Souris
Suivi de la biodistribution et de la toxicité de liposomes chez la souris gestante
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue avec leurs fœtus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection de liposomes dans la veine de la queue sous anesthésie, suivie d'une imagerie, le porteur signalant que le protocole peut provoquer des fausses couches chez la femelle gestante. Mères et fœtus sont ensuite tués pour doser les nanoparticules dans leurs tissus. Le projet vise à cibler le placenta pour des médicaments de la grossesse, les explants de placenta humain étant jugés insuffisants.
Objectifs
Le développement de médicaments lors de la grossesse est complexe car il faut à la fois éviter le passage des médicaments du côté du bébé et les concentrer au niveau du placenta pour limiter les effets secondaires chez la Mère. Ainsi ce projet s’articule autour du développement de nanomédicaments, les liposomes qui sont fabriqués pour aller spécifiquement dans le placenta.
Bénéfices attendus
Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques disponibles pour la femme enceinte.
Procédures
Anesthésie sous isoflurane (5 min) (4% induction, 1.2% entretien dans un mélange oxygène/air 70/30), injection dans la veine (1min) de la queue, imagerie (5min) et ceci représente une durée totale d’environ 11 min.
Impact sur les animaux
La souris gestante étant plus fragile que la souris non gestante, les différentes étapes du protocole pourraient entraîner des fausses couches.
Devenir
A la fin de la procédure les souris et les fœtus seront mis à mort dans le but de prélever les tissus et de procéder à une quantification ex vivo des nanoparticules aussi bien chez la mère que chez le fœtus.
Remplacement
Des tests sur explants isolés de placenta humain ont permis de sélectionner les formulations les plus intéressantes, toutefois la complexité des échanges materno-fœtaux et l’avancée de nos études nécessitent l’évaluation des formulations optimisées chez la souris gestante.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés in fine dans cette étude, parmi 5 formulations mises au point et 8 peptides identifiés seul 1 formulation et 3 peptides après étude in vitro sur lignée cellulaire et ex vivo sur explant placentaire soit une réduction d’un nombre de souris de 1480 souris. De plus, nous utilisons une technique d’imagerie optique qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal et qui évite de sacrifier l'animal à chaque temps de cinétique et donc in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce cas pour une formulation et un peptide associé nous utilisons 20 souris (lot A et B) et non120 si nous voulions obtenir les données cinétiques pour 8 temps post injection .
Raffinement
L’administration dans la veine caudale sera réalisée sous anesthésie locale. En effet une crème EMLA comme anesthésique local à base de lidocaïne et de prilocaïne sera appliquée sur la zone d’injection afin de réduire la douleur de l’animal. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane (4% induction, 1.2% entretien dans un mélange oxygène/air 70/30). La souris est placée sur un tapis thermostaté pendant l’imagerie. De plus elle sera placée dans une cage thermostatée et oxygénée le temps du réveil et de la récupération post examen d’imagerie. Des points limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien être tout le long de l’étude ont été établis. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînerait l'euthanasie anticipée de l'animal.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer la biodistribution de Liposomes, nanomédicaments, après injection intraveineuse. La souris est le modèle le plus approprié par sa physiologie proche de l’homme (taux d’homologie 90%) ainsi que la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris swiss adultes gestantes entre J12.5 et J15.5 de gestation. Cette chronologie de gestation est choisie car c’est le moment où le placenta est le mieux développé et c’est un moment encore assez éloigné pour ne pas risquer un accouchement prématuré.
**Importance du foie et du tissu adipeux dans le contrôle du métabolisme énergétique : contribution de cibles moléculaires et de signalisation dans le maintien de l’homéostasie hépatique**
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adénovirus sous anesthésie, subissent des changements de régime et des jeûnes répétés dont un jeûne intermittent de deux semaines, des injections d'insuline et une incision de la queue pour prélèvements sanguins. Cette recherche fondamentale sur le métabolisme du glucose, le diabète et la stéatose hépatique mobilise un effectif de plus de deux mille cinq cents animaux. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée.
Objectifs
Des perturbations du métabolisme du glucose pourraient jouer un rôle important dans des pathologies humaines comme le diabète de type 2. Ce projet nous conduit à nous focaliser sur deux cibles moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer les contributions de ces deux cibles moléculaires et des protéines produites dépendantes de ces cibles et pouvant signalées dans d’autres tissus, au maintien des fonctions hépatiques et de l’homéostasie glycémique et lipidique.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de l'insulinorésistance et de la stéatose hépatique. Très peu de molécules pharmacologiques sont développés pour réverser la stéatose hépatique. Nos recherches en modulant les acteurs moleculaires clefs de la voie d'utilisation du glucose
Procédures
Une partie des animaux subira une injection veineuse d'adenovirus sous anesthésie, cette injection durera par voie veineuse sera de 30 secondes maximum. Des changements de régime alimentaire seront réalisés avec des durées de 4 à 20 semaines en fonction des régimes. Nous réaliserons des tests physiologiques sur une durée de 2 heures. Pour cela après injection d'insuline ou gavage de glucose, des prélèvements de sang sur les animaux vigiles au niveau codal. Ces prélèvements se feront par une incision légère de la queue qui sera réalisée une seule fois et des prélèvements seront réalisés 7 fois pendant les 2 heures suivant cette incision. Nous réaliserons une injection d’insuline par voie intra-péritonéale. Les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures puis seront injectées d’insuline, injection qui durera 30 secondes maximum. Nous ferons une manipulation nutritionnelle sur nos souris. Pour cela, les souris seront soit mises à jeun 24h soit mises à jeun puis renourries pendant 18h ou on ajoutera à l’alimentation des souris de l’eau glucosée pendant 24h. pour les manipulations nutritionnelles, les souris subiront un jeûne intermittent pendant 2 semaines, ainsi il y aura un cycle de jeûne et d’alimentation toutes les 24h Les souris seront anesthésiées par une injection par voie intrapéritonéale en fin d’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
Pour les procédures impliquant des injections des adénovirus, l’injection par voie veineuse d’adénovirus sous anesthésie ne cause pas de douleur. Pour les procédures impliquant un changement de régime, parmi les effets indésirables, il peut y avoir une perte de poids. Pour les procédures impliquant des injections d’insuline, il peut y avoir des risques d’hypoglycémie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et le sang pour des analyses biochimiques et moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée ainsi que le développement de maladies tels que la NAFLD. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine (diabète de type 2). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.
Réduction
Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. **Pour ce projet, nous utiliserons 2530 souris réparties sur 9 procédures. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe, La taille des effectifs ayant été établie grâce à un calcul de puissance pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions.
Raffinement
** Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Pour respecter le principe des 3R, les mêmes souris seront soumises à différents tests physiologiques et métaboliques permettant de limiter le nombre de groupes expérimentaux. Pour la procédure impliquant des injections en intraveineuse, l’injection se faisant sur animal anesthésié à l’isoflurane (1-2% isoflurane dans 100% O2), cette procédure n’engendre pas de de douleur. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Pour les procédures impliquant un changement de statut de régime alimentaire, Le changement de régime pouvant induire une variation de poids, nous suivons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. Toutefois, les souris seront observées par les expérimentateurs pendant toute la durée du protocole puis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Enfin, nous surveillerons l’apparition des signes systémiques de souffrance suivant: 1) Apparence physique :0 : Normal 1 : Poils légèrement ébouriffés 2 : Poils ébouriffés, dos « vouté », yeux plissés 2) Apathie 0 : activité normale 1 : activité réduite 3 : activité nulle, apathie 3)Perte de poids 0 : Normale 1 :Perte de poids> 10% 2 :Perte de poids > 10% et 20% Pour une valeur totale égale à : 2 : l’animal sera suivi 2 fois par semaine et nous tenterons une réhydratation par injection de serum physiologique. Si le score maximal de 3 de l'un des critères est atteint ou si le score global atteint 6 l'animal sera mis à mort sur décision du porteur du projet**
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques (knock-out) permet de mieux comprendre le rôle de différents gènes dans le développement de s maladies que nous étudions et que ce sont le diabète et la stéatose hépatique. A terme cela permettra de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons des souris adultes à partir de 8 semaines chez lesquelles la régulation de l'homéostasie glucidique est fonctionnelle.
Nouvelle stratégie pharmacologique pour la prévention et le traitement de la cardiotoxicité induite par des chimiothérapies.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie provoquant une cardiotoxicité, puis sont suivies par échocardiographie sous anesthésie, prélèvements sanguins et mesures de pression artérielle, avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une cardiotoxicité le plus souvent asymptomatique, avec de rares arythmies graves, et vise une stratégie pharmacologique de prévention. Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "indispensable" faute de reproduire cette toxicité in vitro.
Objectifs
Certains traitements anticancéreux ont des effets cardio-toxiques et exposent les patients au risque d'insuffisance cardiaque. Nous avons démontré, in vitro et in vivo, que l’inhibition d’une protéine , impliquée dans un réflexe primitif de la faim, induit l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter la cardio-toxicité chimio-induite chez des modèles murins appropriés.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie, qui est un facteur de risque chez les patients oncologique et qui représente un défi important pour la santé publique.
Procédures
Les injections intra-péritonéales (i.p.) ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile. La durée des injections i.p. est de quelques secondes. Les souris seront isolées pour un maximum de 2 jours quand placées dans les cages calorimétriques. Les animaux seront soumis à une évaluation d’échocardiographie (3 ou 4 fois), un prélèvement sanguin (4 fois), une mesure de la pression artérielle (4 fois). La mesure de la pression artérielle (environ 20 min par mesure) et le prélèvement sanguin (quelques secondes par prélèvement) seront effectués sur animal vigile. L’examen d’échocardiographie sera effectué sur animal anesthésié (30 min par examen). L'échocardiographie et la mesure de la pression artérielle sont les méthodes de diagnostic les plus utilisées en cardiologie chez l’homme. Ces pratiques de routine ne sont pas invasives.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par l’induction de la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie. La cardiotoxicité aigue qui est induite dans ce protocole est la plupart du temps asymptomatique (altérations transitoires de la fonction systolique et des arythmies). Des manifestations symptomatiques graves mais rares (moins de 1%) peuvent apparaître sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, et d'une insuffisance cardiaque aigüe.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie vu sa complexité.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2016 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de tapis chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines car l'âge a un impact sur la production neuronale de neurotransmetteurs et du métabolisme.
Evaluation de l’efficacité anti-tumorale de petites molécules ciblant une protéine de survie des cellules cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
1 178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses dans le flanc, les mamelles ou le sang, puis une injection quotidienne de molécules dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant trois à six semaines, avec prélèvements sanguins réguliers. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une paralysie des membres et une perte de poids, et que les injections répétées causent une douleur au site. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour étudier l'effet des traitements sur un organisme entier.
Objectifs
Les cellules cancéreuses endurent de nombreux stress et dommages qui menacent leur survie. Pour résister à la mort cellulaire, elles inhibent les mécanismes de mort, augmentent l'action des facteurs de survie ou effectuent ces deux actions simultanément. Une des protéines de survie récemment identifiées est exprimée très fortement dans la plupart des cellules cancéreuses, leur conférant une résistance aux agents anticancéreux. Cette protéine pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante. Nous avons développé et optimisé une série de petites molécules capables d’empêcher l’action protectrice de cette protéine in vitro. Il est maintenant nécessaire de poursuivre l’évaluation de ces petites molécules en tant qu’agents thérapeutiques à l’aide de modèles animaux de différents cancers (cancer du sang, de la peau, du sein, du poumon notamment).
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre l’évaluation de petites molécules ayant un potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers. En raison de la stratégie originale mise en place pour développer ces molécules et sur leur mode d’action, les bénéfices de ce projet à long terme seraient de proposer une alternative thérapeutique efficace et mieux tolérée par les patients les plus fragiles car ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, nous vérifierons que les petites molécules ayant un potentiel thérapeutique n’ont pas d’effet toxique. Pour cela nous injecterons la petite molécule dans l’abdomen de la souris femelle une seule fois ou une fois par jour pendant 5 jours (injection d’une durée de 10 secondes réalisée sur souris éveillée) et les souris seront surveillées pendant 2 semaines avant d’être euthanasiées. Puis nous vérifierons que la durée de vie dans l’organisme est suffisant pour exercer leurs actions. Pour cela, les petites molécules seront injectées dans la veine de la queue (souris éveillée, durée de l’injection 30 secondes). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps (entre 10 min et 3h après l'injection des petites molécules; soit 5 prélèvements au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes). Le potentiel thérapeutique de ces petites molécules sera évalué sur différents modèles de cancer. Pour cela, nous mettrons dans un premier temps en place ces modèles en injectant les cellules cancéreuses soit par voie intra-veineuse (dans la veine de la queue de souris éveillée, d’une durée de 30 secondes) soit sous la peau au niveau du flanc (injection sur souris anesthésiée, d’une durée d’une minute), soit dans les mamelles (injection sur souris anesthésiée, d’une durée d’une minute). Quel que soit le modèle utilisé, le protocole thérapeutique consistera à injecter les petites molécules dans l’abdomen des souris éveillées 5 jours par semaine pendant 3 à 6 semaines. Le suivi impliquera des prélèvements de sang hebdomadaire sur toute la durée du protocole (sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes) et de la mesure de la tumeur lorsque celle-ci est apparente (mesure au pied à coulisse sur souris éveillée, d’une durée de 30 secondes).
Impact sur les animaux
L’injection des petites molécules thérapeutiques dans l'abdomen peut entrainer une douleur au site d’injection en particulier lorsque celle-ci sera répétée dans le temps (1 fois par jour, 5 jours/semaine, pendant 3 à 6 semaines). Comme tous les médicaments qui doivent entrainer la mort de certaines cellules, ils sont susceptibles d’avoir des effets indésirables pour le bien-être (perte de poids, diarrhée). La mise en place des différents modèles de cancer implique des injections. Dans le cas des injections sous la peau au niveau du flanc ou des mamelles, nous pourrons observer dans le temps un inconfort lié à la croissance de la tumeur (gène dans la locomotion des souris). L’injection dans le sang des cellules tumorales pourra également conduire à une douleur de l’animal au cours du temps (développement de la pathologie) avec apparition d’une paralysie des membres inférieurs notamment et/ou perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront générer un stress transitoire de l’animal lié à sa manipulation.
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure afin d’analyser de manière la plus exhaustive possible l’effet thérapeutiques des petites molécules (prélèvement du sang, des organes et des tissus cancéreux).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère pour laquelle de nombreux modèles de cancer sont déjà bien caractérisés. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes car les modèles de cancers sont bien établis dans ces conditions.
Optimisation du traitement de l’hémophilie en augmentant la synthèse de protéine hFIX par térapie génique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, des souris hémophiles, reçoit des candidats de thérapie génique injectés dans la veine de la queue, suivis de cinq prélèvements sanguins et de tests de coagulation, avant mise à mort par dislocation cervicale et analyse du foie. Le porteur teste quinze candidats sur des souris saines pour n'en retenir que trois, afin de limiter le recours aux souris malades. Il affirme que les cellules en culture ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme complet".
Objectifs
Dans ce projet, nous avons mis au point différents candidats de traitement de l'hémophilie (maladie due à un déficit de la protéine hFIX, entrainant des difficultés de cicatrisation et donc de saignement important, lors de blessures). Ce traitement permet de relancer l’expression et la synthèse de la protéine hFIX ce qui améliorera la cicatrisation des patients. Différents candidats ont été testé sur des cellules en cultures ; ils permettent tous de produire la protéine hFIX. Nous avons besoin de tester nos 15 meilleurs candidats sur des souris saines, dans un premier temps, afin de s’assurer que ces traitements fonctionnent également sur un organisme entier, sans entrainer de réponse immunitaire. Cette étape permettra de sélectionner les 3 meilleurs candidats et donc de limiter l’utilisation de souris hémophiles. Ces deux premières étapes donneront une réponse rapide quant à l’efficacité de nos traitements car nous étudierons les souris 1 mois seulement après administration du traitement. Dans un troisième temps, le meilleur candidat sera injecté dans des souris hémophile pour étudier sa capacité à traiter la maladie sur une durée de 6 mois.
Bénéfices attendus
Pour les patients : Amélioration du traitement de l'hémophilie par thérapie génique / Réduction des doses injectées / Diminution ds effets secondaires. Pour la recherche : Technologie applicable à tous traitement par thérapie génique. Pour les industrie pharmaceutiques : Réduction des doses injectées / Réductions des couts de production.
Procédures
Injection du traitement dans a veine de la queue / Frequence 1X / Durée 30 secondes. Prélevement sanguin / Fréquence J1, J7, J14, J21, J28 / Nombre 5X / Durée 30 secondes. Test de formation des caillots / Fréquence 1 à 2X / Nombre 1 à 2X / Durée 30 minutes. Sacrifice (dislocation cervicale) / Fréquence 1X / Durée 10 secondes.
Impact sur les animaux
Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris hémophile : diminution des problèmes liés à la maladie (réduction du temps de saignement suite aux bagares etc.) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Test de formation des caillots : Stress lié à la manipulation + douleur liée à la piqure. Eutanasie : Stress lié à la manipulation. Souris hémophile : pas de douleur quotidienne lié à la maladie / Douleurs liées aux saignements lors de bagarres, etc.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude car nous devons réaliser des analyses sur différents organes, notamment le foie.
Remplacement
Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi nos traitements candidats sur des cellules en culture. L'utilisation de cellules nous a permis de réaliser un premier tri rapide en nous basant sur du oui/non (le traitement est-il capable de faire créer par les cellules du foie la protéine hFIX manquante chez les patients hémophiles). Néanmoins, cette approche est limitante car elle ne représente pas la complexité d'un organisme complet (avec cette approche nous faisons produire la protéine hFIX par le foie puis elle est ensuite envoyé dans les vaisseaux sanguins pour approvisionner tous les autres tissus et organes) et ses possibles réponses immunitaires contre le traitement. C'est pourquoi nous devons travailler sur des souris pour mieux caractériser nos traitements.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 258 souris). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la première étape n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes. De même, si le nombre de candidats efficace est inférieur à ce dont nous avons prévu, moins de souris seront utilisées. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (210 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Les souris seront maintenues en élevage en nombre réduit par cage afin de limiter les bagarres entre souris, pouvant entrainer des blessures et saignement (4 souris par cages). Les souris seront observées régulièrement : les souris dominantes seront isolées, les souris blessées seront soignées (plaies désinfectées et cautérisées) pour éviter les hémorragies. Si une hémorragie ne peut pas être stoppée, la souris sera euthanasiée afin d'éviter des souffrances inutiles. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisée.
Choix des espèces
De nombreux animaux hémophiles existent (souris, mouton, chien, etc.) ces animaux présentent une similarité avec la maladie de l'hémophilie humaines, avec une activité de coagulation réduite et des hémorragies spontanées dans les tissus des coussinets plantaires et des hémorragies sous-cutanées. Dans ce projet, nous souhaitons tester nos traitements sur des souris ce qui permettra de faciliter la génération des animaux (6/10 petits par portée pour des souris contre 1 pour les moutons), de faciliter l'élevage des animaux (en cage plutôt que dans un champs), de réduire les couts de gestion, etc. Les souris hémophiles sont viables, fertiles et de taille normale. Nous utiliserons des souris mâles adultes car c'est une maladie qui touche uniquement les males (souris ou humains). Les souris seront injectées entre 6 et 8 semaines de vie, ce qui correspond à un âge adulte pour la souris, et nous permettra de comparer avec l’âge des adultes que nous souhaitons traiter.
Evaluation des effets bénéfiques de nouveaux agonistes non peptidiques du récepteur à l’ocytocine dans un modèle murin d’autisme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'autisme, elles reçoivent une injection ou un gavage d'agonistes du récepteur à l'ocytocine, puis subissent des tests comportementaux avant d'être mises à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur cherche à restaurer la sociabilité et affirme que la pathologie "ne peut être modélisée qu'au niveau de l'animal entier", faute de marqueur biologique. Les bénéfices, de nouveaux traitements de l'autisme, sont énoncés comme une visée du projet.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des pathologies neurodéveloppementales complexes, caractérisées par un déficit social et des comportements stéréotypés, et dont l’incidence moyenne atteint près de 1% d’après de récentes études à grande échelle. Il n’existe à l’heure actuelle aucun médicament capable de soulager les symptômes de l’autisme. Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules, agissant sur le récepteur à l’ocytocine, pour traiter l’autisme, et en particulier les déficits d’interaction sociale. L’utilisation d’ocytocine est une piste prometteuse pour soulager les TSA. Malheureusement, il s’agit d’un peptide qui possède une faible biodisponibilité qui ne persiste que peu de temps dans les organismes traités, ce qui rend son usage thérapeutique difficile. Nous avons publié des résultats montrant qu’un agoniste non peptidique du récepteur à l’ocytocine est capable de restaurer la sociabilité dans un modèle murin d’autisme. Cette molécule a l’avantage de persister plus de temps dans les organismes. Une deuxième génération d’agonistes a été synthétisée par nos collaborateurs, plus efficace encore sur le récepteur à l’ocytocine. Dans ce projet, nous allons caractériser 3 de ses nouveaux composés dans un modèle d’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer de nouveaux agonistes des récepteurs à l’ocytocine pour soulager les troubles autistiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique qui se fera soit par voie intrapéritonéale, soit par voie orale. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux éthologiques non invasifs. Les interventions sur les animaux ne dureront pas plus de 24h.
Impact sur les animaux
L’ensemble de nos animaux seront soumis au stress de la manipulation et de contention nécessaire à la réalisation des administrations intrapéritonéal et per-os. Des études préalables ont montré que les composés que nous allons administrer ne sont pas toxique pour l’animal et n’ont pas montré d’effet secondaire, mais on ne peut pas exclure un phénomène inflammatoire au niveau du site d’injection (administration intrapéritonéale). Lors des administrations per-os, les animaux subiront l’inconfort du gavage
Devenir
A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis à mort pour des expériences ex-vivo ultérieur
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe de 4, en mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées . Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l'age adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux fixé
Evaluation de la propriété analgésique de la mycolactone dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une incision plantaire sous anesthésie, puis une douleur post-opératoire volontairement laissée sans analgésique chez les groupes témoins, le porteur indiquant qu'un traitement "irait à l'encontre de l'étude". Des tests plantaires répétés jusqu'à sept fois évaluent la sensibilité, et les pattes sont prélevées à la mise à mort, 48 heures au plus après l'incision. Le projet teste la mycolactone, toxine bactérienne, comme analgésique local, et le porteur affirme ne pas pouvoir se passer d'animaux.
Objectifs
Notre équipe travaille sur les propriétés anti-douleurs de la mycolactone, toxine produite par la mycobactérie M. ulcerans. En effet, les personnes atteintes d’une infection à M. ulcerans présentent de vastes ulcérations cutanées qui ne sont pas douloureuses. Dans ce contexte, nous avons démontré grâce à des tests cellulaires que la mycolactone induisait une diminution de la sensibilité locale pendant plus de 24h après son inoculation. Cela nous a également permis de disséquer son mécanisme d’action. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique (anti-douleur) de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que chez des souris ne présentant pas de douleur. Cela a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés anti-douleur supérieures à la morphine. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur post-opératoire.
Bénéfices attendus
Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés anti-douleur lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des souris naïves (chez lesquelles aucune douleur n’a été induite). Compte tenu de ces résultats, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.
Procédures
Les animaux seront répartis en 4 groupes de 180 animaux chacun (soit 720 animaux au total) : - avec incision traité par la mycolactone - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence (buprénorphine). Incision plantaire, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse. La durée de la procédure est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 540. Les 180 animaux restants subiront toute la procédure (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement par instillation de la mycolactone sur la plaie avant la suture, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse pendant la procédure d’incision. L’instillation ne dure que quelques secondes avant de suturer la plaie. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Traitement par injection de la buprénorphine en intrapéritonéale, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse juste après la procédure d’incision. L’injection en intrapéritonéale ne dure que quelques secondes. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Acclimatation au test plantaire, 5 jours consécutifs pendant 15 minutes à chaque fois. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Tests plantaires à T-1 avant incision, puis après incision et traitement par mycolactone ou buprénorphine : 2h, 4h, 6h, 24h, 30h et 48h, soit au maximum 7 fois. Le test plantaire dure environ 20 minutes. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Chronogramme des procédures : J-5 : acclimatation au test plantaire 15 min J-4 : acclimatation au test plantaire 15 min J-3 : acclimatation au test plantaire 15 min J-2 : acclimatation au test plantaire 15 min J-1 : acclimatation au test plantaire 15 min T-1 : test plantaire pré-incision T0 : incision + instillation de la mycolactone sur la plaie avant suture ou injection de la buprénorphine (groupe test ou groupe témoin incisé traité) T2h : test plantaire T4h : test plantaire T6h : test plantaire T24h : test plantaire T30h : test plantaire T48h : test plantaire puis sacrifice et récupération des pattes
Impact sur les animaux
Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité accrue que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction réduit par rapport aux souris non incisées. Les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si, 2h suite à l’incision, aucun effet analgésique n’est observé de la part de la mycolactone. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse (lorsque le temps de réaction des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité). - Une perte de poids est attendue mais ne devra pas excéder 5% en 24h ou 10% sur la durée totale de l’expérience (48h), sinon, les souris concernées seront euthanasiées. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). Si un animal présente une absence totale d’utilisation de sa patte, il sera euthanasié. - Un changement du comportement les 24 premières heures. Il est à noter que les animaux seront mis à mort maximum 48h après l’incision. De plus, malgré nos précautions, une surinfection de l’incision n’est pas à exclure. A l’apparition des signes de surinfection, les animaux seront mis à mort. Le comportement sera analysé selon une grille d’évaluation des scores. Son utilisation nous fournira un score qui sera décisionnel : - Pas d’action nécessaire. - Douleur légère, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état. - Douleur modérée, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état et un enrichissement supplémentaire sera apporté. - Douleur sévère, le point limite sera considéré comme atteint et l’animal sera euthanasié. Les souris seront systématiquement euthanasiées si elles présentent une infection de la patte. La douleur sévère ne sera pas atteinte. Si des animaux atteignent ce stade, ils seront immédiatement mis à mort. Nous n’utiliserons pas d’analgésiques (en dehors de la mycolactone pour le groupe test et de la buprénorphine pour le groupe témoin) car ceux-ci iraient à l’encontre de l’étude. Le but étant de provoquer une douleur post opératoire et de vérifier l’efficacité de la mycolactone dans le traitement de cette douleur. Une observation biquotidienne des souris sera réalisée.
Devenir
A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront sacrifiés et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésiques destinés à la santé humaine et animale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 souris. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose/formulation de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose/formulation. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Il est nécessaire de répéter les résultats (formulations/doses retenues) dans une deuxième expérience indépendante. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique gazeux (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone appliqué sera plafonnée à une certaine dose, quelle que soit la formulation, car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 2h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose/formulation de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. De plus, pour le groupe de souris ayant reçu la buprénorphine, les tests de ce groupe seront arrêtés une fois que l’effet de la buprénorphine aura disparu (soit environ 6h selon la bibliographie). C’est-à-dire lorsque leur temps de réaction au test plantaire sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques utilisent « l’espèce souris ». Dans notre contexte, cette espèce nous semble très pertinente puisque son utilisation nous a permis de disséquer la propriété anti-douleur de la mycolactone. De plus, de très nombreux outils pour cette espèce sont disponibles (pour analyser les propriétés analgésiques et les effets secondaires indésirables). Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire et maturation du système nerveux).
Equilibre excitation – inhibition et épilepsie dans le circuit hippocampique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie cérébrale avec injection intracérébrale et implantation d'électrodes, puis le déclenchement de crises d'épilepsie par un agent convulsivant, avant une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur décrit des crises pouvant atteindre le stade 5 de l'échelle de Racine, convulsion généralisée entraînant l'euthanasie de l'animal. Il justifie les bénéfices par un "intérêt sociétal considérable" et affirme que l'étude des circuits neuronaux ne peut se faire que sur l'animal.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle d'un type neuronal spécifique (interneurones médiateurs de l'inhibition périsomatique), dans le contrôle inhibiteur du circuit hippocampique dans les conditions physiologiques et dans l'épilepsie. L'efficacité de cette inhibition dépend directement de la concentration intracellulaire en ions chlorures. Plusieurs travaux in vitro suggèrent qu'un épisode aigu de crise pourrait affecter à plus ou moins long terme les systèmes d'homéostasie des ions chlorures dans les neurones hippocampiques, ce qui pourrait causer un déficit d'inhibition favorisant l'épileptogenèse. De plus, le diurétique bumétanide, qui module aussi l'homéostasie des ions chlorures dans les neurones in vitro, a été proposé comme approche thérapeutique potentielle. Grace à des méthodes d'électrophysiologie et d'optogénétique chez la souris, nous allons tester directement ces hypothèses in vivo.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies (en particulier l'épilepsie), ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation de miniatures pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure de déclenchement de crises d'épilepsie par injection intracérébrale d'agent convulsivant, d'une durée de 2 à 5h, procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée d'1 à 6h (cycle comportemental complet, incluant une période de sommeil jusqu'au réveil), ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h, et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - l'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien être animal - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
Les fonctions des réseaux neuronaux sont assurées par leurs caractéristiques intrinsèques (connectivité précise entre multiples types neuronaux) autant qu'extrinsèques (interactions avec les autres régions cérébrales), ce qui impose le recours à des techniques invasives d'exploration. L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. l faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires et après le déclenchement des crises) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont étroitement surveillés lors de l'induction de l'épisode épileptique aigu, et des points limites spécifiques ont été définis selon l'échelle de Racine. Si l'animal atteint le stade 5 d’intensité des crises (convulsion motrice généralisée), l'animal est immédiatement anesthésié (inhalation d'isoflurane) et un anti-convulsivant est administré (Diazepam, 5mg/kg, 0.5ml/kg, IP). Si le stade 5 persiste au réveil de l'animal, il est mis à mort sans délai par dislocation cervicale sous anesthésie isoflurane. L'état de récupération dans les jours qui suivent l'état de crise est étroitement surveillé (alimentation, récupération comportementale). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet. Le phénotype n'est pas dommageable pendant la période de latence (absence de crise) qui suit l'état épileptique aigu et qui dure 2 à 6 semaines selon les individus. Les enregistrements les plus tardifs sont réalisés dès l'apparition des crises spontanées (stade chronique), dont l'expression est vérifiée chaque jour, afin de minimiser la durée du phénotype épileptique subi par l'animal. Enfin, des points limites spécifiques à chaque procédure sont décrits pour chaque étape du projet.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.
Modèles d’études in-vivo de la réponse à des traitements anti-tumoraux: implication de la réponse immune humaine ou murine
- Recherche appliquée
- Cancers
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une splénectomie sous anesthésie, toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant traitement par des molécules anticancéreuses et imagerie sous anesthésie. Le projet teste l'efficacité de traitements anti-tumoraux sur des souris aux tumeurs humaines greffées, avec des bénéfices situés à long terme. Le porteur affirme que ce modèle demeure "indispensable" et juge la modélisation cellulaire ou informatique "trop imparfaite".
Objectifs
Obtenir une réponse objective pour de nouveaux traitements (petites molécules, anticorps monoclonaux...) anti-tumoraux dans le cadre d'un organisme complet, prenant ainsi en compte l'ensemble des acteurs biologiques qui pourraient y concourir.
Bénéfices attendus
Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le cancer. Les molécules testées auront préalablement été selectionnées sur un ensemble d'expériences réalisées sur des cellules en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de ces traitements dans le cadre d'un être vivant complet (murin ou humanisé). Les benefices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché de nouveaux traitements et d'aider dans la lutte contre le cancer. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient.
Procédures
Les animaux inclus dans la procédure "SCID-Hu-PBL-Tumeur" subiront une splénectomie (1 fois: anesthésie profonde, retrait et ablation de la rate, suture et reveil). Cela représente donc 600 animaux. L'abaltion de la rate correspond au temps 0 de l'experimentation. L'opération dure 1 heure entre l'injection de la solution anesthésiante et le réveil suite à l'injection de l'antidote. Des prélèvements sanguins sont prévus sur animaux vigiles (1 prélèvement sanguin / semaine sur les 4-5 semaines expérimentales). Tous les animaux quelque soit la procédure seront suivis pour les paramètres sanguins soit les 1450 animaux. Les animaux seront traités avec des molcules anti-cancereuses (1 fois par semaine,pendant 4 semaines maximum, pour la moitié des animaux soit 725 sur les 5 années). Injection de cellules tumorales sous-cutannées: 1 fois (30 secondes) pour tous les animaux soit 1450. Injection en intra-péritonéale de cellules immunitaires: une seule fois, 30 sec, 600 annimaux. Anesthésie Gazeuse: 5 min maiximum par animal, 3 fois par semaine, pendant 4 /5 semaines experimentales, pour les 1450 animaux prévus sur les 5 années.
Impact sur les animaux
Splenectomie: douleur à la piqure, animal grogi au reveil; Prélèvement sanguin sur animal vigile: stress à la préhension, légère douleur à la piqure ; Injection de cellules: stress de la préhesion, douleur à la piqure; Injection de traitement : stress de la préhension, douleur à la piqure; Anesthésie gazeuse: stress au dépot des animaux dans la boite et jusqu'au moment de l'induction
Devenir
Nous sommes dans l'obligation éthique et scientifique de sacrifier les animaux à l'issue de chaque protocle car nous allons pratiquer des prélèvement d'organes vitaux pour l'analyse post-mortem.
Remplacement
L'ensemble du projet correspond à une phase finale d'études in-vitro préalable. Le modèle nous permettra ainsi de réaliser un suivi précis tant au niveau de l’évolution de la masse tumorale (par Imagerie du petit animal) que du système immunitaire. L’approche in-vivo nous apportera tous les éléments indispensables à la mise en place de futrus protocoles thérapeutiques sur des masses tumorales humaines (création d’une véritable « niche » et du microenvironnement tumoral) que l’on ne peut obtenir que par xeno/-greffe. L’ensemble des observations nous permettra alors de confirmer et d’approfondir les résultats obtenus in-vitro, et de proposer des traitements pour de futurs essais cliniques chez l’homme. Dans la mesure où la modélisation experimentale cellulaire ou informatisée est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à l'évaluation de ces futurs traitements.
Réduction
Grâce à notre experience et aux conseils scientifiques des experts, nous n'avons pas besoin de mettre au point le protocole qui sont bien établis. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les experiences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisament solides d'un pooint de vue statistique. AInsi, pour des modèles simples de regression tumorale sur animaux immunocompétants des groupes de 30 animaux pourraient etre envisagés, et sur les modèles humanisés des groupes de 25 souris seront suffisantes.
Raffinement
Nous avons cherché à optimiser l'expermientation en metant en place une méthodologie d'étude courte et efficace: suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou la detresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportement et la capacité de prise de greffe, qui sont élevées sur place (reduction du transport, condition d'élevage de haute qualité). Les animaux plus jeunes, seront manipulés regulierement et ainsi entrainés en vue d'une reduction du stress. Par ailleurs, l'ensemble des procédures seront strictement limités aux points limites experimentales (taille des tumeurs, poids des animaux, comportement locomoteur). En cours d'experimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc arriere) de manière à ne gener en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un systèmle d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférase). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris SCID ou NSG (modèles immunodéprimés) pour permettre la xénogreffe humaine, s'agissant de créer une chimère à la fois tumorale et immunitaire humaine. Et des souris BalB/c ou C57/Bl6 pour les modèles de cancers murins. Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l’étude efficace des effets des traitements thérapeutiques testées en faibles quantités. C’est le modèle de choix pour les études précliniques des médicaments anti-cancéreux. Par ailleurs le campus dispose d’outils de mesure performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phases experimenale à partir de 6 semaines. Elles sont sevrées et sexées. Elle sont suffisament robustes pour suporter les traitements, et suffisament grandes pour les injections et le developement des cellules tumorales.
Etude d’excretion de substances actives chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rats : 280
80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.
Bénéfices attendus
Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.
Procédures
Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute
Impact sur les animaux
Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.
Réduction
Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.
Raffinement
Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.
Choix des espèces
Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.
Evaluation de l’impact d’une série de composés en développement sur la cachexie
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales induisant une cachexie, fonte musculaire et perte de poids progressives, puis un gavage biquotidien pendant quinze jours, pour tester sept composés d'une société cliente. Le porteur limite le développement de la tumeur à vingt et un jours, seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort, et renvoie au conditionnel une éventuelle mise sur le marché. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" permettant d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur la cachexie.
Objectifs
Le projet faisant l’objet de la présente demande d’autorisation vise à étudier les effets de 7 composés en développement chez un modèle de cachexie induite par des cellules LLC (Lewis Lung Carcinoma). Cette étude est commanditée par une société cliente de notre entreprise, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.
Bénéfices attendus
Si la présente étude pemet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la cachexie, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la cachexie.
Procédures
Ce projet comporte 4 types d'interventions différents: Inoculation de cellules LLC : Durée de 5 minute environ. Test de force (2 tests : pattes avant et 4 pattes) : Durée 30sec/session (3sessions/test ; répété 2 fois au cours du projet). Mesures de composition corporelle : Durée de 1-2 minutes (répétée 3 fois au cours du projet). Administrations sous-cutanées et orales : Durée 10 secondes environ; adiministrations biquotidiennes pendant 15 jours.
Impact sur les animaux
Le modèle employé dans le présent projet est un modèle de cachexie résultant du développement d'une tumeur sous-cutanée induite par l'inoculation de cellules Lewis Lung Carcinoma (LLC). Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Pour des raisons éthiques (tumeur ne devant dépasser 3000m3), le modèle est limité à 21 jours post inoculation des cellules LLC après lesquels les animaux seront euthanasiés. D'autre part, les mesures de pesée et de tumeurs peuvent constituer une nuisance par la manipulation. Les traitements, par injections sous-cutanées et per os par sondes de gavage, engendrent également une nuisance sur les animaux. La mesure de compositon corporelle et le test de force constitue une légère nuisance sur l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les muscles des pattes arrières, le coeur, le diaphragme, le tissu adipeux sous-cutané, le foie et certaines portions du tube digestif qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur l’état de cachexie. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe contrôle du modèle (heated-treated LLC/ Vehicule) a été réduit à 8 animaux (contre 12 pour les groupes cachectiques) du fait d'une moindre variabilité des paramètres mesurés, ces souris ne développant pas de tumeur. Les analyses statistiques seront réalisées par des tests ANOVA suivis de tests Post-hoc de Bonferroni. Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 80% et une erreur alpha à 0,05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, poids corporel cumulé, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, volume tumoral, densité tumorale, poids de la tumeur, poids corporel sans tumeur, composition corporelle (masse grasse, masse maigre, masse fluidique ; animal, carcasse avec/sans tumeur, tumeur seule), test de force par grip test (2 et 4 pattes), poids des muscles (gastrocnemius, soleus, long extenseur des orteils, plantaris, tibialis, vastus lateralis, diaphragme, cœur).
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Il s'agit d'un modèle de cachexie chez la souris induit par une inoculation de cellules LLC. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cage individuelle et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de dômes en carton, de briquettes en bois et de matériel de nidification. Afin de réduire toute douleur au cours des procédures expérimentales, l'inoculation des cellules LLC sera réalisée sous anesthésie et les mesures de composition corporelle seront réalisées chez l'animal vigile (indolore ; durée de la mesure : 2 minutes). Les administrations sous-cutanées seront réalisées par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique, et deux sites d'administration seront utilisés (alternance d'un jour à l'autre). Les administrations orales seront pratiquées à l'aide de canules de gavage à usage unique pourvues d'embout en silicone. Enfin, compte-tenu du développement d’une tumeur et d’un état de cachexie progressif chez les animaux, le développement de cette dernière sera limité à 21 jours post inoculation et un suivi journalier particulièrement étroit des animaux à l'aide d'une grille de score de souffrance permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Au-delà des points limites, la souffrance de l'animal est évaluée pour une gestion contrôlée de la douleur. A partir d’un certain seuil, un analgésique sera administré et une intervention du vétérinaire référant pourra être programmée.
Choix des espèces
Le modèle souris C57BL/6 J est très bien documenté dans la littérature en tant que modèle de cachexie induit par une inoculation de cellules LLC. Le choix du modèle souris C57BL/6J a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (5 semaines à réception ; 7 semaines au début du traitement). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte présentant un état cachectique lié au cancer.
Effet des hormones gonadotropes sur la SUMOylation des protéines ovariennes
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales d'une hormone gonadotrope équine pendant trois jours, puis sont mises à mort pour prélever leur sang et leurs ovaires. Le projet relève de la recherche fondamentale sur la SUMOylation des protéines ovariennes, sans application décrite à court terme. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune méthode alternative" permettant d'intégrer la complexité du contrôle hormonal de l'ovaire.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une étude qui a pour but de comprendre le rôle de la SUMOylation ovarienne et son contrôle par les hormones pituitaires (HP) dans les plasticités physiologiques et pathologiques de l’ovaire. Le projet faisant l’objet d’une demande d’autorisation vise à évaluer l’effet d’une exposition courte à la PMSG (une hormone gonadotrope équine dont l’activité mime chez la souris à la fois les effets de LH et de FSH) sur les niveaux de SUMOylation des protéines au sein des différentes structures fonctionnelles de l’ovaire de souris pré-pubères et pubères - et sur l’expression des acteurs de la SUMOylation.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle de la SUMOylation et de son contrôle par la PKA dans l’homéostasie et la différenciation fonctionnelle de l’ovaire. L’effets des traitements de PMSG seront évalués par des analyses in situ. Des analyses sur la chromatine seront développées à partir d’échantillons ovariens pour évaluer l’impact de l’hypoSUMOylation sur l’activité de facteurs épigénétiques contrôlant les programmes génétiques de l’identité et de la fonction ovarienne.
Procédures
Injections intrapéritonéales (1 injection par jour / par animal pendant 3 jours). Durée de l'intervention : moins de 1 minute par animal et par jour.
Impact sur les animaux
Aucun stress ni douleur ne sont attendues suite au traitement prévu dans cette étude. Toutefois, les animaux seront observés quotidiennement afin de suivre leur état général (perte de poids, comportements anormaux). Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état général des animaux et de les exclure de l’étude si besoin. Les animaux seront élevés dans un milieu enrichi (tunnel-igloo de carton, copeaux permettant de nicher, compartimentalisation de la cage).
Devenir
Mise à mort pour prélévement de sang et de tissus.
Remplacement
Ce projet concerne l’étude de la différentiation fonctionnelle d’un organe dont l’activité est modulée par des signaux paracrines inter cellulaires et un contrôle cyclique hypothalamo-hypophysaire. Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’intégrer ces différents niveaux de complexité.
Réduction
L’étude principale prévoit l’utilisation de 150 animaux, qui correspondent à 3 x 5 groupes de 10 animaux étudiés à 2 âges différents. La stratégie expérimentale choisie afin de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet est la suivante : 1/ détermination préalable de tous les paramètres à mesurer ; 2/ estimation des effets attendus entre les groupes témoins et les groupes traités avec les hormones (types de variables mesurées, test statistique envisagé) ; 3/ dans la mesure du possible, les animaux sont inclus dans divers protocoles (immunohistochimie, biologie moléculaire, biochimie ...). Il est à noter que les expériences fonctionnelles menées in vivo nécessitent davantage d’animaux que les expériences descriptives ; 4/ détermination de la puissance et de la taille des échantillons pour différents tests statistiques à l’aide du logiciel G-power. Le nombre d’individus estimé est augmenté de 10% afin de pallier à d’éventuelles pertes au cours des expériences. Les résultats de l’analyse préliminaire indiquent que des cohortes de 10 animaux seront nécessaires pour assurer un test de puissance (1-) = 0.95 dans le cadre d’analyse de comparaison de moyenne (2 –tailed t-test, risque de 0.05). La comparaison statistique sera effectuée en utilisant le test approprié selon la variance retrouvée au sein des différents groupes.
Raffinement
Le milieu dans lequel les animaux évolueront sera enrichi (igloo de carton, copeaux permettant de nicher, compartimentalisation de la cage).
Choix des espèces
La souris présente une physiologie endocrine très proche de l’espèce humaine et nos données seront comparées à celles issues de modèles murins génétiquement modifiés. Enfin, les méthodes d’exploration de la fonction hypothalamo-hypophysaire-Gonadotropes sont les mêmes que celles utilisées chez l’homme dans les services d’endocrinologie. Les animaux seront utilisés à 2 âges différents : -un stade pré-pubère à l’âge de 30 jours. Ce stade est situé avant la mise en place de l’activité ovarienne cyclique et après la mini-puberté et quand le taux de production basale des hormones LH et FSH se stabilise. -Un stade pubère de 7 semaines correspondant à un stade d’activité cyclique de l’axe gonadotrope avec au niveau de l’ovaire, une mobilisation de la réserve folliculaire de la vie reproductive.