Souris

2874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pancréatique sous la peau ou dans le pancréas par chirurgie abdominale, puis un produit radioactif par voie intraveineuse et des séances d'imagerie, pour tester le diagnostic et la radiothérapie du cancer du pancréas. Le porteur indique une surveillance de la croissance tumorale et une mise à mort dès qu'un seuil de volume ou une perte de poids de 20 % est atteint. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèles in vitro et in silico" reproduisant la complexité du milieu tumoral.

Objectifs

L'adénocarcinome ductal pancréatique (PDAC) représente 90% des cancers du pancréas. Il se classe à la 4ème place des causes de mortalité par cancer et la survie à 5 ans est aujourd’hui inférieure à 10%. Ce cancer souffre aujourd’hui de méthodes diagnostiques invasives et d’options thérapeutiques très limitées. Ce projet a pour objectif d’évaluer différents vecteurs biologiques pour la délivrance de radionucléides pour un diagnostic non-invasif et une thérapie ciblée du PDAC. Ce type d’approche a déjà été appliqué par l’équipe dans le cadre du cancer ovarien et fait l’objet de nombreux essais cliniques. Nous évaluerons le ciblage d’un récepteur exprimé à la surface des cellules de PDAC, ayant été validé sur des échantillons de PDAC humains et dont le potentiel clinique pour l’imagerie et la thérapie est établi. Nous souhaitons tester sur des modèles murins de PDAC, différents vecteurs biologiques afin d’évaluer l’impact de la taille du vecteur sur la distribution et la pénétration dans la tumeur. Cette étude permettra d’identifier le vecteur permettant d’identifier les sites tumoraux avec la meilleure définition et de détruire les cellules tumorales avec la plus grande efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet validera au stade préclinique l'utilisation de radiopharmaceutiques pour l'imagerie et la radiothérapie du cancer pancréatique. Le développement d’une telle approche à fort potentiel de transfert clinique pourrait favoriser le diagnostic précoce et la thérapie ciblée des 14’000 patients atteints de PDAC diagnostiqués chaque année en France. Une translation clinique est envisagée à la fin de cette étude avec le soutien d'un industriel (co-financeur du projet).

Procédures

Pour l’ensemble de ce projet, nous avons prévu un nombre de 2874 souris sur une durée de 5 ans. Des souris saines et des souris porteuses de tumeurs pancréatiques seront utilisés. Les tumeurs pancréatiques seront implantés soit sous la peau des souris par une injection sous-cutanée soit directement dans le pancréas de la souris lors d'un chirurgie abdominale sous anesthésie générale. Les animaux recevront par voie intraveineuse un radiopharmaceutique. Une partie des animaux sera alors utilisé pour valider le potentiel diagnostic de l'approche, les animaux seront anesthésiés et imagé par une technique d'imagerie non-invasive. Une deuxième partie des animaux sera utilisé pour quantifier la concentration du radiopharmaceutique dans 15 organes différents. Enfin, la dernière partie des animaux sera utilisé pour valider le potentiel thérapeutique de cette approche. Après l'injection du radiopharmaceutique, la croissance des tumeurs des animaux sera surveillée quotidiennement et plus particulièrement de manière bi-hebdomadaire par une mesure au pied à coulisse ou par une technique d'imagerie non-invasive.

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intrapéritonéale - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à une laparotopie et injection intrapancréatique. Effets indérisables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés selon une méthode adapté pour l'animal (non anxiogène, indolore, perte de connaissance instantanée), pour l'expérimentateur (sans danger, sans risque de choc émotionnel), pour l'expérience (pas de modification des tissus nécessaire à l'expérimentation).

Remplacement

Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer la biodistribution d’un radiopharmaceutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat (analyse statistique préliminaire). L’évaluation de la pharmacologie de radiopharmaceutiques nous contraint à l’utilisation de plusieurs groupes contrôles. Néanmoins, le suivie par une technique d’imagerie non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas de sacrifices à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

Toutes les expériences suivent les recommandations du Gircor (Guide l'évaluation éthique), la "Charte pour une éthique de l'expérimentation animale" et le "Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research "(Workman et al ; British Journal of Cancer ; 2010) . Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Un suivi quotidien des signes de souffrance sera effectué. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance ou perte de poids excessive (>20% du poids initial), ses douleurs ou sa détresse seront soulagées ou supprimées si les signes persistent plus de 24h selon des méthodologies adaptées au maintien du bien-être animal. Quand le volume tumoral dépassera un seuil limite défini pour chaque protocole l'animal sera sacrifié.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthodes alternatives aux expériences envisagées qui reposent sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques in vivo des radiopharmaceutiques. Seule une étude in vivo permettra d’avoir des informations sur la biodistribution en temps réel et l’efficacité thérapeutique des radiopharmaceutiques. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers pancréatiques étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en age adulte.

440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées répétées et jusqu'à sept prélèvements sanguins par semaine, pour tester la tolérance et l'efficacité de molécules visant une maladie de la densité osseuse. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort pour des analyses ex vivo, quarante-quatre animaux surnuméraires pouvant être réutilisés pour une formation aux gestes techniques. Sur le remplacement, il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité́ et la tolérance sur un modèle rongeur (souris) de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse. Dans ce projet, nous allons tester des molécules candidates en développement qui ont montré un potentiel thérapeutique élevé in vitro.

Bénéfices attendus

Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent par des fractures répétées et sévères. On observe chez les patients, de nombreuses complications associées dont des complications respiratoires. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

- Prélèvement de sang sur animal vigile (maximum 1 fois par semaine pour les prélèvements compris entre 20 et 130µL (pour une souris de 25g) jusqu’à 7 fois par semaine maximum pour des micro-prélèvements

Impact sur les animaux

Seuls des animaux WT seront utilisés dans ce projet, sans phénotype dommageable. Cependant, du fait du peu d’information disponible à cette étape du développement sur la tolérance des molécules testées sur des modèles in vivo, des effets indésirables pourraient être observés. Une attention accrue sur les animaux en cours de traitement sera apportée tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids corporel, signes cliniques…

Devenir

Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo. Les animaux surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Des groupes de maximum 8 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans une autre CRO) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le suivi des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (week end & jours fériés inclus) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie sur un modèle animal récapitulant la pathologie. Ce modèle est en cours de « réalisation » et s’agira de souris transgéniques, c’est pourquoi cette espèce WT est utilisé dans ce projet visant à évaluer dans un premier temps la tolérance de molécules sélectionnées au préalable. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 14 à 16 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 14/16 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.

30 souris et 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposés à l'adoption. Ils servent à entraîner le personnel d'animalerie aux injections, aux prélèvements sanguins et à la pose de cathéter, chaque animal étant réutilisé jusqu'à six fois sur trois mois. Le porteur indique que ces manipulations répétées peuvent provoquer un stress, et que les gestes sont réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. L'objet déclaré du projet n'est pas de produire des connaissances mais de maintenir les compétences techniques des soigneurs.

Objectifs

Au cours des différentes procédures, le personnel qualifié de l’animalerie pourra maitriser et s’entrainer régulièrement aux injections, prélèvements de sang et pose de cathéter sur animaux vigiles et/ou anesthésiés couramment pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Cela inclu la préparation de l’animal, l’analgésie, l’anesthésie, l’asepsie, la maîtrise et le contrôle des paramètres physiologique pendant toute la durée de l’intervention et le réveil de l’animal.

Bénéfices attendus

Grâce a cet entrainement, le personnel qualifié de l’animalerie aura les compétences adéquates pour réaliser des administrations et prélèvements de sang principalement demandés par les utilisateurs de l’établissement utilisateur. Le temps d’anesthésie générale sera raccourci avec l’entrainement ce qui limitera le stress chez l’animal.

Procédures

Liste des interventions effectuées sur tous les animaux (rats et souris) à une fréquence de 1 fois toute les 2 semaines sur 3 mois maximum : - Anesthésie par injection intrapéritonéale (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine (64.5/5.4 mg/kg ; 0.15-0.2 ml/100 g de poids vif). - Injection en intra-musculaire et en sous-cutanée de sérum physiologique - Prélèvements de sang dans la veine mandibulaire, la veine sublinguale et la veine caudale (pose de cathéter).

Impact sur les animaux

Les animaux d’entrainement seront utilisés à plusieurs reprises (maximum 6 fois sur une durée de 3 mois) afin de limiter le nombre d’animaux, donc un stress chez l’animal peut être observé.

Devenir

Proposé à l’adoption

Remplacement

Le personnel concerné s’entraine dans un premier temps sur des animaux euthanasiés. Lorsque la technique est acquise sur animal euthanasié, il est nécessaire de travailler sur des animaux anesthésiés afin d’appréhender les éventuelles complications que l’animal vivant peut présenter au cours d’une anesthésie et d’une chirurgie (ex : arrêt respiratoire, hémorragie).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour toute la durée du projet est le nombre minimum nécessaire permettant l’entrainement de 3 personnes : nous prévoyons au maximum 30 rats et 30 souris sur les 5 ans du projet : 60 animaux au maximum sur la totalité du projet.

Raffinement

Les injections via les différentes voies décrites dans ce projet (IP, SC etIM) seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Après l’induction de l’anésthésie, le personnel s’entrainera aux injections dans les minutes qui suivent afin de limiter le stress de l’anesthésie (si l’animal se réveil, il sera replacé dans la boite en plexiglas). Les prélèvements de sang et pose de cathéter seront réalisés sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Pour la pose de cathéter en veine caudale, l’anesthésie sera maintenue sous masque à isoflurane à 2-3%. Pour le prélèvement de sang via la veine mandibulaire et la veine sublinguale, l’anesthésie sera maintenue par injection intrapéritonéal (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine. Les différentes voies d’injections et les différentes voies de prélèvement ne seront pas toutes effectuées sur le même animal. Entrainement à une seule voie de prélèvement de sang par animal. L’animal sera réutilisé que 2 semaines après avoir été manipulé et au maximum 6 fois sur une durée de 3 mois si son état général le permet afin de laisser le temps à l’animal de récupérer et d’éviter un stress trop récurrent. Tout au long de l’expérimentation, les rats/souris seront observés et les paramètres physiologiques contrôlés (température, respiration). Des points limites sont définis dans la partie procédure expérimentale afin de préserver le bien-être des animaux Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée après réception et les rats/souris sont hébergés en groupes sociaux harmonieux, dans un environnement enrichi afin de limiter les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement : tunnels en carton, sizzle pads et bûchettes de peuplier. La taille des aiguilles et des cathéters est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car cette espèce est la plus couramment utilisée dans les différentes procédures pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Adulte : 8-12 semaines, 160-300 g, ce qui permettra de travailler sur des poumons entièrement développé et fonctionnel pour la procédure 1 et sur un système cérébral stable, mature pour la procédure 2.

48 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent sur huit semaines quinze gavages et quinze injections de docétaxel, avec des prélèvements de sang à la face sous contention renforcée. Le porteur décrit le gavage comme "inconfortable et relativement stressant" et prévoit une mise à mort si les nuisances deviennent trop importantes. Il teste un dérivé du cholestérol d'origine algale, dont l'effet antitumoral reste selon lui "peu documenté".

Objectifs

Ce projet fait suite à des travaux préliminaires obtenus avec le 4-Cholestène-3-one, un métabolite du cholestérol produit par le microbiote intestinal et par une algue (Laurencia Papillosa). Notre équipe a montré́ que ce dérivé stéroïde provoquait une diminution de la prolifération des cellules cancéreuses du sein, associée à des effets prometteurs sur le métabolisme lipidique des cellules tumorales. Par ailleurs, le 4-Cholestène-3-one induit l'augmentation du transport cellulaire du cholestérol des cellules tumorales. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer le potentiel anti-tumoral in vivo d’un apport nutritionnel de 4-Cholestène-3-one, associé ou non à un traitement par le docetaxel, dans un modèle de souris nude xénogreffées avec des cellules tumorales mammaires humaines. Pour cette expérimentation, nous utiliserons un total de 48 souris (souris nude = immunodéprimées, adultes femelles de 8 à 10 semaines) correspondant au total à 4 groupes de 12 souris par lot de condition expérimentale. En parallèle, nous envisageons des études biochimiques d’analyse du métabolisme lipidique (sur les tumeurs xénogreffées). Les résultats de ce projet devraient permettre de valider in vivo les effets du 4-Cholestène-3-one observés récemment in vitro et de confirmer l'intérêt potentiel de ce stérol dans le traitement pharmaco-nutritionnelle du cancer du sein.

Bénéfices attendus

Suite aux résultats de ces expérimentations le rôle potentiel du 4-cholestène-3-one, dont l'effet est actuellement peu documenté permettra d'envisager une approche pharmacologique et/ou nutritionnelle de prévention des cancers du sein. De plus, notre projet devrait aussi nous permettre de valider d'éventuels nouveaux biomarqueurs reliant la consommation du 4-cholestène-3-one au devenir des tumeurs. Enfin, en plus de son existence dans les algues, il est maintenant connu que le 4-cholèstene 3-one est un métabolite du microbiote intestinal (Chen et al., 2017), ce qui laisse entrevoir des stratégies possibles d'utilisation de probiotiques afin d'augmenter sa production.

Procédures

Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. L’injection sera réalisée sous anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Les cellules seront injectées au niveau du flanc. Prélèvements sanguins de 100µL au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire. Réalisation de trois prélèvements de sang au niveau de la veine faciale (100µL/souris de 25g) pour réaliser une NFS (numération de la formulation sanguine) et la récupération du sérum pour congélation avant l’analyse biochimique. Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Gavage avec huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One volume de gavage ≤ 250 µl pour une souris de 25g) Injection IP de Docetaxel (15mg/kg) (volume total injecté < 500µl pour une souris de 25g). En bilan, chaque animal recevra : - Une Injection par voie sous cutanée de 100 µL d’une suspension cellulaire. - Deux prélèvements sanguins - Quinze injections intrapéritonéales à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Quinze gavages à raison de deux fois par semaine pendant 8 semaines - Trois séances d'anesthésie genérale gazeuse d'une durée de cinq minutes chacune.

Impact sur les animaux

- L’injection par voie sous-cutanée d’une suspension de cellules MDA MB231 sera réalisée sous anesthésie générale. - Traitement des animaux pendant 8 semaines : 2 fois par semaine : Le gavage des souris sera réalisé par une personne formée et expérimentée (madame Chauvet, technicienne en expérimentation animale). L’émulsion d’huile d'olive enrichie avec 0,03% de 4-C-3-One sera administrée par voie orale via un gavage utilisant une sonde flexible dédiée aux souris. Un volume maximal de 0,25ml/souris de 25g sera respecté. Cette procédure bien qu’inconfortable et relativement stressante ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. Les administrations répétées de Docétaxel (15mg/kg) par voie intrapéritonéales seront-elles aussi réalisées par un personnel compétent et expérimenté. Le volume maximal injecté sera inférieur à 0,3ml pas souris. La cicatrisation au point d’injection entre deux injections successives sera possible vu la cinétique d'administration. - Les 3 prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine faciale à l’aide d’un capillaire dédié. Cette technique sera réalisée sur animal vigile avec une contention renforcée (ne nécessitant pas l'anesthésie gazeuse ni l'ajout d'un anesthésique local). La quantité de sang prélevée peut être gérée par le relâchement de la contention. Une goutte de sang correspond entre 60 et 100µL et ce qui respecte les 20% de la volémie d'une souris de 25g. Cette procédure réalisée très rapidement ne devrait pas engendrer de douleur chez les animaux. - Mesure de la taille des tumeurs à l'aide d'un pied à coulisse électronique sous une courte anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v sous un débit d’air de 1 L/min (à 4% pour l’induction et 2% pour le maintien). Cela ne devrait donc pas générer de douleur /nuisance chez les souris. - Les nuisances attendues chez l'animal seront donc éventuellement les effets secondaires liés au traitement antitumoral testé. Une observation attentive quotidienne du comportement général des animaux, de leur mobilité ainsi que de leur réactivité permettra de détecter les animaux en souffrance du fait des injections réalisées ou du développement des masses tumorales au niveau du flanc. Un ensemble de paramètres sera mesuré pour obtenir une estimation relativement précise de l’impact de la douleur. Une mise à mort de l'animal sera réalisée si les nuisances s'avèrent trop importantes.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort car des expériences d'analyses biologiques, biochimiques et de toxicologiques seront ensuite réalisées sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

La mise en évidence du "potentiel" antitumoral du 4-cholestène-3-one a été évalué in vitro sur lignées tumorales cellulaires issues de tumeurs mammaires (MCF-7, MDA-MB231). Pour confirmer les effets observés in vitro, un passage in vivo s'avère nécessaire afin de pouvoir étudier l'effet antitumoral du 4-cholestène-3-one. Le cancer étant une pathologie complexe, il n’existe pas à l’heure actuelle, de méthodes alternatives permettant d’éviter ou remplacer l’utilisation des animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre nécessaire d’animaux contrôles tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Les tests de Mann Whitney/Student et Kruskal Wallis/ANOVA seront utilisés pour la comparaison statistique entre lots. Pour calculer le nombre total d’animaux et le nombre d’animaux par lot, nous avons utilisé le logiciel Gpower et la méthode basée sur l’analyse de la puissance. Nous avons considéré les paramètres suivants : Alpha : 0.05 ; Puissance : 80 ; effet de la taille de l'échantillon : 0.5 (moyen) Le nombre minimal d’animaux nécessaire est de 48 souris souris, 12 souris par lot. Ce nombre d’animaux est un nombre minimal pour la validation statistique des résultats (Kruskal- Wallis One-Way ANOVA) et il tient compte d’un taux de prise de greffe > à 90%. Par ailleurs, ce nombre de souris par lot permet d’obtenir suffisamment de matériel biologique pour les analyses biochimique et histologique ultérieures, nécessaires à la caractérisation de l’activité anti-tumorale de la molécule testée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Elles seront réparties à raison de 4 à 5 souris par cage avec un enrichissement physique (copeaux de litière, frisottis) permettant aux souris de satisfaire leurs besoins comportementaux (exploration de leur environnement, confection de nid…). Si des cas de bagarre apparaissent on veillera à augmenter l'enrichissement avec des abris, tunnels supplémentaires dans la cage. Les litières seront changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. L'expérience a été́ conçue pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures : Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale après anesthésie par inhalation d’un mélange air isoflurane v/v dans une cage à induction (à 4% sous un débit d’air de 1 L/min).

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons des souris balbc nudes femelles. Les cellules MCF-7 et MDA MB 231 étant des lignées tumorales humaines, il est nécessaire d’utiliser de souris immunodéficientes afin de permettre la prise de greffe. Il s'agit donc de l'espèce classique pour cette première étape de l'évaluation pharmacologique antitumorale in vivo d'une molécule. Des adultes de 8 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est relativement homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales répétées, jusqu'à seize semaines pour certaines, et un régime provoquant une accumulation de graisses dans le foie, pour tester un inhibiteur de l'autophagie contre la toxicité hépatique. Le porteur indique que l'induction de la toxicité peut provoquer douleurs abdominales, fatigue et diarrhée. Il juge "indispensable" le recours à l'animal vivant, la complexité de la toxicité hépatique étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

L’autophagie (AP) est un processus physiologique qui régule l’homéostasie cellulaire. L’AP est aussi un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies neurodégéneratives et cancers. On connaît les effets bénéfiques de l'augmentation du flux autophagique dans différentes pathologies, notamment les maladies du foie. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de ce processus dans la prévention et le traitement de la toxicité hépatique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la toxicité hépatique, qui entraîne un déclin progressif de la fonction hépatique, la fibrose, la cirrhose et souvent un carcinome hépatocellulaire.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des injections intra-péritonéales (i.p). Les injections i.p. ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile par du personnel formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Selon les différentes procédures du projet : (i) les animaux seront euthanasiés 6h et/ou 24h après le traitement (3/4 injections totales); (ii) les injections hebdomadaires dureront 16 semaines ; (iii) les animaux seront soumis à un régime alimentaire (de 4 semaines) permettant l'accumulation de triglycérides et cholestérol, mais qui n'est pas un régime alimentaire obésogène. Les traitements i.p. seront journaliers jusqu’à 6 semaines. La durée de chaque injection sous-cutanée et intra-péritonéale est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet prévoient seulement des injections intra-péritonéales. Les injections intra-péritonéales ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile. Des douleurs abdominales, une fatigue, une diarrhée peuvent survenir lors des procédures d’induction de la toxicité hépatique.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la toxicité hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure pour poser une fenêtre ou un implant d'imagerie, puis des séances d'imagerie cérébrale sous contention, non pour produire des connaissances mais pour former des chercheurs à ces techniques. Le porteur signale des douleurs postopératoires et le stress lié au maintien sous le microscope. Il avance que cette formation réduira le nombre d'animaux utilisés plus tard par les stagiaires dans leurs laboratoires.

Objectifs

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes de mesure d’activités neuronales impliquées dans la codification des informations sensorielles. L’imagerie biphotonique ainsi que l’imagerie calcique sont deux techniques qui permettent d’observer et mesurer l’activité de neurones en temps réel. Grâce à ces techniques nous pouvons étudier le rôle que jouent différentes populations de neurones dans l’apprentissage et l'exécution d’une tâche comportementale. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

- Le groupe A suivra: une chirurgie stéréotaxique (1 heure) pour implanter une fenêtre crânienne qui permet de mettre en place un couvercle transparent au-dessus d’une région corticale d’intérêt. Grâce à cette fenêtre certains types de neurones du cerveau sont visibles en microcopie. Deux semaines plus tard, les animaux seront habitués à rester sur le microscope bi photonique ensuite l’activité neuronale sera imagée chez les animaux éveillés. Les séances d’imagerie auront une durée de 30 minutes et elles seront faites 1 fois par jour pendant 5 jours. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem. - Le groupe B suivra: Une chirurgie stéréotaxique (1 heure) qui permet de rapporter dans certains types de neurones une molécule fluorescente visible en microcopie et d’installer un implant. Deux semaines plus tard, les souris seront connectées au niveau de la fibre optique vers un système d’enregistrement de l’activité neuronale et leur comportement spontané sera évalué. Chaque séance aura une durée de 20 minutes et chaque souris suivra 3 séances. Pendant une des séances, les souris recevront une injection intrapéritonéal (1minute) contenant, soit une molécule qui permet d’activer les neurones dopaminergiques soit de la saline. A la fin de la dernière séance - Le groupe C suivra : Une chirurgie stéréotaxique (1 heure) qui permet d’implanter un système d’imagerie. Deux semaines plus tard, les séances d’imagerie seront réalisées pendant la procédure comportementale. Chaque séance aura une durée de 20 minutes et chaque souris suivra 3 séances ( une séance par jour). A la fin de la dernière séance , les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem.

Impact sur les animaux

- Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post opératoires, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration des implants crâniens - Nuisances liées à la connexion des animaux aux niveau du système de fixation, fibre optique ou appareillage d’imagerie calcique : stress de la contrainte du maintien sous l’objectif du microscope auquel l’animal doit s’habituer - Douleur légère liée aux différents injections intrapéritonéales

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs. Nous utiliserons un animal (C57BL6) par étudiant et par instructeur soit 30 souris/an. Avant le début de la formation, toutes les souris transgéniques suivront les chirurgies stéréotaxiques. Les séances de comportement, d’imagerie et d’électrophysiologie seront réalisées pendant la formation. - Souris DAT-Cre: Le taux de réussite de la chirurgie ( expression correcte du virus et fibre optique fonctionnelle ) est de 60%. Pour pouvoir évaluer l'effet de l’agoniste dopaminergique nous avons besoin d'au minimum 3 souris par groupe. Nous avons besoin donc de 10 souris DAT-Cre par formation/an. - Souris C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6f)GP5.17Dkim: a. Imagerie 2-photon sur animal éveillé: Le taux de réussite de la chirurgie ( fenêtre crânienne de bonne qualité pour la microscopie) est de 25%. Une souris sur 5 ne s’habitue pas au système de fixation. Pour pouvoir analyser les images provenant d'au minimum 4 souris, nous devons utiliser 20 souris par formation/an. b. imagerie calcique avec des miniscopes : Le taux de réussite de la chirurgie est de 25-30%. Une souris sur 5 ne s’habitue nt pas à la connexion au niveau de la miniature au crâne. Pour pouvoir analyser les images provenant d'au minimum 4 souris, nous devons utiliser 20 souris par formation/an.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirugicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score qui le justifie, une seconde injection d'un médicament anti-inflammatoire sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation dépasse un certain stade de gravité l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale. Dans des cas très rares, les implants (fibre optique, appareillage d'imagerie calcique, un système de fixation) peuvent se détacher du crâne. Dans cette situation, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.

Procédures

• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.

Choix des espèces

Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.