Souris
Optimisation des modèles de maladies neurodégénératives chez la souris par implantation intracérébrale d’organoïdes cérébraux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l'issue et 60 reproductrices réutilisées pour d'autres projets ou le maintien de la lignée. Un organoïde cérébral de 1 à 2 mm leur est greffé dans le cerveau sous anesthésie, parfois suivi d'une injection d'une molécule candidate. Le porteur indique des effets possibles pendant environ une semaine, stress, douleur, œdème, hémorragie ou comportement anormal, ainsi qu'un risque de prolifération des cellules injectées. Les retombées thérapeutiques sont renvoyées au long terme, et il affirme qu'un tissu complet reste accessible uniquement via l'animal.
Objectifs
Les recherches dans le champ du vieillissement du cerveau humain et des maladies neurodégénératives sont largement menées chez des souris génétiquement modifiées qui surexpriment des protéines pathologiques associées à ces maladies. De ce fait, il est difficile d’étudier ces pathologies au plus proche du contexte physiologique ainsi que les mécanismes qui mènent à leur propagation. Le projet s’intéresse à mettre au point un nouveau modèle murin permettant l’étude du vieillissement et des maladies associées. Les souris recevront une greffe d’organoïdes cérébraux dans le cerveau. Ces organoïdes, aussi appelés « minibrain », sont des structures en trois dimensions de cellules cérébrales obtenues in-vitro. La greffe de ces organoïdes chez la souris permettra d’évaluer de multiples mécanismes, comme la vascularisation ou la mise en place des projections axonales, mais aussi leur colonisation par les cellules gliales et l’interconnexion neuronale entre elles et les tissus cérébraux de l’hôte. En conditions pathologiques, suite à la greffe d’organoïdes provenant de cellules génétiquement modifiés, les conditions d’initiation de la pathologie étudiée seront plus proches de celles retrouvées chez les patients. Il sera alors possible d’étudier l’évolution, la prolifération et la colonisation de la pathologie au sein d’un organisme modèle et d’évaluer la transmission des signaux nerveux entre la greffe et le tissu hôte des souris. Enfin, une dernière partie s’intéressera à valider et repositionner notre modèle avec les traitements déjà utilisés chez les modèles transgéniques et qui permettent d’endiguer la propagation et/ou avoir des effets bénéfiques sur les déficits observés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra dans un premier temps d’étoffer les connaissances scientifiques sur plusieurs aspects, tout d’abord techniques, sur l’implantation d’un organoïde chez la souris mais aussi fondamentales, sur les mécanismes prolifératifs des maladies neurodégénératives ainsi que la mise en place des processus neuronaux et gliaux. Un nouveau modèle murin sera alors accessible à la communauté scientifique pour étudier toutes sortes de mécanismes cérébraux. Ce projet vise aussi à repositionner notre modèle par rapport au modèles transgéniques en évaluant les effets de différentes stratégies thérapeutiques déjà éprouvées chez les animaux transgéniques. Ce nouveau modèle pourrait permettre à plus long terme la mise en place de traitements, préventifs ou palliatifs, pour lutter contre les maladies neurodégénératives.
Procédures
En fonction de la procédure les animaux recevront au maximum une intervention chirurgicale pour réaliser la greffe de l’organoïde dans le cerveau des rongeurs. Cet acte chirurgical sera effectué sous anesthésie et analgésie, qui durera environ une trentaine de minutes. Une injection permettant l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée elle aussi sous anesthésie (30 minutes), un mois après. D’autres animaux pourront recevoir, toujours sous anesthésie (30 minutes), une injection contenant les cellules des organoïdes dissociées suivi d’une autre injection un mois plus tard contenant une molécule candidate pour un traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux participant à cette étude pourraient présenter des effets indésirables suite à la greffe dans la cavité cérébrale d’un organoïde dont la taille est comprise entre 1 et 2mm de diamètre. Dans la semaine qui suit cette procédure, les animaux pourraient être affectés de différentes manières par des effets indésirables : un stress et/ou une douleur accrus, un œdème ou une hémorragie ou encore un comportement anormal. La durée probable de ces effets indésirables est estimée à une semaine. Un autre effet indésirable possible est la prolifération des cellules injectées dans les temps plus tardifs.
Devenir
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour les autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés. Il sera ainsi possible de rechercher et scorer les mécanismes permettant à l’organoïde et au tissu cérébral de l’hôte de cohabiter, ainsi que les effets pathologiques liés à la présence d’un organoïde porteur d’une mutation retrouvée dans les maladies neurodégénératives. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Remplacement
De nombreuses caractérisations du développement et de la prolifération des maladies neurodégénératives ont déjà été faites au niveau cellulaire et sur des modèles animaux transgéniques. Nous souhaitons mettre en place dans ce projet un nouveau modèle animal, le plus complet possible, qui permettrait de suivre le développement de ces pathologies. Pour suivre et évaluer la dissémination des marqueurs physiopathologiques, nous avons besoin d’un tissu complet disposant de tous les types cellulaires interagissant ensemble. Tous ces paramètres sont accessibles uniquement via un modèle animal.
Réduction
Dans la littérature spécialisée, les essais « pilotes » se font sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes. Chaque expérience peut être répétée au moins 2 fois, si besoin, pour obtenir des données statistiquement exploitables. Pour établir un nouveau modèle biologique et acquérir une expertise technique pour effectuer le geste chirurgical pour effectuer la greffe, nous envisageons d’utiliser des groupes de 5 animaux lorsqu’il s’agit de mettre au point les conditions optimales pour réaliser la greffe et des groupes de 10 animaux pour les études des pathologies ou des traitements. Ce nombre d’animaux par groupes nous permettra de considérer l’étude comme statistiquement significatives. Pour une expérience donnée, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde et dernière répétition ne sera pas effectuée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement approprié à leur statut immunodéficitaire (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion 0,22 µm, cages avec couvercle filtrant dans un local isolé) à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies autant que nécessaire. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens, sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards (tubes de carton, boules de coton…). De plus, une première expérience sera destinée à apporter un raffinement technique sur l’implantation d’organoïdes cérébraux chez la souris en passant d’une opération chirurgicale à une injection intracérébrale. Des mesures spécifiques sont prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales : surveillance accrue, soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur, …). Mise en place egalement de points limites adaptés et d’un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites .
Choix des espèces
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine des maladies neurodégénératives. Il s’agit du modèle le plus utilisé et le plus étudié dans la communauté scientifique et une bibliographie riche et abondante y est associée. Pour réaliser notre projet, nous nous appuierons sur les différentes données déjà publiées, comme l’évolution des pathologies pour les animaux génétiquement modifiés, afin de comparer ces données aux résultats que nous obtiendrons avec notre nouveau modèle. Ces données nous permettent de faire reposer ce projet sur des bases bibliographiques solides qui ne sont pas à répéter, ce qui va aussi dans la logique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, le laboratoire dispose des compétences techniques pour effectuer les greffes d’organoïdes chez la souris ce qui permettra une diminution du nombre d’animaux utilisés. Age/poids des souris : 6 à 8 semaines et de 20 à 25g. Il s’agit d’après la littérature scientifique du stade optimal pour réaliser les greffes d’organoïdes chez les souris immunodéprimées.
IronTWIK
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
De l'embryon de 15 jours à la souris de 60 jours, les petits de femelles gestantes nourries avec plus ou moins de fer sont tués à cinq stades de leur développement pour prélever leur cerveau, leur duodénum, des neurones de la moelle épinière, leurs nerfs sciatiques et de la peau du dos. 400 souris, issues de lignées qui expriment différentes formes du canal potassique TWIK1 ou en sont dépourvues, vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Pour ce niveau sévère, le porteur affirme que le projet ne comporte, hors le régime appauvri en fer, "aucune procédure pouvant nuire au bon développement" des souris, tout en envisageant un déficit nerveux chez les souriceaux d'une lignée plus sensible. Il annonce trois lignées dans ses objectifs et quatre dans son calcul d'effectifs. Il exclut toute réutilisation ou adoption, en écrivant devoir envisager que les effets du régime "puissent se développer plus tard".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet IronTWIK1 est de montrer que le canal ionique TWIK1 joue un rôle central dans la maturation des fibres nerveuses et que cette fonction est liée au métabolisme du fer par les neurones concernés. Pour cela, nous souhaitons soumettre les femelles gestantes de 3 lignées de souris exprimant ou non des formes différentes du canal TWIK1 (absent, sélectif pour le potassium, non-sélectif pour le potassium) à deux régimes alimentaires se distinguant par des teneurs en fer différentes ; un dit « haut Fer » et un dit « bas Fer ». Nous sacrifierons les souriceaux à différents stades de leur développement pour analyser les niveaux de maturation des fibres nerveuses concernées ainsi que le développement du système nerveux de la peau.
Bénéfices attendus
Le canal TWIK1 participe avec les autres membres de la famille des canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) au maintien du potentiel de repos des cellules excitables et à la protection neuronale. Les neurones liés au toucher et qui constituent les afférences principales des mécanorécepteurs de la peau et des poils sont caractérisés par la présence d’une couche de myéline. Bien qu'on ne s'explique toujours pas le rôle qu'il puisse y jouer, le canal TWIK1 apparait comme le mieux exprimé de sa famille dans ce type de fibres nerveuses. Or, ce canal potassique partage avec les protéines essentielles à la maturation et la myélinisation de ces même fibres nerveuses une localisation subcellulaire et une dépendance au pH qui laisse supposer qu'il pourrait en contrôler l’activité et la maturation. Une telle mise en évidence permettrait d’envisager un contrôle pharmacologique de cette maturation par le contrôle de l’activité ou de la sélectivité de ce canal potassique. Si cette hypothèse était avérée, ce projet, ouvrirait une porte encore jamais utilisée pour comprendre les mécanismes de la maturation des fibres nerveuses ni dans le traitement des maladies neurodégénératives par la pharmacologie liée à ces canaux ioniques.
Procédures
Tous prélèvement prévus dans ce projet sera effectué sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Outre l’exposition des mères gestantes à un régime appauvri en fer, ce projet ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux. Il est possible toutefois qu’une des trois lignées étudiées soit plus sensible que les autres à cette diminution du taux de fer dans la nourriture et que cette sensibilité différente se manifeste par un déficit nerveux altérant le développement normal des souriceaux. Le cas échéant, nous procéderons à l’application des règles établies pour les points critiques qui peuvent aller jusqu’à l'arrêt de la procédure et l'euthanasie des animaux.
Devenir
Nous ne savons pas à l'heure actuelle les effets que peut avoir un régime appauvri en Fer sur les souris génétiquement modifiées pour le canal TWIK1. Même si ces effets ne sont pas visibles en fin de procédure, nous devons envisager que ceux-ci puissent se développer plus tard c'est pourquoi nous ne pouvons pas choisir l'option de réutiliser, replacer ou adopter les animaux.
Remplacement
Le remplacement des souris, par l’utilisation de cultures cellulaires par exemple, a déjà largement été employé dans l’étude de ce canal. L’observation de TWIK1 a débuté par son clonage en 1996. En 2012, les mécanismes de changement de sélectivité lors d'une exposition à des pH acides ont été étudiés dans les ovocytes de Xénopes. Le canal TWIK1 est un canal fonctionnel pour lequel il est à présent indispensable d’étudier le mode de fonctionnement in vivo et son rôle physiologique. L’implication de TWIK1 dans la maturation des fibres nerveuses liées au toucher et à la proprioception nécessite l’utilisation d’un modèle animal car pour le moment, aucun système in vitro ne permet de reproduire l’ensemble des mécanismes physiologiques d’un organisme entier. De par ses similarités avec la physiologie humaine, et parce ce que nous possédons trois modèles murin génétiquement modifié pour TWIK1, la souris constitue le meilleur modèle pour adresser cette question. De plus, la caractérisation de cette maturation doit tenir compte du développement de l'animal et doit donc se faire sur un animal entier.
Réduction
Les 4 lignées de souris concernées par ce projet sont déjà disponibles dans le laboratoire où elles font l’objet d’une étude sur le rôle du canal TWIK1 dans la perception de la douleur et dont les procédures ont été validées par les instances ministèrielles. Ici, nous utiliserons indifféremment les animaux mâles et femelles. Une large recherche bibliographique nous a permis d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir une réponse statistiquement significative. La maturation du système nerveux périphérique s’évalue d’une part par la mise en place des fibres spécialisées et d’autre part par la mesure de l’épaisseur de la gaine de myéline des fibres myélinisées. Cette dernière mesure, comparée à l’épaisseur de la fibre nerveuse sans la myéline, constitue un paramètre appelé rapport-g (ou g-ratio). Celui-ci constitue dans ce projet notre variable d’intérêt. Une consultation de la littérature traitant de ce sujet nous a permis, par un calcul de puissance statistique de déterminer la taille d’effectif la plus juste en tenant compte des conditions expérimentales (2 régimes différents, 2 sexes, 4 génotypes). Le calcul effectué dans ces conditions renvoie des effectifs de 6 souris par groupe. Sur tout animal qui entrera dans l’étude nous prélèverons le cerveau, le duodénum, certains neurones de la moelle épinière, les nerfs sciatiques et une section de peau correspondant à la partie haute du dos.
Raffinement
Nous savons que les 3 lignées de souris TWIK1 sont parfaitement viables, qu’elles se reproduisent normalement et que leurs descendances ne présentent aucun signe de mauvais développement. Néanmoins, il n’est pas exclu qu’en présence d’un régime appauvri en Fer la qualité du lait des mères soit modifiée et qu’en fonction de leur génotype, les souriceaux présentent des troubles visibles du développement. Les animaux seront donc observés de façon bihebdomadaire afin de rechercher des signes cliniques indicateurs des différentes conséquences d’un tel régime sur l’organisme. Une feuille d’observation, incluant une grille de score, a été établie qui permettra également d’identifier précocement tout signe de stress ou de douleur. Cette grille de score contient des points limites précis. La mort n’étant pas un point limite acceptable, nous sortirons les souris de l’étude lorsqu’un des points limites sera atteint.
Choix des espèces
L'étude que nous souhaitons mener vise à déterminer l'impact d'un canal TWIK1 excitateur ou inhibiteur sur des structures cérébrales complexes (Cerveau, duodenum, nerfs sciatique et peau velue...). En outre, les analyses de tissus que nous souhaitons réaliser doivent être faites à différents stades du développement. Elles ne peuvent donc pas être faites in vitro au niveau cellulaire car elles requièrent l'intégralité de l'animal. L'espèce animale utilisée sera la souris (Mus Musculus) car c'est le modèle le plus classiquement utilisé pour les manipulations génétiques. De plus, ce modèle présente de fortes similitudes avec l'humain pour les fonctions étudiées. En outre, des souris transgéniques issues du fond génétique des C57Bl6-J exprimant des formes différentes du canal TWIK1, sont déjà disponibles dans notre institut. Celles-ci sont parfaitement viables et ne montrent aucun signe délétère de leur développement. Ce projet concerne 4 lignées. Chaque lignée sera soumise à deux régimes : un dit à « haut Fer » et un dit à « bas fer ». Pour chacune nous prélèverons les embryons au stade E15 (15 jours après la fécondation), les nouveau-nés à P1 puis à P15, à P30 et à P60 (respectivement 1 puis 15 puis 30 puis 60 jours après la naissance). Dans certains neurones de la moelle épinière (DRG), la mesure des niveaux d’expression des gènes codant les marqueurs spécifiques des différents types de fibres sensitives montre que dès le stade E13 (13ème jour après la fécondation), les neurones qui nous intéressent sont déjà différenciés. En choisissant le stade embryonnaire E15 (15 jours après la fécondation), nous pourrons facilement cibler les neurones où le canal TWIK1 est le mieux exprimé. Le stade P1 (1 jour après la naissance) nous permettra de visualiser le niveau d’innervation et la maturation des fibres nerveuses au moment de la naissance. Nous proposons les stades P15 et P30 (respectivement 15 et 30 jours après la naissance) car une étude montre qu’en absence des transporteurs du Fer, la myélinisation des fibres nerveuses est altérée à ces deux stades P15 et P30 puis est compensée pour revenir à un niveau normal. Lors de nos observations de la croissance des souris TWIK1-KO, nous avons observé une alopécie transitoire entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance. En choisissant P60 (60 jours après la naissance), nous sous assurons d’être au-delà de cette 8ème semaine et de pouvoir observer ces éventuels phénomènes de compensation.
Impact d’une infection à Listeria monocytogenes du cerveau sur l’immunité cérébrale et la neurodégénérescence.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Infectées par la bactérie Listeria monocytogenes par gavage, par injection dans le cerveau sous anesthésie ou par voie intraveineuse, puis traitées par trois injections d'antibiotiques, 1 250 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes sont tuées à la fin pour l'étude de leurs organes. Dans un groupe, une encéphalite auto-immune est ensuite déclenchée par des injections, et des souris transgéniques 5xFAD, qui développent des troubles proches de la maladie d'Alzheimer, passent tous les quinze jours pendant sept mois un labyrinthe de Barnes et un test sur cylindre rotatif. Le projet cherche comment les cellules immunitaires du cerveau, après une infection, favorisent ou freinent des maladies neurodégénératives, et n'évoque des cibles thérapeutiques qu'au conditionnel. Le porteur déclare un niveau léger à modéré, et décrit une infection qui peut paralyser les pattes et une encéphalite qui peut priver les souris de mobilité pendant 7 à 15 jours.
Objectifs
Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.
Bénéfices attendus
Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.
Procédures
Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.
Devenir
Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.
Remplacement
L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.
Réduction
Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.
Évaluer le potentiel anticancéreux d’inhibiteurs de l’ARN interférence
- Recherche appliquée
- Cancers
364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-abdominales cinq jours par semaine pendant trois semaines, une greffe de fragments tumoraux ou une injection de cellules cancéreuses, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique une possible altération de l'état général aux doses les plus fortes, les souris atteignant les points limites étant mises à mort. Les retombées, une nouvelle classe d'anticancéreux, sont renvoyées au long terme et au conditionnel, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer la souris.
Objectifs
Les nouveaux traitements anticancer mis au point ces vingt dernières années reposent sur l’activation de la réponse immunitaire, qui est ensuite capable d’attaquer la tumeur. C’est ainsi que fonctionnent les inhibiteurs de points de contrôle, qui ont révolutionné la prise en charge des patients. Mettre au point de nouvelles molécules capables de booster le système immunitaire contre les tumeurs est donc une approche thérapeutique prisée, que ce projet se propose d’explorer. Ce projet propose d’étudier si nos molécules d'intérêt (les inhibiteurs de l’ARNi) pourraient être utilisés comme anticancéreux dans les tumeurs et boosteraient l’immunité antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de tester la capacité d’inhibiteurs de l’ARNi à booster l’immunité antitumorale. À long terme, cela pourrait aboutir à l’utilisation d’une nouvelle classe d’anticancéreux.
Procédures
Dans une première procédure qui vise à évaluer la toxicité et l’efficacité de 2 traitements, les animaux vigiles recevront des injections directement dans l’abdomen à raison de 5 jours par semaine pendant 3 semaines (temps d’injection : quelques secondes) Dans une seconde procédure qui vise à évaluer le rôle anti-cancéreux de nos traitements d’intérêt, les animaux seront greffés avec des fragments tumoraux (animaux anesthésiés – durée de l’anesthésie < 10 min) ou injectés avec des cellules tumorales (animaux vigiles). Les souris seront ensuite traitées à raison de 5 injections directement dans l’abdomen par semaines pendant 3 semaines ou d’une injection tous les 3 jours pendant 3 semaines (temps d’injection : quelques secondes). Deux prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux anesthésiés avant la greffe des tumeurs puis à la fin de la première semaine de traitement (durée de l’anesthésie
Impact sur les animaux
Dans un premier temps, nous allons tester différents régimes de traitement aux inhibiteurs d’ARNi. Au vu de la littérature, nous n’attendons pas de toxicité particulière à faibles doses. Il est possible que nous observions une altération de l’état général des animaux recevant des doses plus élevées. Les souris seront alors mises à mort si elles atteignent les points limites. Dans la suite du projet, nous nous placerons à une concentration de drogue efficace sans effets adverses. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les animaux seront mis à mort dès atteinte d’un point limite
Devenir
Les animaux sont mis à mort à des temps déterminés pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation in vitro, le projet a pour but d’étudier le rôle anticancéreux d’inhibiteurs de l’ARNi chez la souris, organisme vivant intégré et autonome. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini a minima pour obtenir des résultats statistiquement significatifs
Raffinement
Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec une prise en charge de la douleur per et post-opératoire. Une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l'état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en cancérologie : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. Des souris adultes seront utilisées (âge supérieur à 6 semaines). Souris adultes, au système immunitaire mature
Etude du potentiel thérapeutique du blocage des protéines X et Y dans le lymphome T chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules de lymphome T sous anesthésie, puis trois à cinq injections intra-péritonéales de molécules ou de placebo, pour tester le blocage de deux protéines de surface. Le porteur décrit un modèle "sans phénotype dommageable" et une "angoisse légère et de courte durée", formulation en retrait de la gravité modérée déclarée. Il présente cette portée comme "translationnelle" et le recours à la souris comme la seule voie de validation faute de systèmes in vitro fiables.
Objectifs
Les lymphomes T constituent une famille de cancers hématologiques. Les patients atteints de lymphomes T sont traités par poly-chimiothérapies ; toutefois ces traitements sont peu efficaces et il n’existe que très peu d’alternatives thérapeutiques. L’utilisation des immunothérapies, qui ont révolutionné la prise en charges de nombreux types de cancers, est à ce jour quasi-inexistante dans les lymphomes T du fait de l’absence de cibles thérapeutiques bien établies. Nos travaux réalisés chez l’homme in vitro, suggèrent que deux molécules de surface exprimées par les cellules tumorales, nommées X et Y pourraient constituer des cibles intéressantes. Pour valider leur potentiel thérapeutique, nous souhaitons désormais évaluer l’effet de leur blocage dans deux modèles de lymphomes T chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir X et /ou Y comme des cibles potentielles d’immunothérapie chez les patients atteints de lymphomes T.
Procédures
-1 injection de cellules (lymphome T) par voie intraveineuse, sous anesthésie isofluorane (30 secondes/souris) -3 à 5 injections par voie intra-péritonéale, de molécules thérapeutiques (ou de leur placebo) dans un volume total de 100µL. (3 à 5x30 secondes/souris)
Impact sur les animaux
Nos modèles murins ne présentent pas de phénotype dommageable. L’injection de cellules de lymphomes T n’induit pas d’effets secondaires détectables dans la fenêtre de temps de l’étude. Chez la souris, l’injection des thérapies que nous souhaitons tester n’induit pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 3 à 5 injections de médicament ou de placebo par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et foies seront prélevées pour pesée et analyse du phénotype immunitaire .
Remplacement
Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un replicat expérimental sera réalisé si la première exépérience est concluante, afin de renforcer la signification statsitique des données, et de pallier à un problème technique éventuel (ce réplicat ne sera pas fait si les résutlats de la première expérience sont négatifs).
Raffinement
Certaines procédures peuvent induire une douleur légère (injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de lignées de lymphomes T et de réactifs bloquant nos cibles thérapeutiques d’intérêt, qui a notre connaissance n'ont pas été devéloppés dans d'autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines.
Évaluation de l’effet anti-tumoral d’un virus oncolytique combiné à la radiothérapie sur des modèles murins précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau, puis traitée par un virus injecté en intraveineuse et par des irradiations localisées, pour tester cette combinaison avant d'éventuels essais cliniques. Le porteur annonce une possible perte de poids transitoire et n'attend aucun effet indésirable après irradiation. Il juge "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier", jugé impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Le but principal du projet est d'évaluer l'effet thérapeutique de la combinaison d'un virus oncolytique avec l'irradiation sur la réponse tumorale. Ce projet a également pour but de définir le meilleur protocole de traitement afin de mieux guider la conception des protocoles d'études cliniques.
Bénéfices attendus
Les données de ce projet pourrait contribuer aux données précliniques en vue d'études cliniques d'utilisation de virus oncolytiques en combinaison avec l'irradiation (radiothérapie) pour le traitement des tumeurs qui sont en échec thérapeutique et permettraient aussi de mieux définir les protocoles d'études cliniques.
Procédures
Greffes des cellules tumorales: une fois par animal, durée 2 minutes. Injection intraveineuse: 1 fois par animal, durée 5 minutes. Irradiations localisées des tumeurs, durée 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à la greffe de tumeur par voie sous-cutanée (durée maximale 3 mois), et possiblement une perte de poids des animaux due à aux traitements injectés en intraveineuse (durée transitoire de quelques jours maximum), ainsi que les effets de l'injections intraveineuse elle-même (petite plaie localisée cicatrisant en 24-48 heures). Aucun effet indésirable n'est attendu après les irradiations localisées.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.
Remplacement
Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre les différents facteurs cellulaires au sein d’une tumeur obéissent à des processus complexes impliquant de multiples voies métaboliques et impossibles à reproduire in-vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux a été rationalisé et défini au minimum suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à des calculs de puissance.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la souffrance, l'angoisse et la douleur des animaux, ces derniers seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront hébergés en groupes pour minimiser le stress de l'isolement. L'environnement sera enrichi en permanence (sizzlenests et tunnels ou maisons en carton) afin de diminuer leur mal-être potentiel. Toutes les procédures seront faites sous anesthésie locale. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront appliqués. Un complément alimentaire sera proposé aux souris en cas de perte de poids liée au stress de l'expérimentation.
Choix des espèces
La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en cancérologie translationnelle, en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en essais cliniques chez l'être humain. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour modéliser la maladie humaine.
Évaluation d’un traitement anticancéreux par hyperthermie localisée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée sous la peau ou induite par injection intraveineuse, puis chauffée à 43-45 °C par des nanoparticules activées au laser ou par champ magnétique, sous suivi d'imagerie. Le porteur qualifie les effets secondaires de "très limités" et renvoie l'amélioration de la prise en charge des patients au conditionnel. Il présente le recours à un "organisme entier" comme un "passage obligé" avant tout transfert vers l'humain.
Objectifs
Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire).
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.
Production d’anticorps polyclonaux murins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par prélèvement cardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent cinq injections sous-cutanées d'antigènes pour leur faire produire des anticorps dirigés contre des protéines de microsporidies, parasites de l'abeille et de l'humain. Le porteur signale de rares lésions aux points d'injection et un pelage terne, et présente les anticorps comme des outils "indispensables" et leur usage comme une "nécessité". Il affirme ne recourir aux souris que faute d'anticorps disponibles dans le commerce.
Objectifs
Le projet s'inscrit dans l'étude des interactions hôtes-parasites. Nous étudions les microsporidies, parasites intracellulaires obligatoires apparentés aux champignons, au travers notamment de la mise en place du dialogue moléculaire entre les parasites et leurs hôtes. Plusieurs modèles microsporidiens sont étudiés: 1- l'espèce Nosema ceranae, parasite de l'abeille. 2- l'espèce Anncaliia algerae parasite de l'homme et de l'anophèle. 3- les espèces du genre Encephalitozoon, parasites des mammifères. Dans le cadre de ces études sur les relations hôtes-parasites, nous nous intéressons particulièrement aux mécanismes d'invasion. Pour cela, nous avons besoin de caractériser les protéines microsporidiennes impliquées dans ces mécanismes et les protéines de l'hôte qui sont ciblées par le parasite. Les anticorps sont des outils indispensables pour localiser ces protéines à l'échelle cellulaire, et/ou les co-purifier avec leurs partenaires d'interaction. Nous ciblons plus spécifiquement les protéines parasitaires constituant l'appareil invasif des microsporidies, ainsi que les protéines de surface de la spore (stade de résistance et de dissémination). Ces protéines sont susceptibles d'interragir avec des protéines de la membrane plasmique des cellules hôtes. L'identification des protéines cibles de l'hôte pourra permettre une meilleur compréhension des mécanismes d'invasion, et ainsi permettre d'envisager un bloquage du processus d'invasion. Pour ces analyses, l'utilisation des anticorps est une nécéssité. Ce sont des sondes de choix en raison de leur spécificité et de leur affinité.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes d'invasion très originaux utilisés par les microsporidies pour infecter leur hôte. Ceci peut permettre d'élaborer ensuite des solutions prophylaxiques et/ou thérapeutiques pour bloquer ou limiter l'infection des hôtes par le parasite. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait en effet permettre d'élaborer de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre les microsporidioses, plus particulièrement chez l'abeille, pour laquelle aucune molécule efficace n'est actuellement autorisée.
Procédures
Manipulation des animaux lors de la mise en boîte à induction pour la réalisation de l'anesthésie gazeuse. Injection sous cutanée sur animaux endormis. Ces 2 interventions prennent en moyenne 10 minutes, par animaux. Les animaux seront soumis à 5 injections sur la durée du projet. Anesthésie gazeuse, puis prélèvement cardiaque sur animaux endormis, avant euthanasie de ces derniers. Ces interventions prennent en moyenne 10 minutes par animaux.
Impact sur les animaux
Des lésions aux sites d'injections peuvent apparaître dans de très rare cas sur les animaux. Certains animaux peuvent avoir une modification de leur activité, et de leur aspect physique (pelage terne ou hirsute).
Devenir
A l'issue de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés
Remplacement
Pour pouvoir réaliser des expériences d'immunolocalisation et/ou immunoprécipitation, nous avons besoin de sondes ayant une forte spécificité et une bonne affinité envers nos protéines cibles. Les anticorps permettent de répondre à ces exigences. Nous réalisons cette production en ayant recours à des animaux uniquement si il n'existe pas d'anticorps spécifiques à nos protéines d'interêts disponibles dans le commerce. Nous ciblons en général des protéines spécifiques des agents pathogènes étudiés pour lesquelles aucun anticorps n'est disponible.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux, il est prévu d'immuniser un seul animal par antigène étudié. Si les sérums des animaux immunisés ne sont pas spécifiques de l'antigène étudié, une purification des immunoglobulines sera réalisée. Une deuxième série d'immunisation contre le même antigène sera envisagée si les anticorps ne détectent pas l'antigène même après purification. Si des anticorps produits chez un deuxième animal venaient également à ne pas répondre à l'antigène, l'étude portant sur cet antigène sera définitivement abandonnée.
Raffinement
Afin de limiter les stress des animaux, ceux ci seront acclimatés deux semaines dans l'animalerie avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 par cage avec un enrichissement de leur environnement. La technique d'immunisation par injection sous cutanée sera réalisée sous anesthésie gazeuse légère en boîte à induction au moyen d'air médical et d'isoflurane afin de limiter le stress de l'animal. Une surveillance des animaux, aspect externe, comportement, sera réalisée quotidiennement. Les animaux présentant une modification de comportement ou d'aspect physique seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance. Pour cela, des points limites ont été définis selon plusieurs critères : 1- activité, diminution marquée de la motricité spontanée, des activités de toilettage, ou motrice après stimulation. 2- aspect physique modifié, poil hirsute, pelage terne, prostration, vocalisation. 3- apparition de lésions importantes aux sites d'injections.
Choix des espèces
Deux raisons principales nous ont amené à choisir la souris pour cette production d'anticorps. 1- les anticorps polyclonaux que nous envisageons de produire seront utilisés à des fins de recherche exclusivement pour des expériences d'immunolocalisation ou d'immunoprécipitation nécessitant de faibles volumes de sera. 2- les antigènes proviennent d'espèces éloignées phylogénétiquement de la souris ( parasites eucaryotes unicellulaires) Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines. 2 semaines d'acclimatation à l'animalerie sont prévues avant de manipuler les animaux. Cela nous permet de travailler sur des souris jeunes adultes ( 8 à 10 semaines) qui ont une réponse immune suffisamment développée et pas encore (trop) affectées par des challenges immuns. De plus, la robustesse de la réponse immune diminue avec l'âge après le début de l'âge adulte.
Impaired organ repair after sepsis: role of tissue resident macrophages and recruited monocytes (ORISMO)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum destinée à provoquer une infection généralisée, une ablation partielle de rein et une injection de tamoxifène, pour étudier la réparation du rein après un sepsis. Le porteur indique une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité de plusieurs jours, et annonce un traitement de la douleur au site opératoire. Les objectifs cliniques, de nouvelles thérapeutiques pour les patients survivant à une infection grave, sont formulés au conditionnel, tandis qu'il affirme que seul le modèle animal approche la complexité du sepsis humain.
Objectifs
Evaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale après une infection grave
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
les animaux seront soumis à 3 procédures: - injection intra-péritonéale de tamoxifen (durée 2minutes) - Procédure chirurgicale de ligature ponction caecale (durée 10minutes)- procédure chirurgicale de nephrectomie, clampage du pédicule vasculaire rénal (durée 35minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales peuvent s'accompagnées de douleur au niveau du site opératoire, celle-ci sera systématiquement recherchée et un traitement antalgique sera administré à tous les specimen, possiblement réitéré à plusieurs reprise en cas de persistence de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue de l'infection, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporelle, et regresse en quelque jours après la guérison. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5-7 jours au dela des différentes procédures
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Le sepsis est une maladie complexe et multi-systémique qui associe une intense activation immunitaire, une défaillance circulatoire, des altérations endothéliales à divers degrés. A ce jour, seule l'utilisation de modèles animaux permet d'approcher la complexité du sepsis chez l'homme. Le modèle de ligature ponction caecale que nous utiliserons est largement étudié et le plus utilisé dans la littérature.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, les animaux seront leurs propres contrôles pour un suivi au cours du temps (analyse rein droit puis rein gauche), ceci afin de réduire leur nombre. Le nombre d'animaux par groupe à été déterminé par calcul de puissance necessaire à mettre en évidence une différence significative entre les groupes avec le minimum de specimens.
Raffinement
Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien être des animaux lors des procédures expérimentales les mesures suivantes seront prises: surveillance acccrue toute les 12h dans les 48h suivants la procédure. Administration systématique d'antalgique chez tous les specimen après chirurgie et réadministration à H24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort dans les cas extrèmes (au moyen d'un scoring clinique, qui liste les points limites à partir desquels les antalgiques ou de mise à mort sont prises). Surveillance accrue 2 fois/jours pendant les 3 premiers jours après chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme
Imagerie chez la souris des effets de la dopamine dans la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une toxine leur est injectée dans le cerveau pour détruire les neurones à dopamine et reproduire une lésion de type Parkinson, opération d'environ une heure suivie pour une partie d'une seconde chirurgie d'injection virale. Le porteur indique une perte de poids et des difficultés motrices après la lésion, évaluées par un test du cylindre, et précise que la lésion d'un seul hémisphère laisse l'autre compenser. Les retombées thérapeutiques annoncées restent au conditionnel, et il juge "incontournable" d'utiliser des neurones issus d'animaux modèles.
Objectifs
La dopamine est un neuromodulateur qui joue un rôle essentiel dans le contrôle des fonctions motrices. La dopamine est libérée dans le striatum, où réside une population spécifique de neurones cibles, les neurones épineux striataux. Ces neurones répondent à cette dopamine par le biais de « signaux intracellulaires », qui changent le fonctionnement neuronal. Au cours de la maladie de Parkinson, la libération de dopamine dans le striatum se réduit progressivement. Les neurones épineux s’y adaptent en augmentant leur sensibilité à la dopamine. C’est ce mécanisme d’adaptation à la perte de dopamine que nous souhaitons étudier, pour mieux comprendre comment le corriger dans la situation pathologique. Les biosenseurs optiques permettent de mesurer à l’aide de microscopie optique les effets de la dopamine sur les neurones vivants. Cette approche méthodologique innovante nous permet de décrire avec précision le décours temporel et l’amplitude de cette réponse à la dopamine, et mesurer l’effet de molécules pharmacologiques selon un protocole précisément établi. Cette approche nous permet de comparer les neurones provenant d’animaux modèles de la maladie de Parkinson avec ceux provenant d’animaux sains. Ce type de donnée est essentiel pour développer ensuite des modèles numériques pour la recherche «in silico».
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson résulte de la disparition progressive des neurones qui produisent la dopamine dans le cerveau. Le cerveau s’adapte à cette perte progressive en augmentant la sensibilité à la dopamine des neurones cibles. Mais lorsque la perte atteint environ 90%, cette compensation n’est plus suffisante et le patient montre les signes invalidants de la maladie. Grâce à notre expérimentation, et en comparant la situation parkinsonienne avec des adultes normaux, nous pourrons analyser en détail comment les neurones augmentent leur sensibilité à la dopamine. Ce travail pourrait mettre sur la voie d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour prolonger le plus possible le fonctionnement du système dopaminergique lorsque la maladie est diagnostiquée chez le patient. La maladie de Parkinson est caractérisée par un décours temporel lent, avec la perte inéluctable des neurones dopaminergiques. Toute méthode thérapeutique qui pourrait prolonger de quelques mois ou années le fonctionnement du striatum avant de devoir recourir à la dopathérapie serait très bénéfique pour les patients. Par ailleurs, notre étude révèlera certains mécanismes d’adaptations des neurones à un contexte pathologique, et cette connaissance sera importante dans le contexte scientifique de la compréhension de l’adaptation. Les mécanismes que nous analyserons seront mis en relation avec d’autres connaissances scientifiques liées à l’adaptation neuronale dans le striatum, comme par exemple l’addiction, la schizophrénie, la maladie de Huntington… Enfin, en mesurant avec une grande précision temporelle la réponse cellulaire à la dopamine chez l’animal sain et modèle de la maladie, nos données serviront à construire les modèles numériques qui permettront d’étudier la pathologie in silico. A l’aide de ces modèles numériques, la simulation permettra d’évaluer l’impact qu’aurait telle ou telle intervention thérapeutique sur le fonctionnement du striatum.
Procédures
La chirurgie vise à détruire sélectivement les neurones qui libèrent la dopamine dans une région précise du cerveau. Cette opération est effectuée par l’injection dans cette région du cerveau d’une toxine sélective de ces neurones. Avant cette chirurgie, chaque souris reçoit des injections d’antidouleurs, d’une molécule visant à protéger les neurones qui pourraient être marginalement affectés par la toxine, de sérum physiologique glucosé. L’opération dure environ 1h. Le lendemain, chaque souris reçoit une injection d’antidouleur. Dans les jours suivants, en cas de signe de douleur, l’animal concerné reçoit une injection d’antidouleur. Durant au moins 3 jours après la chirurgie et jusqu’à une reprise de poids, chaque souris reçoit une fois par jour une injection sous-cutanée de sérum physiologique glucosé. Afin d'évaluer la réussite de la lésion des afférences dopaminergiques, le test du cylindre est réalisé pour chaque animal trois semaines après la réalisation de la lésion. L'animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes. Un expérimentateur compte le nombre de fois où l'animal touche le mur du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche. Pour une partie des animaux, une 2e opération consiste à injecter dans une région précise du cerveau un virus pour faire exprimer un biosenseur dans les neurones. Avant cette chirurgie, chaque souris reçoit des injections d’antidouleurs. Cette opération dure environ 1h20. A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
L’injection de la 6-OHDA dans le striatum détruit une partie importante des afférences dopaminergiques. La perte de dopamine, caractéristique de la maladie de Parkinson, réduit la mise en route de programmes moteurs, qui induit une réduction de la mobilité de l’animal, à l’image de ce qu’on observe chez le patient. Il en résulte des difficultés motrices, et donc une perte de poids, les jours suivant la chirurgie. A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans un hémisphère. Ainsi, l’autre hémisphère cérébral compense au bout de quelques jours, de manière à ce que les symptômes moteurs ne soient pas invalidants pour l’animal. Les perturbations motrices sont alors minimes, et éventuellement détectables avec un test de comportemental spécifique. Les animaux contrôles récupèrent plus vite après la chirurgie. Ils ne présentent aucune altération motrice.
Devenir
L'objectif étant d'effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l'issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.
Remplacement
Cette étude vise à étudier les mécanismes d’adaptation qui se mettent en place au cours de la maladie de Parkinson. Dans le contexte réglementaire actuel, la validation de cette hypothèse ne peut être effectuée sur des patients, et doit être précédée par une démonstration pré-clinique sur l'animal. Pour cette étude, il est alors incontournable d'utiliser des neurones provenant d'animaux modèles de la maladie. La dopamine agit sur les neurones dans le cerveau, et l’effet de la dopamine change au cours de la maladie. De nombreux autres processus d’adaptation se produisent si les neurones sont mis en culture, dans un environnement artificiel où manquent la plupart des stimuli présents dans le cerveau. C’est pourquoi, au lieu d’analyser ce phénomène sur des cultures de cellules, il est indispensable d’effectuer les mesures au plus près de la situation pathologique. C’est en cela que notre approche d’imagerie de biosenseurs est puissante, puisqu’elle permet de mesurer la réponse à la dopamine dans un contexte anatomique préservé, qui représente au mieux la pathologie. Une modélisation numérique a été réalisée précédemment au sein du laboratoire et permet de mieux comprendre le fonctionnement du striatum. Toutefois, ce modèle demeure pour le moment incomplet, en particulier pour rendre compte des changements induits par la maladie de Parkinson. Les expérimentations par une approche d’imagerie cellulaire sont alors nécessaires et permettent de compléter le modèle numérique. Par ailleurs, la maladie de Parkinson est causée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques présents dans la substance noire et l’aire tegmentale ventrale. Ces neurones dopaminergiques projettent ensuite dans de nombreuses structurales cérébrales comme le striatum. Au sein du striatum, la dopamine libérée agit sur les récepteurs à la dopamine présents dans de nombreux types cellulaires du striatum. Chaque type de neurones du striatum (neurones épineux striatum et interneurones) s’adapte à la situation en fonction de l’évolution globale du système. Il est indispensable d’étudier ces adaptations, qui ont lieu lors du déficit en dopamine, dans un système complet, rendant l’étude sur des neurones en culture impossible.
Réduction
Ce modèle expérimental de souris est très bien connu et utilisé dans de nombreuses études sur la maladie de Parkinson. Ce modèle permet notamment d’obtenir des résultats transposables à l’être humain. Les animaux seront utilisés pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques. Une étude déjà publiées permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera 1un total de 216 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires; ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.
Raffinement
Condition d’hébergement : animalerie A2, cycle d’éclairage jour-nuit de 12h, température stable 22°C, hygrométrie 55%, nourriture et eau à volonté. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. Le milieu est enrichi par des frisures kraft pour la nidification tout au long de l’hébergement. La lésion des neurones dopaminergiques réalisée uniquement dans un hémisphère induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non-dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit systématiquement une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, il reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. L’animal est pesé. Au-delà des 3 premiers jours, si l’animal présente des signes de douleurs, le niveau de douleur est évalué quantitativement avec l’échelle des expressions faciales de la souris et, si nécessaire, il reçoit une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. Au-delà d’un seuil de douleur, l’animal est euthanasié. Tant que l’animal continue à perdre du poids, l’animal reçoit une injection sous-cutanée quotidienne de sérum physiologique sucré. S'il reprend du poids, il est pesé tous les 3 jours. Si la perte de poids est supérieur à 35 % du poids initial, l’animal est euthanasié. Si besoin, l’animal est placé sur un tapis chauffant. Pendant cette période de récupération, la nourriture est enrichie.
Choix des espèces
Ce modèle animal présente de nombreuses similarités avec la maladie de Parkinson chez l'humain. Il est communément utilisé dans les laboratoires s'intéressant à cette pathologie. Uniquement des mâles de 10 à 12 semaines (au début du protocole) seront utilisés. Cet âge est communément utilisé dans les laboratoires travaillant sur cette pathologie.
Rôle de CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour inactiver le gène CAR, elles sont nourries pendant 40 semaines avec un régime gras induisant obésité et troubles métaboliques, avec trois prélèvements de sang à la joue, un gavage de FITC dextran et des prélèvements à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale. Le porteur décrit une obésité et une intolérance au glucose provoquées "sans souffrance visible", et renvoie les retombées pour les patients, un meilleur ciblage des médicaments, au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de l'axe intestin-foie impose un "organisme entier" et conclut à la "nécessité" de la souris.
Objectifs
Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la pathologie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. De plus, ces maladies touchent particulièrement les hommes. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.
Procédures
Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 40 semaines, à 3 prélèvements de sang à la joue (représentant moins de 10% de leur volume de sang total) espacés chacun de 10 semaines. Les animaux seront soumis également à un jeûne de 6 heures, à un gavage oral de FITC dextran ainsi qu'à un prélèvement d'une goutte de sang d'environ 5 microlitres à la queue pour chaque mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui seront faite 2 fois au cours de l’expérimentation chacune espacée de 14 semaine.
Impact sur les animaux
Les régimes WD et HFD vont induire une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le seul effet indésirable provoqué par le prélèvement à la joue et l'administration orale du FITC dextran est le stress lié à la contention.
Devenir
A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
L’utilisation d’animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires. Voici les résultats d’une étude de pouvoir statistique basée sur nos résultats préliminaires de mesure d'alanine aminotransférase (ALAT marqueur utilisé en clinique pour évaluer les dommages hépatiques) obtenus sur des souris C57bl6/j sous régime CD versus WD. Variation minimale d’intérêt (Δ): ~50%. ALAT initiales CD : 200 U/L, ALAT WD: 324 U/L, écart type moyen 120 U/L. Calcul du nombre d’animaux (n) nécessaire pour un risque α de 5% avec une puissance de 80% n=16. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 16.
Raffinement
Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après chaque prélèvement à la joue et également après chaque mesure de la perméabilité intestinale. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local EMLA 5% sur le bout de la queue avant incision à l’aide d’un scalpel 1heure avant chaque intervention, lors de mesure de la perméabilité intestinale. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication avec une injection intrapéritonéale de Xylazine à 10 mg/kg est effectuée par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, on débute l'anesthésie avec 4% d'isoflurane dans une cage à induction volatile. L'anesthésie est maintenue sous masque pendant le prélèvement. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion de nourriture et d'eau); apparence physique externe; signes cliniques mesurables (ex.: changements du rythme cardiaque, du rythme respiratoire et de la nature de ceux-ci); changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin foie) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6j déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique ces modèles existent uniquement chez la souris. Nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturite physiologique. (7 semaines minimum)
Etude de l’impact de deux protéines dans le développement des maladies rénales inflammatoires et rôle des anticorps de ces maladies.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
452 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 312 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, elles reçoivent des injections d'anticorps et de traitements, des prélèvements d'urine et des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever les reins. Le porteur qualifie l'impact de "modéré" et la maladie rénale de "très légère", ce qui contraste avec les 312 animaux classés en gravité sévère. Il affirme que les conditions de la circulation sanguine ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
L’inflammation chronique induite lors des maladies rénales détruit les vaisseaux qui filtrent le sang et affecte les fonctions rénales. De nouveaux médicaments doivent être trouvés car les traitements actuels sont associés à une forte mortalité. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre l'évolution des maladies inflammatoires rénales pour développer de nouveaux médicaments à l'aide de modèles animaux. Ceux-ci nous permettront d’étudier les cellules et les molécules qui favorisent le développement de l'inflammation dans ces maladies rénales. Notre modèle reproduit une maladie rénale humaine, qui est fatale si elle n'est pas traitée. Nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris exprimant des protéines humaines qui seraient importantes au cours des maladies rénales humaines. Une lignées de souris exprime les récepteurs humains aux anticorps, ce qui en fait un modèle unique pour étudier le rôle des anticorps dans la maladie rénale. La seconde lignée expriment la protéinase 3 (PR3) humaine, une protéine qui pourrait favoriser l'inflammation lors de la maladie rénale. Ces deux protéines humaines semblent impliquées dans le développement de la maladie rénale chez l'Homme, cependant, à ce jour ceci n'a pas été démontré. Notre étude permettra de mieux comprendre le rôle de ces deux protéines dans le développement des maladies rénales inflammatoires humaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples: 1- mieux comprendre le role de deux protéines humaines dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme. 2- cibler les conséquences de l'activité de ces protéines au cours de la maladie pour améliorer la santé des patients. 3- Proposer de nouvelles pistes pour le développement de médicaments plus spécifiques ayant moins d'effets secondaires.
Procédures
Nous effectuerons des prélèvements d'urines à l'aide d'un dispositif de collecte (pendant la nuit) permettant de ne pas changer les animaux d'environnement (adaptation à la cage), et les animaux recevront une injection de liquide contenant les anticorps dans une veine (5 minutes); cette injection se fera au niveau de la queue sur animal vigile. 3 injections dans l'abdomen seront effectuées par semaine, pendant 2 semaines (3 x 2 minutes) pour les traitements pharmacologiques. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront effectués à intervalles réguliers pendant 2 semaines (5 min par prélèvement). Les prélèvements seront effectués sous l'oeil ou au niveau de la mandibule. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de chaque procédure afin d'étudier les organes d'intérêts avec différentes techniques.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental est censé avoir un effet modéré sur le bien-être de l'animal. Cette maladie rénale est très légère, l'animal va uriner des protéines qui devraient être retenu par le rein. Afin d'étudier la maladie, les animaux seront placés dans un dispositif qui permet de collecter les urines pendant la nuit, donc les animaux seront contraints mais grâce au système que nous avons développé, ils ne seront pas isolés socialement. Les cycles d'anesthésie et de prélèvements sanguins pourraient fatiguer les animaux. L'inflammation chronique entraine une légère perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à différents temps et les reins seront prélevés afin d’étudier l’évolution de la maladie rénale et l’effet des différents traitements.
Remplacement
Les pièces opératoires (biopsies rénales) chez l’homme sont limitées en nombre et en nature (petite quantité de tissu, une seule biopsie/patient). De plus, l'étude des cellules, de la fonction des protéines humaines d'intérêt sur l’inflammation et les fonctions rénales nécessite la présence des conditions mécaniques et fluidiques caractéristiques de la circulation. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro. C'est pourquoi notre étude nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux au strict minimum, tout en garantissant l'obtention de résultats fiables, une étude statistique a permis de déterminer que 10-12 animaux/groupe seraient nécessaires pour obtenir une différence statistiquement significative entre 2 groupes.
Raffinement
La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi clinique de 5 jours par semaine avec la mise en place de points limités évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour, jusqu'à ce que les signes de douleur disparraissent. Si les signes de douleurs persistent au-delà de 48 heures, les animaux seront euthanasiés. Une phase de préparation aux collectes d'urine d'une semaine sera effectuée préalablement aux expérimentations afin de réduire le stress des animaux. Nous avons développé un système de collecte d'urine qui permet de garder les animaux dans leur environemment social. Afin de réduire le stress, les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie. Afin de prévenir la douleur, les prélèvements sanguins seront effectués en alternant les sites de prélèvement.
Choix des espèces
Le modèle murin de maladie rénale inflammatoire que nous utiliserons est préférable aux modèles utilisant d'autres animaux dans le cas de ce projet car : -Ce modèle est déjà en place dans notre laboratoire -Les souches génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser sont murines. -Les outils pour étudier ce modèle murin sont très développés. -Ce modèle a servi de support d’étude pour l’exploration des mécanismes inflammatoires impliqués dans le développement de maladies inflammatoires chroniques. Les souris (mâles et femelles) utilisées auront 10-12 semaines : âge adulte, développement des organes arrivé à terme.