Souris

231 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau, des prélèvements de sang dans la queue et des injections intraveineuses hebdomadaires, pour tester des anticorps modifiés censés dégrader leur cible à l'intérieur des cellules tumorales. La croissance de la tumeur peut provoquer une perte de mobilité et de poids, et les animaux sont tués pour prélever tumeurs et organes métastasés. Le porteur affirme que les tests sur cellules ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier" et conclut à la nécessité de recourir à la souris, les bénéfices pour les patients restant renvoyés au long terme.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier l’amélioration de l’efficacité des anticorps thérapeutiques, utilisés aujourd’hui dans le traitement de certains cancers, par des modifications. Actuellement, les traitements utilisant des anticorps permettent rarement la dégradation de leur cible. Le but ultime de cette étude est de rendre ces anticorps thérapeutiques (mAb) plus efficaces en les rendant capables de dégrader leur cible à l'intérieur des cellules. Pour ce faire, ces mAb sont modifiés leur permettant d'être internalisés dans la cellule. Ainsi, une fois la cible liée à l’anticorps modifié, le complexe est adressé vers l’intérieur de la cellule et une dégradation de la cible est attendue. Les premiers résultats des tests cellulaires de dégradation de la cible, avec des anticorps utilisés actuellement en clinique pour le traitement du cancer, se sont révélés encourageants avec une dégradation plus importante de la cible grâce aux mAb modifiés. Afin de pouvoir poursuivre le développement de ces nouveaux mAb, l’étude de l’efficacité sur l’animal est nécessaire. Des modèles murins présentant des greffes de cellules cancéreuses humaines seront utilisés afin d’évaluer l’amélioration du potentiel thérapeutique des anticorps modifiés.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de l’amélioration de l’efficacité des anticorps thérapeutiques, la technologie AMFA a pour but de rendre plus efficace les traitements en permettant la dégradation des cibles surexprimées dans le cadre de cancers et d’autres maladies telles que les maladies inflammatoires. Dans cette étude, une régression significative de la taille de la tumeur voire sa disparition est attendue pour les souris traitées avec le mAb-AMFA. Aussi, la survie des animaux traités avec le mAb-AMFA devrait être supérieure. A long terme, c’est un traitement moins contraignant et plus efficace qui pourra être proposé aux patients dans le cadre d’une immunothérapie anti-cancéreuse.

Procédures

Les animaux seront injectés, une seule fois, de cellules cancéreuses dans le tissu sous-cutané. L'intervention est estimée à 1 minute par animal. Les souris seront soumises à un prélèvement de sang dans la veine caudale avant le traitement et à 15 jours après le début du traitement. L'intervention est estimée à 3 minutes (contention + prélèvement). Les souris seront aussi injectées dans la veine caudale toutes les semaines soit 4 fois. La durée de l'intervention est estimée à 5 minutes (contention + pré-chauffage de la queue + injection) par animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de l’étude, il peut être attendu une perte de mobilité ainsi qu’une perte de poids chez les animaux xénogreffés, à cause de la croissance tumorale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de pouvoir récupérer les tumeurs et les organes présentant des métastases pour analyse.

Remplacement

Afin de limiter au maximum l’utilisation des animaux, des études aux résultats encourageants sur cellules cancéreuses ont préalablement été menées afin de tester l’efficacité du nouveau traitement proposé. Cependant, ces expérimentations ne prennent pas en considération la complexité de la physiologie d’un organisme entier. Pour confirmer le potentiel thérapeutique de cette approche et poursuivre le développement du traitement jusqu’à son application chez le patient, il est nécessaire de tester son efficacité chez l’animal dans le but de se rapprocher le plus possible de l’Homme.

Réduction

Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible tout en gardant des résultats exploitables, une recherche bibliographique a été réalisée afin de baser les tests statistiques de manière sérieuse pour chaque mAb. Ainsi, pour l’étude pilote, le nombre de souris correspond au nombre moyen d’animaux par groupe utilisés dans des études classiques. Concernant le nombre des animaux utilisés pour les mAb, il a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistiques et tout en tenant compte des effets de taille spécifiques à chaque mAb, d’après la recherche bibliographique. Aussi, la concentration des traitements administrés a été déterminée à la suite d’une recherche bibliographique pertinente pour chaque modèle afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

En plus des conditions réglementaires du bien-être animal, les animaux seront placés par 4 par cage afin de stimuler les contacts sociaux entre eux. Aussi, les animaux seront manipulés quotidiennement dès leur arrivée pour limiter le stress des animaux lors de l’expérimentation. Aucune douleur n’est attendue à la suite de l’injection des cellules tumorales. La croissance de la tumeur dans le cadre de notre étude sera contrôlée tous les cinq jours et limitée, afin de ne pas entrainer de douleur chez l’animal. Aussi, dans le but de limiter la souffrance animale et d’après une recherche bibliographique pertinente, seule concentration de chaque anticorps sera administrée à chaque animal. Les animaux seront quotidiennement surveillés selon une fiche de suivi clinique standard. Si des signes de douleur de l’animal sont perçus, les animaux seront sortis de l’étude. Pour faciliter la réhydratation des animaux après la greffe de la tumeur, de la nourriture gélifiée sera disponible ad libitum dans la cage.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des BALB/c nude athymiques, des animaux immunodéprimés, pour éviter tout rejet de la greffe utilisant des cellules humaines. Ces modèles permettront d’apprécier l’efficacité unique des traitements appliqués. L’âge des souris utilisées dans cette étude est de 5 à 6 semaines, âge où les animaux sont sexuellement matures et adultes. C’est aussi à ces âges où l’on observe une meilleure prise de greffe ainsi qu’une forte homogénéité.

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues immunodéprimées par deux injections, puis infectées par une bactérie hospitalière résistante, Acinetobacter baumannii, par voie intranasale sous anesthésie, avant une mise à mort 24 heures après l'infection pour compter les bactéries dans les poumons et la rate. Le porteur cherche la plus petite dose efficace de rifampicine. Il affirme que le recours aux animaux est une étape obligatoire et réglementaire du développement de médicaments.

Objectifs

L’objectif du projet est de définir la plus petite dose et fréquence d’administration d’un antibiotique (ici la rifampicine) capable d’induire une diminution bactérienne dans les poumons des souris infectées par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes (CRAb). En effet les carbapénèmes constituaient la dernière ligne de traitement antibiotique efficace contre ce pathogène fréquemment associé aux infections nosocomiales (acquises en milieu hospitalier), telles que les pneumonies sévères acquises sous ventilation chez les patients de réanimation ou immunodéprimés. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée par le laboratoire ayant donnée de bons résultats avec la rifampicine dans ce modèle d’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude déjà réalisée par notre équipe ou les souris infectées et traitées par de la rifampicine à 25 mg/kg administrée 4 fois par jour a montré une réduction bactérienne pulmonaire de plus de 4 Log 24h après l’infection par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes. Après plus d’investigations, il s’est avéré que la rifampicine administrée était surdosée par rapport à la clinique. Le but de cette étude est d’évaluer la plus petite dose et fréquence de rifampicine seule ou en association avec un carbapénème permettant une diminution de la charge bactérienne dans le poumon qui se rapproche au maximum de la clinique. Cette combinaison pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique contre les infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes.

Procédures

L’infection se fera par voie intranasale par l’injection de 50µL à l’aide d’une pipette et sous une petite anesthésie volatile (isoflurane 2%). L’administration des antibiotiques et d’un immunosuppresseur (endoxan) se fera par voie intrapéritonéale (ip). Les souris recevront deux injections d’endoxan en ip à J-4 et J-1 avant infection afin d’obtenir une neutropénie significative mais non létale.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle d’infection, aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire). Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté. En effet, l’appréhension et l’entrainement liés au geste technique d’injection intra-nasales ont déjà été réalisés sur d’autres expériences et sont maintenant bien maitrisés. Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées avec un protocole bien défini (150 mg/kg de endoxan à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux. Les concentrations d’antibiotiques utilisées seront en accord avec les données de la littérature sur ce sujet. Aucune toxicité n’est rapportée. Du fait des temps d’administration des antibiotiques (toutes les 8h pour la rifampicine et toutes les 2h pour le méropénème), la surveillance sera accrue sur la totalité de l’étude (24h). Si l’animal présente des souffrances extrêmes (convulsions, détresse respiratoire, animal amorphe et non réactif aux stimuli), alors une mise à mort prématurée sera mise en place.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 24h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.

Remplacement

La rifampicine est un antibiotique antibactérien de la famille des rifamycines, antituberculeux, antilépreux, dont le mode d'action est la formation d'un complexe stable avec la RNA polymérase des bactéries. Utilisé en clinique, son spectre antibactérien est large et comprend les staphylocoques, les streptocoques et les bactéries à croissance intracellulaire telles que les mycobactéries. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). La mesure de l’efficacité de la rifampicine ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (8 souris par groupe) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)).

Raffinement

4. D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile (isoflurane 2%). Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 8 par cage. De plus, une surveillance accrue (toutes les 8h pour la phase 1 et toutes les 2h pour la phase 2) sera réalisée tout au long de l’étude. 5.

Choix des espèces

Les souris Balb/c représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Acinetobacter baumannii dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, avec une perte de poids pouvant conduire à la mort et une mise à mort à 20 % du poids perdu, avant le prélèvement des poumons et de la rate. Le porteur situe le projet dans un consortium européen et revendique un "besoin" de générer un maximum de données. Il affirme que les essais précliniques reposent sur le recours à l'"organisme entier".

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris par des souches virulentes de bacilles tuberculeux est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours par semaine pendant 4 à 8 semaines. Il y a 1 gavage par jour par souris. Le nombre de gavages total par souris au cours de l’expérience variera selon qu’une souris soit un contrôle du niveau d’infection ou bien reçoive un traitement de 8 semaines, ou encore permette d’obtenir des données pharmacodynamiques à des stades intermédiaires, par conséquent de 0 à 40 gavages. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués au niveau de la queue pour l'étude de la biodisponibilité́ des composés. Un faible volume de sang (~ 30 µl) sera prélevé au niveau d’une incision faite sur la veine caudale. L’animal, vigile, est pour cela placé dans un dispositif l’immobilisant et ne laissant dépasser que la queue. Une pression est ensuite effectuée au niveau de l’incision avec une compresse imbibée d’alcool pour stopper le saignement. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – pour chaque souris sélectionnée pour l’étude pharmacologique. Il s’agit d’un acte rapide qui doit prendre 1 à 2 min. 4. Pour l’analyse de biomarqueurs, des prélèvements de sang seront effectués par ponction cardiaque sur animaux anesthésiés avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Sont concernés l’ensemble des animaux de l’expérience (maximum 120). Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

1 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales qui provoque une pousse tumorale, avec baisse des interactions sociales et de la mobilité dans les dernières 24 heures, avant le prélèvement de plusieurs organes pour analyser les cellules Natural Killer. Le porteur relie le projet à un financement de la Ligue contre le Cancer. Il affirme que la complexité du système immunitaire rend impossible son étude in vitro.

Objectifs

Les cellules NK (Natural Killer) sont primordiales dans la défense anti-tumorale. En effet, celles-ci appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses en ayant les capacités de les éliminer suite à leur reconnaissance. Cependant, lorsqu'elles sont trop sollicitées, celles-ci s'épuisent et n'arrivent plus à éliminer les cellules tumorales ce qui explique l'échappement tumoral. Ce projet vise à générer et étudier une population de cellules NK dites "épuisées" dans le but d'identifier des cibles thérapeutiques pouvant bloquer ce phénomène impliqué dans l'échappement tumoral. Nous avons identifié de multiples altérations chez ces cellules NK épuisées mais les conditions de génération de cette population ainsi que la chronologie des dysfonctions sont inconnues. Le but de ce projet, intégré à un projet financé par la Ligue contre le Cancer (équipe labelisée) est de mieux comprendre les conditions de génération de cette population afin de pouvoir éventuellement interférer avec elles pour empêcher ou restaurer une fonctionnalité des cellules NK normale dans un modèle tumoral chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les causes de l'épuisement des cellules NK en contexte tumoral. Nous espérons que ces données conduiront à l'élaboration de nouvelles thérapies., que ce soit des thérapies cellulaires (permettant le transfert des cellules NK insensible à l'épuisement) ou médicamenteuse (composés ciblant des voies de signalisation impliquées dans l'établissement de l'épuisement).

Procédures

Des injections intra-veineuses (dans la veine caudale des souris) seront réalisées une seule fois chez les animaux. La durée de ce geste est compris entre 10 et 30 seconde à partir du moment où l'animal est prêt.

Impact sur les animaux

La pousse tumorale s'accompagne d'effets indésirables pour les animaux. Ceci se caractérise par une baisse des intéractions sociales. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux est observée. Ceux-ci n'apparaissent qu'au cours des dernières 24h précédent la mise à mort des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but d'analyser les cellules NK présentes dans les organes (rate, moelle, foie, poumons...).

Remplacement

Le système immunitaire est biologiquement très complexe, faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude par des tests in vitro exclusivement. La principale problématique étant que l'on ne connait pas l'ensemble des paramètres du système.

Réduction

L'utilisation de techniques de pointe (séquençages total ou à l'échelle d'une unique cellule) permet d'analyser un grand nombre de paramètres sur chaque animal et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, l'utilisation de méthodes statistiques permettent de réduire au strict minimum le nombre d'animaux nécessaire pour le déroulé de ce projet.

Raffinement

Les animaux serront suivis de manière journalière à partir du septième jour post-injection. De plus, le modèle étant parfaitement maitrisé, nous connaissons les jours auxquel les animaux atteindront les points limites et nous augmentons la fréquence de surveillance des animaux (2 fois par jour) sur les 3 jours précédents les jours connus pour atteindre des points limites. Enfin, des croquettes hydratées ainsi que de l'eau gélifiée seront placées au fond de la cage les jours précédents de mise à mort afin d'améliorer le confort des animaux. Des points limites adaptés à notre modèle ont été définis de façon à éviter toute souffrance inutile des souris.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu, un atout déterminant dans notre projet. Enfin, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des peptides par voie intranasale tous les deux jours pendant six mois, puis passent trois tests de mémoire nommés, mémoire de travail spatiale, association d'un contexte à une émotion et reconnaissance d'objet, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur revendique le caractère "indispensable" de ces animaux pour comprendre la maladie. Il indique avoir d'abord testé les composés sur des modèles cellulaires.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.

Impact sur les animaux

L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.

Remplacement

Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).

Raffinement

Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.

Deux heures d'opération pour injecter un vecteur viral dans le cerveau, trois heures pour y implanter une canule optique : 187 souris adultes subissent ces deux chirurgies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées par perfusion intracardiaque pour vérifier l'expression du gène injecté et la place des canules. 147 d'entre elles passent auparavant six séances de 30 minutes de stimulation par ultrasons à travers le crâne, pour régler fréquence, pression acoustique, distance et profondeur d'anesthésie d'une technique qui permettrait, selon le porteur, "théoriquement" d'activer le cerveau "de manière indolore et non invasive". Pour justifier le choix de la souris, il invoque "l'observation du comportement de l'animal vivant", alors que chaque séance se déroule sous anesthésie gazeuse et que le résumé ne décrit aucun test de comportement.

Objectifs

Ce projet porte sur la neurostimulation ultrasonore. Cette technique permet théoriquement d’activer des zones du cerveau à travers le crâne de manière indolore et non invasive, offrant donc un espoir pour de nouvelles thérapies pour certains troubles neuropsychiatriques sévères. L’objectif de ce projet sera de caractériser les paramètres physiques et expérimentaux permettant une neurostimulation fiable et optimale de plusieurs zones du cerveau qui sont connues pour jouer un rôle important dans ces troubles. Cette caractérisation sera réalisée chez la souris avec une méthode de photométrie par fibre. Celle-ci permet de visualiser l’activité neuronale par imagerie chez la souris, laquelle sera soumise à différents types d’émissions d’ondes ultrasonores. La mesure de l’activité des neurones sera permise par (1) l’expression d’un gène spécial (dont la protéine dégage de la fluorescence en fonction de l’activité des neurones) qui devra être injecté (= transfecté) dans la zone du cerveau que l’on souhaite stimuler et imager, et (2) par une canule optique implantée dans la zone cérébrale dont on veut suivre l’activité neuronale, laquelle pourra être reliée par fibre optique à l’appareil de photométrie lors des mesures et des stimulations ultrasonores transcrâniennes. Le projet comprendra 2 phases : (1) une phase de développement permettant de déterminer l’expression optimale du gène transfecté pour des zone du cerveau superficiel ou profond (40 souris maximum). (2) une phase de caractérisation des effets de neurostimulation par les ultrasons dans différentes zones cibles en fonction des différents paramètres physiques et expérimentaux suivants : fréquence (2 niveaux 0.5 et 1.5 MHz), pression acoustique (10 niveaux de 0 à 500 kPa), distance de la cible (3 niveaux : rayon de 0 – 0.5 – 1 cm), niveau d’anesthésie (3 niveaux de 0.5% – 1% – 1.5% d’isoflurane). La deuxième phase nécessitera 21 souris par zone sur les 7 zones cibles donc un total de 147 souris.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra permettre de caractériser les paramètres optimaux de neurostimulation par ultrasons. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette méthode pour de nombreux troubles neuropsychiatriques (comme l’autisme, la dépression et les troubles anxieux)

Procédures

Dans la procédure 1 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), puis à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine). Dans la procédure 2 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), à 6 séances de stimulations transcrâniennes ultrasonores (6 séances de 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine).

Impact sur les animaux

La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie a un impact modéré et limité dans le temps (quelques heures ou jours) sur le bien-être animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant très faibles (< 0,1 g) : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sur l’animal mobile et éveillé sans impact majeur sur le bien-être. La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipulation et associé à l’installation dans le dispositif.

Devenir

Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure Procédure 2 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure. Lors des 2 procédures, cette étape de mise à mort est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression du transgène et du placement des canules optiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.8 pour une taille d’effet f de Cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique (Buprecare, Metacam) avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur un matelas chauffant pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.