de conduction nerveuse seront effectuées sous anesthésie générale avec traitement analgésique en fin d’étude (maximum 45 minutes), avant euthanasie par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.

Impact sur les animaux

Les chirurgies engendreront un inconfort temporaire lors du réveil après anesthésie (environ 30 min d’inconfort au réveil) et un risque de douleurs post-opératoires. Il existe un risque rare de complications liées à la chirurgie : infections, hémorragie. L’anesthésie générale sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de défaillance cardiorespiratoire. Les injections seront associées à un risque de légère et brève douleurs et d’inconfort de courte durée. Le traitement modulateur d’activité neuronale peut occasionner un trouble locomoteur et une gêne dans les 3 heures maximum suivant l’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger.

Devenir

Des prélèvements tissulaires (cerveau et moelle épinière) sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour répondre à nos objectifs scientifiques. L’euthanasie est réalisée par une méthode réglementaire.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo, qui nous ont permis d’établir le rôle positif de l’activité neuronale dans le dialogue neurone-microglie pour limiter l’aspect pro-inflammatoire de ces cellules après démyélinisation. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la Sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de la sclérose en plaques. Le présent projet nous permettra d’avoir une lecture fine de l’impact de l’activité neuronale sur la réparation et la part de cet effet dûe au dialogue neurone-microglie dans nos modèles démyélinisants in vivo.

Réduction

Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés après l’utilisation des premiers lots d’animaux afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après utilisation initiale de 5 à 6 animaux par condition. Au maximum nous utiliserons 100 animaux pour ce projet. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée avant leur entrée en procédure. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft) et bâton à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Ils seront observés quotidiennement, toute anomalie sera gérée en collaboration entre notre équipe, la structure chargée du bien-être animal et nos vétérinaires afin d’assurer une prise en charge adaptée pour chaque animal. Des points-limites sont définis, ainsi qu’un suivi par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animal. Les animaux soumis aux procédures chirurgicales sont placés sous anesthésie générale (durée maximale de 30 minutes), avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température des animaux durant toute la durée de l’anesthésie. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur leurs yeux. En post-chirurgie, les animaux auront un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour faciliter leur récupération. Nous mettrons également en place une surveillance renforcée post-chirurgie. Avant les tests comportementaux, les animaux auront un temps d’acclimatation. La mesure de la conduction nerveuse sera réalisée sur un animal anesthésié. L’animal ne sera pas réveillé ensuite et euthanasié au cours de son anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. L’âge adulte est requis pour pouvoir faire les actes chirurgicaux et les mesures d’activité neuronale envisagées dans ce projet.

Pour mesurer le devenir de molécules pharmaceutiques dans l'organisme, 7 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent les composés par injection ou gavage, ce dernier pouvant irriter l'œsophage, et subissent des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie. Le volume de sang requis étant trop élevé pour les laisser en vie, ils sont tués juste après le prélèvement, puis leurs organes sont collectés. Le porteur décrit ce modèle comme "indispensable" et comme un prérequis réglementaire pour les dossiers soumis aux autorités.

Objectifs

Dans le cadre de nos programmes internes de maturation et de développement préclinique, nous testons au stade pré-clinique de nouvelles molécules pharmaceutiques, qu’il s’agisse de composés innovants ou de médicaments faisant l’objet d’un repositionnement thérapeutique. Pour chaque molécule intégrée dans notre pipeline de développement, des études de toxicologie, de pharmacocinétique et d’efficacité sont entreprises. La présente demande concerne spécifiquement la réalisation d’études de pharmacocinétique. La caractérisation du profil pharmacocinétique constitue une étape indispensable du développement d’un candidat-médicament. Elle permet notamment : (1) de documenter l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé ; (2) de guider le choix de la voie d’administration la plus appropriée ; (3) de définir des schémas posologiques pertinents permettant une efficacité pharmacologique tout en limitant les risques de toxicité ; (4) d’identifier les principaux métabolites issus de la biotransformation, et d’évaluer leur contribution potentielle à l’efficacité ou à la toxicité. En phase de recherche préclinique, ces données ne peuvent être obtenues qu’au moyen de modèles animaux, avant toute administration du candidat-médicament chez l’Homme. Elles constituent par ailleurs un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Dans le cas du repositionnement de médicaments déjà autorisés, en particulier lorsqu’un changement de voie d’administration, de formulation ou d’indication est envisagé, l’établissement ou l’actualisation du profil pharmacocinétique est également nécessaire afin de garantir la sécurité et la pertinence du développement. Ce projet a donc pour objectif de déterminer le profil pharmacocinétique de différents composés, afin d’éclairer les décisions de poursuite, d’adaptation ou d’arrêt de leur développement préclinique. Cette évaluation s’appuiera sur deux modalités expérimentales complémentaires : une étude après administration unique, et une étude après administrations répétées, réalisées chez le rat ou la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer le profil pharmacocinétique d’un composé avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements, d’adapter le schéma posologique, et de répondre aux exigences des agences réglementaires, fournissant un préalable nécessaire à toute expérimentation ou commercialisation chez l’humain. À court terme, ce projet générera des données quantitatives sur l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination des composés étudiés. Ces informations permettront d’orienter rapidement les décisions internes concernant la sélection, l’optimisation ou l’arrêt du développement de candidats-médicaments, contribuant ainsi à une utilisation plus rationnelle des ressources scientifiques et animales. À plus long terme, les connaissances acquises participeront à l’amélioration des stratégies de développement des médicaments, notamment en optimisant la sélection des doses et des voies d’administration, et en réduisant les risques d’échec lors des phases cliniques. Ces avancées bénéficieront indirectement aux patients, en favorisant la mise à disposition de traitements plus sûrs et plus efficaces, ainsi qu’aux acteurs de la recherche biomédicale. Ce projet contribue également à l’avancement des connaissances scientifiques en pharmacocinétique, en générant des données sur des composés de nature variée (petites molécules, peptides, biomolécules), parfois encore peu caractérisés. Les bénéfices attendus pourront être obtenus directement dans le cadre de ce projet pour les composés étudiés. Toutefois, leur valorisation complète, notamment en termes de développement clinique ou de mise sur le marché, nécessitera des étapes complémentaires (toxicologie, essais cliniques). Enfin, les résultats obtenus, qu’ils soient positifs ou négatifs, seront exploités en interne pour orienter les programmes de recherche et pourront, lorsque cela est possible, être valorisés (publications, communications scientifiques), contribuant ainsi à la diffusion des connaissances et à l’amélioration des pratiques expérimentales.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à des administrations de composés par injection ou gavage, de manière aiguë (une seule administration) ou répétée sur une durée allant de quelques minutes à environ 15 minutes par séance (temps nécessaire à la contention, l’injection et l’observation immédiate). Le nombre d’administration dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérée, cela pourra être une fois par semaine jusqu’à deux fois par jour. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés en utilisant un anesthésique au cours de l’étude afin de mesurer la concentration sanguine du candidat-médicament et/ou de ses métabolites, tout en respectant le volume maximal autorisé ainsi que le temps de récupération par animal. Chaque prélèvement dure environ 5 minutes. Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, des séances d’imagerie non invasive sous anesthésie gazeuse pourront être effectuées, avec un maximum de 5 par semaine. Chaque séance dure environ 5 à 10 minutes, incluant l’induction, la mesure et le réveil. En fonction du produit testé, de sa fréquence d’administration et de données scientifiques concernant son absorption, une mise à jeun pré- et/ou post-administration pourra être envisagée. La durée de jeûne sera limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique, généralement 12h chez la souris et 24h chez le rat, et l’eau restera accessible.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dépendront du type d’administration employée. Ainsi, les injections peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’administration par gavage peut entraîner un inconfort, une irritation de l’œsophage et du stress lié à la contention. Les administrations répétées, quel que soit le mode, peuvent générer une appréhension de la manipulation et un stress accru. Une éventuelle mise à jeun pré- et/ou post-administration (bien que limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique) peut également être un vecteur de stress. Deux types de prélèvements sanguins pourront être effectués : d’une part des prélèvements intermédiaires réalisés sous anesthésie qui peuvent causer une douleur passagère, une petite hémorragie locale ou un stress lié à la contention ; d’autre part des prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie et analgésie, en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Les doses administrées seront choisies sur la base de la littérature et/ou des résultats d’études préalables de toxicité aigüe et/ou répétée conduites en interne de telle sorte qu’elles n’induisent pas d’effets délétères ou de souffrance chez l’animal. Cependant, selon la nature du composé testé et la fréquence d’administration, des effets indésirables systémiques modérés pourraient également apparaître, tels qu’une perte de poids, une modification du pelage ou une altération de l’état général (léthargie, diminution de l’activité, troubles digestifs).

Devenir

La quantité de sang nécessaire pour réaliser les études de pharmacocinétique est trop élevée pour laisser une souris en vie après prélèvement ; elles seront donc euthanasiées juste après prélèvement. De plus, l'euthanasie est nécessaire pour permettre une collecte des organes afin d'analyser plus avant les effets physiologiques et biochimiques ainsi que la répartition histologique du composé et/ou de ses métabolites.

Remplacement

Notre projet se focalise sur un modèle intégré d’étude de pharmacocinétique nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier et est un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Il n'existe pas de modèle alternatif reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur la pharmacocinétique du traitement. Pour les études en traitement aigu, l’analyse des données entraînera la comparaison au maximum de 64 groupes de souris (groupe contrôle négatif et groupes traitement avec jusqu’à 3 doses de produit testées ; étude chez les 2 sexes ; 8 timepoints pour chaque groupe). Pour les études en traitement répété, l’analyse des données entrainera la comparaison de 80 groupes de souris (groupe contrôle négatif et groupes traités avec jusqu’à 4 cinétiques de traitements différentes ; étude sur les 2 sexes ; 8 timepoints pour chaque groupe). Pour la conduite de ces 2 procédures chez le rat, le nombre de groupes pourra être réduits à 16 et 20 respectivement, puisque chaque animal pourra être prélevé à 4 time-points différents. Une analyse statistique sera réalisée à l’aide d’un test non paramétrique. Un nombre de 4 animaux par groupe est requis pour obtenir une puissance statistique minimale et décrire précisément l’évolution de la disponibilité systémique du composé et/ou de ses métabolites en fonction du temps et du sexe.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront le respect de l’animal ; il y aura 2 à 3 rats ou 5 à 6 souris par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, de l’imagerie non-invasive pourra être effectuée pour suivre le profil de distribution du produit, permettant d’augmenter la quantité d’informations recueillies sans dégrader le bien-être animal. Lors de l’imagerie, comme lors des administrations du produit par les voies les plus invasives ou lors des prélèvements sanguins intermédiaires (sur rats uniquement), les animaux seront anesthésiés avec un inducteur chimique ou gazeux. Lors d’une anesthésie chimique, cette dernière sera antagonisée pour favoriser le réveil et la récupération des animaux. En revanche, aucune analgésie n’est possible au cours des études, puisqu’elle pourrait modifier le profil pharmacocinétique du composé étudié. A la fin des procédures, lors des prélèvements de sang avant euthanasie, une analgésie sera cependant réalisée par l’ajout d’un collyre analgésique en plus de l’anesthésie gazeuse. Un tableau de suivi a été mis en place permettant de définir les points limites adaptés.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d'étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de pharmacocinétique en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu, alimenté par de nombreuses données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l'espèce utilisée dépendra en particulier de la molécule utilisée, des objectifs et des besoins de l'étude. Elle pourra être éventuellement testée dans les 2 espèces afin de montrer documenter une pharmacocinétique espèce-indépendante. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, à un stade de jeune adulte pour permettre de déterminer le profil pharmacocinétique du traitement sur des animaux à maturité sexuelle dont les organes et le système immunitaire sont pleinement développés.

Infectées par le nez avec des bactéries responsables de pneumonies, Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae, sous anesthésie, 5 778 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'infection peut entraîner une perte de poids et une dégradation de l'état général, un score clinique déclenchant l'arrêt pour les animaux les plus atteints. Les souris sont ensuite tuées pour dénombrer les bactéries dans les poumons, la rate et la moelle osseuse. Le porteur reconnaît disposer déjà de tests in vitro, mais juge la souris "nécessaire" pour reproduire la complexité de l'infection.

Objectifs

Les infections des voies respiratoires demeurent un problème de santé publique majeur. Les bactéries, en particulier Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae, comptent parmi les principales responsables d’infection du tractus respiratoire et peuvent induire une pneumonie. Celle-ci peut évoluer vers une maladie invasive lorsque les bactéries pénètrent dans la circulation sanguine. Dans le cas de Streptococcus pneumoniae, la sévérité de la maladie est exarcerbée chez les patients infectés par le virus de la grippe. Des vaccins existent contre Streptococcus pneumoniae, mais leur efficacité est limitée, tandis qu’aucun vaccin n’est actuellement disponible contre Klebsiella pneumoniae. Ces bactéries sont considérées comme prioritaires par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) en raison de l’apparition de souches très virulentes et/ou résistantes aux antibiotiques, qui rendent certains traitements inefficaces. Ces observations montrent la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Stimuler le système immunitaire apparaît comme une piste prometteuse pour surmonter les limites des traitements actuels. Pour se faire, il est donc essentiel de mieux comprendre comment l’organisme se défend contre les infections à Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae. Lors d'une infection bactérienne, les tissus détectent les pathogènes grâce à des récepteurs du système immunitaire et déclanchent rapidement de nombreux mécanismes de défense, contre lesquels les bactéries développent difficilement des résistances. Stimuler ces réponses représente donc une piste prometteuse pour traiter les infections respiratoires. Associée aux antibiotiques, l’immunothérapie pourrait offrir une stratégie plus durable, améliorant la prise en charge des patients tout en limitant la progression de l’antibiorésistance. Le projet comporte les objectifs suivants : 1- Identifier les mécanismes immunitaires activés par Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae, afin d'identifier ceux qui jouent un rôle protecteur. 2- Identifier les éléments de Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae qui déclanchent ou modulent ces réponses immunitaires 3- Utiliser ces connaissances pour proposer une nouvelle stratégie de traitement de ces infections respiratoires

Bénéfices attendus

Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit aux infections respiratoires. Identifier les composantes protectrices de cette réponse pourrait permettre de développer des immunothérapies capables de renforcer les défenses de l’organisme, utilisées seules ou en combinaison avec des antibiotiques. En parallèle, identifier les éléments des bactéries qui modulent cette réponse pourrait, à plus long terme, ouvrir la voie à de nouveaux vaccins. Ces avancées pourraient améliorer la prévention et la prise en charge des infections, réduire les complications et les décès, limiter l’usage des antibiotiques et ralentir l’antibiorésistance, avec un impact majeur pour la santé publique.

Procédures

Pour mimer l’infection pulmononaire, les animaux recevront la bactérie Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae par administration intranasale sous anesthésie par injection intrapéritonéale. Ce geste dure moins d’une minute et conduit à une anesthésie courte qui maintient l'animal en sommeil environ 20 minutes. Pour mimer l’infection invasive à Klebsiella pneumoniae, les animaux recevront la bactérie par administration intrapéritonéale, geste qui dure moins d’une minute. Certaines analyses nécessiteront un prélèvement sanguin, geste qui dure moins d’une minute, et qui sera réalisé sur des animaux sous anesthésie gazeuse. L’efficacité des immunomodulateurs associés ou pas à des antibotiques sera également testé contre une infection pulmonaire à Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale soit un gavage oral, soit une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, chacun de ces gestes durant moins d’une minute. L’anesthésie gazeuse dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les expériences comprennent une étape d’infection pulmonaire avec la bactérie Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae. Des analyses seront effectuées à des temps précoces, avant la survenue d’effets indésirables dûs à l’infection. Néanmoins, à des temps plus tardifs, les bactéries peuvent provoquer une infection respiratoire chez la souris qui peut se traduire par une perte de poids et/ou une altération de l’état général. Des critères d’arrêts de l’étude, évalués grâce à un score clinique, ont été définis afin de contrôler le bien-être des animaux. Ainsi, la mesure du poids de l’animal et l’inspection des signes physiques (pelage, respiration) et du comportement (mobilité) seront effectués de façon quotidienne, afin de détecter le plus précocément possible l’apparition de signes de souffrance. Les expérimentateurs sont formés à ces observations et procèdent à l’euthanasie des animaux si ces paramètres sont significativement détériorés, quel que soit le groupe expérimental. La dernière partie du projet consiste à traiter les animaux avec un immunomodulateur associé ou pas à un antibotique, pour ralentir/prévenir la survenue d’une infection pulmonaire. Dans ce cas, on s'attend à une amélioration de l’état général des animaux traités en comparaison à des animaux non traités.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié afin d’analyser la réponse immunitaire dans différents tissus et/ou de déterminer le nombre de bactéries dans les poumons, la rate, la moelle osseuse. Les animaux développant des signes sévères d’infection seront euthanasiés.

Remplacement

Des études in vitro sont déjà en place pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires et les bactéries. Néanmoins, à ce jour, la complexité des processus infectieux et immunitaires ne peut pas être intégralement reproduite dans des tests in vitro et l’utilisation de souris sera donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet, dans le respect des stratégies de réduction et de raffinement ci-dessous.

Réduction

- Modélisation in vitro : Des approches sont déjà en place pour analyser les interactions entre les cellules immunitaires isolées d’animaux et les bactéries. Une veille bibliographique sera réalisée afin d’identifier d’éventuels nouveaux protocoles d’isolement de cellules immunitaires, pour étudier leur interaction avec les bactéries. - L’utilisation de souris génétiquement identiques dans nos expériences permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats robustes. - La taille des groupes d'animaux dans les expériences réalisées est déterminée par des méthodes statistiques afin d’utiliser le strict nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Raffinement

Lors de l’euthanasie, de multiples tissus (poumons, ganglions drainants, rate, moelle osseuse, sang) seront prélevés sur chaque animal afin de rassembler un maximum de données exploitables pour chaque animal. L’utilisation de techniques de mesures à moyen et haut débit (qui mesure plusieurs paramètres par échantillon) permettra également d’obtenir des données multiples sur chaque échantillon et de raffiner les analyses.

Choix des espèces

Le modèle de la souris est aujourd’hui l’un des plus utiles pour étudier comment le corps se défend contre les infections respiratoires. Nous disposons de nombreuses souris génétiquement modifiées, ce qui permet de mieux comprendre le rôle de certains mécanismes du système immunitaire. De plus, il existe des outils très performants pour analyser les cellules chez la souris, ce qui facilite l’étude détaillée de ces défenses. Pour les souris obtenues auprès de fournisseurs agréés, des animaux adultes âgés de 7 à 12 semaines en début d’expérience seront utilisés. Pour les animaux provenant de l’élevage local, les animaux pourront être âgés de 7 à 20 semaines. A ces âges, le système immunitaire des souris est considéré comme compétent. Enfin, la détermination des doses de bactéries nécessaire à l’infection pulmonaire a déjà été établi par l’ensemble de la communauté scientifique.

Identifiées par un poinçon à l'oreille, traitées aux antibiotiques par quatorze gavages puis recevant des selles humaines par douze gavages supplémentaires, 60 souris vont être utilisées pour étudier l'effet du microbiote humain sur le foie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés, les pesées et le prélèvement sanguin à la queue provoquent stress et douleurs passagers. Toutes sont tuées à l'issue pour collecter leur sang et leurs tissus. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit les interactions entre microbiote transplanté et métabolisme du foie.

Objectifs

Des travaux précédents ont mis en évidence que : -chez l’Homme, plus l’accumulation de graisse dans le foie est sévère, plus le taux sanguin d’un métabolite, appelé ici X, est élevé ; -chez la souris, le métabolite X, lorsqu’il est administré par gavage, peut à lui seul provoquer l’accumulation de graisse dans le foie. Comme ce métabolite X est produit par le microbiote intestinal, nous souhaitons comprendre si le microbiote humain est directement responsable de sa production et donc de l’accumulation de graisse dans le foie. Pour répondre à cette question, nous allons réaliser des transplantations fécales chez la souris. Cela consiste à transférer le microbiote de donneurs humains (personnes en bonne santé ou patients atteints de foie gras, présentant soit de faibles soit de forts taux de métabolite X dans le sang) dans des souris dépourvues de leur propre microbiote. L’objectif est de vérifier si le microbiote humain suffit à reproduire chez la souris des taux sanguins similaires de métabolite X (faibles ou élevés) et s’il peut entraîner, selon l’origine des selles, une accumulation plus ou moins importante de graisse dans le foie. L’expérience comportera plusieurs étapes : 1. une phase d’acclimatation des animaux ; 2. une élimination du microbiote intestinal des souris grâce à un traitement antibiotique d’une semaine ; 3. la transplantation fécale, 4. un prélèvement de sang sous anesthésie pour mesurer les concentrations du métabolite X, suivi de la collecte des tissus nécessaires aux analyses.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de déterminer si le microbiote de patients avec la maladie du foie gras ayant des taux élevés de métabolite X peut, à lui seul, augmenter ce métabolite et provoquer une accumulation de graisse dans le foie chez la souris, comparé à des microbiotes de sujets sains ou de patients présentant de faibles taux. Cela établira un lien direct entre certaines bactéries, le métabolite X et les atteintes du foie. À plus long terme, ces résultats pourront guider le développement de stratégies visant à réduire les bactéries responsables de la surproduction du métabolite X, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour prévenir ou traiter la maladie du foie gras.

Procédures

Identification : les 60 souris recevront un unique petit poinçon au niveau de l’oreille pour permettre leur identification (durée : < 30 s, contention comprise). Traitement antibiotique : les 60 souris seront traitées pendant 7 jours consécutifs par un cocktail d’antibiotiques administré deux fois par jour (à 8 h d’intervalle). Chaque animal recevra donc 14 gavages (durée : ~30 s par gavage, contention comprise). Transplantation fécale : les 60 souris recevront des suspensions de selles humaines par gavage 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (lundi, mardi, mercredi), et ce durant 4 semaines, soit 12 gavages par animal (durée : ~30 s par gavage). Pesées : les 60 souris seront pesées 2 fois par semaine sur toute la durée de l’étude, soit 10 pesées par animal (durée : ~30 s par manipulation). Analgésie et anesthésie : les 60 souris recevront une injection d’antidouleur (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie), suivie 30 minutes plus tard d’une injection d’anesthésiant (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie). Jeûne : les 60 souris seront soumises à un jeûne nocturne avant la mise à mort afin de stabiliser les paramètres métaboliques et permettre au mécanisme identifié par lequel le métabolite induit un stockage de lipides de se mettre en place. Prélèvement sanguin : les 60 souris subiront une petite incision (< 1 mm) au bout de la queue permettant de recueillir quelques gouttes de sang (durée : ~1 min pour l’incision et le prélèvement).

Impact sur les animaux

L’identification par poinçonnement de l’oreille peut provoquer une douleur légère et transitoire. Le traitement antibiotique d’une semaine est susceptible d’entraîner une légère perte de poids. Les gavages induisent un stress et un inconfort temporaires. Les pesées génèrent un stress léger. Les injections nécessaires à l’anesthésie et à l’analgésie provoquent une légère douleur momentanée. La période de jeûne nocturne peut entraîner un inconfort supplémentaire, et le prélèvement sanguin à la pointe de la queue s’accompagne d’une douleur passagère. Aucun effet indésirable n’a été observé lors de protocoles similaires menés dans notre laboratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter le sang et les tissus nécessaires aux analyses.

Remplacement

L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’un microbiote humain à induire la production du métabolite X et à déclencher l’accumulation de graisse dans le foie. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre le microbiote transplanté, l’absorption intestinale, le métabolisme du foie et la régulation du métabolite X. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser le transfert des métabolites, la dynamique hôte–microbiote ni les conséquences. Le modèle souris reste donc le seul modèle pertinent pour établir un lien causal entre composition du microbiote, production du métabolite X et altérations du foie.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, en utilisant des données issues de protocoles antérieurs menés chez des patients atteints de la maladie du foie gras pour lesquels le métabolite X a été mesuré en circulant. Ce calcul indique qu’un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour détecter une différence significative entre groupes. Par ailleurs, un maximum de tissus sera prélevé et conservé lors de la mise à mort, afin d’être utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés dans le cadre de collaborations, permettant ainsi d’éviter la répétition inutile d’expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront surveillés cinq fois par semaine, avec un suivi individuel du poids à J0 et deux fois par semaine et une mesure de la consommation alimentaire deux fois par semaine par cage. Ces suivis réguliers permettront d’identifier précocement tout signe de perte de poids excessive. Les gavages seront réalisés exclusivement par du personnel expérimenté, afin de garantir un geste précis et rapide minimisant stress et inconfort. Une sonde souple sera utilisée pour les gavages pour réduire le risque d’irritation ou de lésion de l’œsophage. Après chaque gavage, chaque animal sera observé durant au moins 5 minutes pour vérifier l’absence de douleur ou de détresse. Les volumes administrés par gavages seront strictement limités au minimum compatible avec la procédure pour réduire l’inconfort. Un enrichissement supplémentaire des cages sera mis en place durant la semaine de traitement antibiotique, ainsi que pendant la nuit de jeûne, afin d’atténuer le stress et maintenir un comportement normal. Les antibiotiques seront administrés par gavage plutôt que dans l’eau de boisson, afin de préserver une prise alimentaire et hydrique optimale et d’éviter une perte de poids excessive durant la phase d’antibiothérapie. Une seule incision de moins de 1 mm à l’extrémité de la queue sera réalisée pour recueillir les quelques gouttes nécessaires à l’évaluation du métabolisme du sucre. Les volumes injectés pour l’anesthésie et l’analgésie seront réduits au strict minimum efficace. Avant le prélèvement sanguin final, les animaux seront anesthésiés par injection avec analgésie complémentaire. La mise à mort sera ensuite réalisée par dislocation cervicale. Enfin, des points limites prédéfinis et adaptés au modèle seront appliqués afin d’interrompre la procédure dès l’apparition de signes précoces de souffrance ou de détérioration de l’état général.

Choix des espèces

La souris constitue l’espèce la plus appropriée pour répondre à la question scientifique posée. En effet, elle permet de réaliser des transplantations fécales dans des conditions contrôlées et reproductibles, tout en offrant une physiologie de l’intestin et du foie bien caractérisée et comparable à celle de l’Homme. Les modèles souris sont de référence pour étudier les interactions hôte–microbiote, la production de métabolites d’origine bactérienne et leurs conséquences. De plus, les procédures de traitements avec les antibiotiques et de transplantation de selles humaines sont validés dans cette espèce, rendant la souris le modèle le plus fiable pour établir un lien causal entre microbiote humain, métabolite X et altérations du foie. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux ont terminé leur phase de croissance, présentent une physiologie stable et offrent une meilleure homogénéité des réponses. Par ailleurs, des souris de cet âge tolèrent bien les traitements antibiotiques nécessaires à l’élimination du microbiote, ce qui garantit la fiabilité et la reproductibilité du protocole.

Nourries d'un régime destiné à imiter l'obésité humaine, 320 souris vont être utilisées pour étudier une atteinte cardiaque liée au diabète, dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des échographies cardiaques sur animal vigile, des mesures de glycémie par prélèvement à la queue et des tests métaboliques après six heures de jeûne. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est prévu, alors que le niveau de souffrance déclaré du projet est modéré. La mise à mort sert à prélever plusieurs organes jugés "indispensables" à l'évaluation de la maladie.

Objectifs

Ce projet étudie comment un régime riche en graisses et sucres, comme chez les personnes en surpoids et en obésité, peut endommager le foie (stéatose) et le cœur chez des souris adultes mâles et femelles. Nous comparons ces souris dans deux conditions : un avec ce régime riche en graisses et sucre, et un avec un régime pauvre en graisse . L'idée est de mieux comprendre ces maladies hepatiques courantes liées à l'obésité.

Bénéfices attendus

Ces observations pourraient aider à identifier des signaux précoces de lésions cardiaques dues à un foie malade, pour prévenir ou traiter mieux ces affections chez l'homme. Cela profiterait à des millions de personnes touchées par l'obésité, et leurs complications cardiaques, en guidant de futurs médicaments ou conseils alimentaires. Le projet valide aussi un modèle fiable pour d'autres recherches, en comparant les résultats de deux laboratoires.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé sur animaux vigiles préalablement épilés, sur tous les animaux. Il s’agit de maintenir les animaux sur le dos pour une durée de 3-4 minutes, le temps d’appliquer la sonde d’échographie et de procéder à l’enregistrement de l’échocardiogramme. Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goutte de sang à la queue que l’on récupère sur un glucomètre afin de procéder à la lecture de la glycémie. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mis à jeun pendant 6h, injection (quelques secondes moins de 5 secondes) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime (soit n=5 pour ITT et n=5 pour GTT).

Impact sur les animaux

Les animaux sont nourris avec un régime spécial pour imiter l'obésité humaine. Aucun effet douloureux prévu. On vérifie quotidiennement leur santé (poids, comportement). Lors des suivis métabolique et cardiaque, le moindre signe de malaise (ex. glycémie anormale, polyurie associé à diabète) entraîne un arrêt immédiat de l'analyse et exclut l'animal du protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.

Réduction

La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicats inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins nourris par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Afin d’optimiser au maximun le protocole en cours, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus).

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime hypercalorique (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo le developpement de la pathologie stéatohépatite. D’ailleurs, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (5 mois). En effet, la pathologie de la stéatohépatite se développe essentiellement chez les adultes.