Souris

828 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans les canaux mammaires ou sous la peau, des séances d'imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ablation des ovaires et des traitements hormonaux, sur une durée pouvant atteindre un an. Le porteur affirme que les tumeurs resteront le plus souvent petites et peu douloureuses, les animaux étant tués pour récolter ces tumeurs. Il indique recourir à des cultures en trois dimensions mais juge la vérification in vivo obligatoire, la réponse de ces cultures aux hormones étant "contestée".

Objectifs

Établir des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tumeurs de patientes. Créer des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tissu mammaire normal. Caractériser l'effet d'oncogènes sur la différenciation de lignées de cancer du sein. Tester la réponse de ces lignées aux traitements pour le cancer du sein. Abréviations: PDX: xénogreffe dérivée de tumeur de patiente ("Patient Derived Xenograft"). GDX: xénogreffe dérivée de cellules normales converties en cellules tumorales ("Genetically Defined Xenograft"). SARM: androgène sans effet virilisant ("Selective Androgen Receptor Modulator").

Bénéfices attendus

Les lignées créées permettront de comprendre la réponse aux traitements hormonaux du cancer du sein. Nous avons montré qui les androgènes sans effet virilisant, dites SARMs, inhibent la croissance des tumeurs résistantes aux traitements avec les anti-estrogènes habituels. Les SARMs ont le double avantage d'être très bien acceptés par les femmes, contrairement aux traitements classiques qui sont abandonnés par la moitié des femmes. Le problème est que nous ne comprenons pas pourquoi certaines tumeurs du sein sont inhibées et d'autres sont stimulées par les androgènes. Le bénéfice attendu donc est de pouvoir mieux choisir quelles patientes devraient recevoir les SARMs. Jusqu'à présent il était presqu'impossible d'établir des lignées cellulaires de tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons montré que la culture 3D, dite organoïde, combinée avec l'injection intracanalaire permet de créer des lignées hormonosensibles à partir de tumeurs de patientes, et nous avons montré que la même approche permet de créer des tumeurs hormonosensibles à partir de cellules mammaires normales en ajoutant des oncogènes mammaires. Ces derniers permettent de disséquer les mécanismes de régulation de la croissance par les stéroïdes parce que on peut modifier les gènes qu'on utilise pour créer les tumeurs. Un deuxième avantage de l'injection intracanalaire est que ça met les cellules au site d'origine des tumeurs du sein. Elle permet donc de suivre la progression des tumeurs dès la première étape de formation de la tumeur.

Procédures

Nous injecterons des cellules tumorales dans les mamelons ou sous la peau. La procédure durera environ 10 min par animal. Si nous injectons les cellules dans le mamelon, une crème analgésique sera mise sur la peau autour du mamelon pour prévenir la douleur immédiatement après l’injection. Les cellules tumorales émettront une lumière dite bioluminescence qui permettra de quantifier la croissance de la tumeur. Les souris seront anesthésiées pour scanner la bioluminescence. La durée d’un scan sera d'environ 15 min. Les souris seront scannées une semaine après l'injection des cellules, puis une fois par mois pour suivre la croissance des tumeurs si nous voulons simplement établir une lignée tumorale. Dans ce cas l’expérience pourrait durer 1 an si la tumeur poussait très lentement. Si les cellules tumorales ont besoin de l’estrogène pour survivre, la souris pourrait recevoir de l’estrogène dans le biberon pendant tout ce temps. Pour évaluer la réponse aux traitements les souris seront scannées tous les 7-14 jours. Si un traitement antitumorale est mis dans le biberon, la durée sera

Impact sur les animaux

Dans la majorité des cas les tumeurs seront tellement petites qu'elles ne seront détectables que par bioluminescence, ou par des analyses au laboratoire après la mort de l’animal (microscopie fluorescente et histologie). L'impact sur le bien-être des souris sera limité essentiellement aux procédures et donc aux injections et à la chirurgie pour enlever les ovaires. Les injections dans les canaux galactophores seront faites avec une aiguille tellement fine que la blessure sera à peine visible à l'oeil nu. Pour éviter la douleur après la chirurgie pour enlever les ovaires les souris recevront un traitement analgésique (la buprénorphine) 20 minutes avant l'intervention et pendant les jours suivant l'intervention si nécessaire. Même quand les tumeurs seront palpables, elles auront peu d'effet sur le bien-être des animaux (les tumeurs équivalentes chez les femmes ne sont pas douloureuses). Les tumeurs ne feront presque jamais d'ulcères cutanées. Les traitements prévus sont des traitements hormonaux (androgènes, anti-androgènes, estrogènes, anti-estrogènes et produits similaires). Comparés à la chimiothérapie il s'agit de traitements doux qui ont certes des effets physiologiques, par exemple sur la croissance des canaux galactophores, mais n'induisent pas les effets secondaires qu'on craint avec la chimio (diarrhées, anémies, pertes de poids). Les pellets d'estrogène peuvent provoquer la rétention urinaire s'ils sont utilisés pendant plus de 3 mois donc nous limiterons la durée du traitement à 3 mois dans ces cas. L'estrogène dans les biberons n'a pas cet effet donc les biberons seront utilisés s'il faut donner de l'estrogène pendant des périodes prolongées.

Devenir

Mise à mort pour récolter les tumeurs.

Remplacement

Plusieurs nouvelles approches de cultures cellulaires dites "organoïdes" viennent d'être inventées. Les milieux utilisés pour la culture organoïde maintiennent le caractère des cellules tumorales mieux que les milieux de culture classique. Au lieu de pousser sur une boîte en plastique, les cellules flottent dans un gel où elles forment des petits amas sans toucher le plastique. A l’échelle d’une cellule, le plastique est plus rigide que l’os, ce qui change complètement le comportement des cellules. Pour les tumeurs du sein l’avantage de la culture organoïde est que les cellules tumorales continuent à produire les protéines pour détecter les stéroïdes. On s’attend donc à ce que les réponses aux médicaments en culture organoïde prédisent mieux les réponses dans les patientes. Autant que possible nous utilisons ces approches pour tester l'efficacité des médicaments mais la réponse des organoïdes aux stéroïdes est actuellement contestée et nous sommes obligés de vérifier au moins les résultats importants in vivo. Par ailleurs, les cultures organoïdes sont rarement pérennes et il faut donc maintenir un stock des cellules dans les souris pour éviter de les perdre.

Réduction

L'injection dans les canaux galactophores est beaucoup plus efficace que l'injection sous la peau pour les tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons donc besoin de moins d'animaux pour obtenir le même nombre de tumeurs. Nous avons déterminé via des tests statistiques (test t de Student avec une puissance de 80% et une valeur p de 0.05) qu'un lot de 10 souris par groupe était nécessaire pour avoir des données statistiquement exploitables à la fin de l'étude.

Raffinement

Afin d'être moins invasif, nous marquerons les cellules tumorales avec des protéines qui émettent la lumière. Ceci permettra de suivre la croissance des tumeurs quand leur taille sera nettement inférieure aux tailles habituelles. Par conséquent il sera souvent possible d’arrêter l'expérience avant que les tumeurs ne soient palpables ou visibles à l'oeil nu. Afin d'éviter la douleur, les souris seront anesthésiées pendant les interventions potentiellement douloureuses. Afin de protéger les animaux contre les infections, nous utiliserons des cages stériles. Plus globalement en matière de raffinement, le bien-être des animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort. Pour réduire la souffrance et l’angoisse, les animaux seront hébergés collectivement, cinq souris par cage, avec accès en permanence à l'eau et à la nourriture. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwool »). Les souris seront manipulées par du personnel formé et qualifié. L'estimation de la souffrance sera réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés seront basés directement sur les conseils des autorités françaises et européennes.

Choix des espèces

Il faut utiliser des animaux immunodéficients pour éviter le rejet des cellules humaines. De nombreuses études ont montré que les souris immunodéficientes dites "NSG" permettent de greffer les cellules humaines. Les canaux galactophores de souris maintiennent le caractère hormonosensible des tumeurs du sein humaines. Souris adultes (il n’y a pas assez de canaux galactophores pour faire les injections avant 6 semaines).

98 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, des formes altérées d'une protéine liée à la maladie de Parkinson, pour comparer leur pouvoir pathogène. Le porteur indique que cette inoculation conduit irrémédiablement à une paralysie mortelle, les animaux étant tués dès l'apparition d'une démarche saccadée et d'une perte d'équilibre. Il affirme que le projet ne peut être mené qu'in vivo, faute de méthode alternative.

Objectifs

L’alpha-synucléine est une protéine présente sous une forme anormale dans les lésions cérébrales des patients atteints de la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy ou l’atrophie multisystématisée. Nous avons développé une méthode permettant d’amplifier in vitro les altérations de l’alpha-synucléine à partir d’un cerveau (substrat) provenant de souris conventionnelles C57Bl/6 après amorçage de la réaction par une petite quantité de matériel cérébral de souris modifiées génétiquement (M83) et présentant des altérations de l’alpha-synucléine humaine. Notre projet vise à évaluer dans quelle mesure la présence d'autres protéines humaines anormales dans le cerveau utilisé comme substrat peut modifier les altérations de l’alpha-synucléine lors de la réaction in vitro. Ces autres protéines humaines examinées sont celles impliquées dans la maladie d’Alzheimer (β-amyloïde et tau) et dans le diabète de type 2 (peptide amyloïde des ilots pancréatiques). Les caractéristiques de l’alpha-synucléine ainsi altérée in vitro sont évaluées dans notre projet par les caractéristiques de la maladie et des lésions cérébrales observées suite à son inoculation dans le cerveau de souris modifiées génétiquement (M83).

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur les relations entre des protéines qui sont altérées dans la maladie d’Alzheimer ou le diabète de type 2 et l’alpha-synucléine, qui est altérée dans la maladie de Parkinson. Il est en effet établi que l’altération des premières protéines entraîne une fréquence accrue et une aggravation des maladies humaines associées à l’alpha-synucléine altérée, mais les mécanismes en cause restent encore très mal compris. Ce projet envisage de répondre à la question de savoir dans quelle mesure ceci peut être lié à des altérations différentes de l’alpha-synucléine elle-même, du fait de la présence dans le cerveau d’autres protéines altérées. On parle de co-morbidités.

Procédures

Les produits d’amplification obtenus in vitro sont caractérisés par leur pathogénicité après inoculation dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 98 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation de différentes formes altérées d’alpha-synucléine présentes dans les différents produits d’amplification étudiés est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les 7 lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque produit d’amplification examiné. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée de survie, de la distribution des lésions cérébrales et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. L’analyse statistique de la distribution de l’alpha-synucléine nécessite en particulier un minimum de 6 souris au stade clinique de la maladie. Un lot de 14 souris nous permet ainsi de bénéficier au stade clinique d’au moins 6 cerveaux, pour les analyses biochimiques de l’alpha-synucléine et d'au moins 6 cerveaux pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire dans ce modèle de souris sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Grâce à ce projet fondé sur l’inoculation de différentes sources d’alpha-synucléine anormale nous souhaitons affiner la caractérisation clinique comme possible critère de différenciation, une possibilité décrite dans la littérature scientifique, par exemple lors d’un test de suspension par la queue.

Choix des espèces

Plusieurs études récentes ont montré que les souris (M83) utilisées dans ce projet permettaient la caractérisation de différentes formes anormales d’alpha-synucléine, après leur inoculation dans le cerveau de ces souris, sur la base du délai d’incubation de la maladie, de l’extension des lésions dans le cerveau et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6 à 8 semaines. Compte-tenu de l’importance de la mesure de la durée d’incubation de la maladie ces souris sont entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à son apparition, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec injection d'un virus faisant surexprimer une protéine liée à la maladie de Parkinson, puis des séances d'imagerie sous anesthésie et des tests comportementaux que le porteur qualifie de "non invasifs" sans les détailler. Les animaux sont tués pour analyse du tissu cérébral. Le porteur affirme avoir besoin d'un "modèle intégré" que la culture cellulaire ne remplace pas, et présente le suivi par bioluminescence comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.

Objectifs

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Certains sont basés sur l'injection intracérébrale de virus permettant la surexpression d’alpha-synucléine (protéine abondante dans le cerveau et dont l’agrégation provoque une dégénérescence de certains neurones) mutée (A53T) ou d’injection de fibrilles synthétiques d’alpha-synucléine, formes toxiques de la synucléine, qui serait une des causes de la mort des neurones dopaminergiques et des problèmes moteurs conséquents. L’accumulation d’alpha-synucléine n’est étudiée que post-mortem chez l’animal.Les objectifs sont doubles : 1/ Tout d’abord la création d’un modèle de surexpression de l’alpha-synucléine mutée couplée à la production de la NanoLuc, protéine traçable in vivo au cours du temps et qui permettra le suivi de l’évolution du syndrome pathologique. Pour cette approche in vivo, nous comparerons la souche C57Bl6 et son équivalent albinos pour s'affranchir de la pigmentation de la peau. 2/ En plus de cette évolution pour ce modèle, nous souhaitons aussi améliorer l'infection et la transduction des virus dans les neurones dans le cerveau chez la souris, en affinant la méthode d’injection intracérébrale (grâce à l'utilisation de fibroine, comme protéine facilitante).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus, sont : La création d’un modèle de surexpression de l’alpha-synucléine mutée couplée à la production d’une protéine traçable in vivo au cours du temps, ce qui permettra le suivi de l’évolution du syndrome pathologique à différents temps et sans sacrifier les animaux, ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches. L’amélioration de l'infection et de la transduction des virus dans les neurones dans le cerveau chez la souris, en affinant la méthode d’injection intracérébrale.

Procédures

Chirurgie stéréotaxique : 30 minutes par animal, une seule fois dans l'étude, sous anesthésie gazeuse et couverture analgésique. Imagerie in vivo : 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Deux sessions de comportement classique non invasif, durée 2H à 10 semaines et 20 semaines postchirurgie. Nuisances dues au transport entre les deux animalerie pour les souris qui suivront l'imagerie in vivo.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux.

Devenir

Les animaux (sauf ceux qui sont transférés pour l'imagerie) sont mis à mort à la fin de chaque étude afin de réaliser une étude histologique et biochimique du tissu cérébral.

Remplacement

Nous souhaitons améliorer un modèle du laboratoire, en optimisant la transduction virale et ainsi l’expression des formes pathologiques de synucléine. Nous avons besoin d’un modèle intégré ce qui n’est pas le cas avec des alternatives comme la culture cellulaire. En amont de nos expériences in vivo, le matériel biologique virus, fibroine..etc est testé en culture cellualire afin de valider leur efficacité, de déterminer les concentrations nécessaires et de valider un protocole expérimental correct.

Réduction

Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Le développement de modèles avec un suivi en bioluminescence qui est non invasif pour les animaux, permet des études longitudinales et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés soit par la peau du dos soit dans des tubes, afin de ne pas les manipuler par la queue. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'aseptie pendant la période opératoire. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement decrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques, elles reçoivent pendant vingt-huit jours deux médicaments par gavage, avec incision de la veine de la queue pour mesurer la glycémie et échocardiographie sous anesthésie, pour tester une association contre la néphropathie diabétique. Le porteur indique que le diabète expose les animaux à un risque de déshydratation et d'hypothermie, pris en charge par du sérum et un tapis chauffant. Il juge "indispensable" de travailler sur un "organisme vivant en entier" et présente l'effet bénéfique de l'association au conditionnel.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) consiste essentiellement en l’amélioration du contrôle glycémique, la réduction du risque cardiovasculaire, un meilleur contrôle de la pression artérielle, l'inhibition du système rénine-angiotensine (SRA) et plus récemment, l’inhibition du cotransporteur sodium-glucose de type 2 (SGLT2). Les patients présentant une ND sont de plus en plus fréquemment soumis à un double traitement composé d’un bloqueur du SRA associé à un inhibiteur SGLT2. Toutefois, bien que cette approche soit efficace, la progression de la ND n’est freinée que dans 39% des cas. Cela démontre que les traitements actuels ne sont pas optimums et que les efforts de recherche doivent s’intensifier afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable. Ainsi, nous étudierons les effets combinés du bloqueur CB1R INV202 et l’inhibiteur SGLT2 Empaglifozine dans deux modèles de souris diabétique de type 2 présentant les principaux symptômes retrouvés au cours de la pathologie humaine dont la perte de fonction glomérulaire, le développement de fibrose ou encore la présence d'une forte inflammation. L’objectif secondaire sera de déterminer si cette approche pharmacologique entraîne une amélioration de la fonction cardiaque particulièrement impactée par la présence d’un diabète non ou mal contrôlé. Cet aspect se fera de manière non-invasive via la technique d’échocardiographie.

Bénéfices attendus

Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. En effet, selon les derniers chiffres de l’atlas de la Fédération Internationale du Diabète, le nombre d’adultes souffrant de diabète dans le monde est passé de 151 millions en 2000 à 463 millions en 2019. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu qu’une fois, après 9 semaines de régime afin de sélectionner les souris diabétiques. Les souris seront anesthésiées puis rasées sur le ventre afin de procéder à une échocardiographie avant et après traitement pharmacologique. L’ensemble de la mesure se fait en 45 minutes maximum. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Dans ce projet, nous allons utiliser des souris diabétiques. Les procédures prévues dans ce projet ne provoqueront pas de contraintes indues. Toutefois, le diabète pouvant conduire à un risque accru de déshydratation et d’hypothermie, nous opérerons un suivi quotidien des animaux afin de détecter tout dommage imprévu et ainsi intervenir pour soulager/abréger toute souffrance. Ainsi, les cages seront posées sur des tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie et en cas de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Enfin, les souris diabétiques sont susceptibles de développer une polyurie marquée, nécessitant un changement de litière plus fréquent. Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empaglifozine ou INV202+Empaglifozinee de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte.

Raffinement

Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 5 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. A 9 semaines, les animaux seront soumis à un régime riche en protéines pour une durée de 9 semaines dont les 4 dernières correspondront aux interventions pharmacologiques. Cette intervention commencera donc lorsque les animaux auront 14 semaines et se terminera à l’âge 18 semaines. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète de type 2 et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte. Pour une raison de coût financier, les animaux seront commandés à l’âge de 4-5 semaines et seront hébergés dans notre animalerie en attendant d’avoir 9 semaines d’âge.

112 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, tous les deux jours pendant six mois, des composés censés limiter les protéines anormales de la maladie d'Alzheimer, puis subissent trois tests de mémoire, spatiale, d'association entre contexte et émotion et de reconnaissance d'objet, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'administration par le nez peut induire un stress et une détresse respiratoire. Il décrit l'utilisation de ces animaux comme "indispensable" et conclut que l'effet sur la mémoire ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours, sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.

Impact sur les animaux

L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.

Remplacement

Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).

Raffinement

Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues hyperthyroïdiennes par leur eau de boisson pendant dix-huit semaines, elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau puis neuf injections de chimiothérapie, pour mesurer l'effet des hormones thyroïdiennes sur l'efficacité du traitement. Le porteur indique que la chimiothérapie peut provoquer des diarrhées et du sang dans les selles, les manipulations se faisant sur animal vigile. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que dans un "organisme complet" et juge l'animal "absolument nécessaire", les retombées pour les patients restant hypothétiques.

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des Hormones Thyroïdiennes (HT) sur la croissance de tumeurs chez la souris lorsqu’un traitement par chimiothérapie est mis en place. La chimiothérapie est l’un des traitements majeurs mis en place pour combattre le cancer. Elle vise à éliminer les cellules cancéreuses quel que soit l’endroit où elles se trouvent dans le corps. Nous savons par nos travaux antérieurs que les HT influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous souhaitons étudier maintenant si ce taux d’HT influe également sur l’efficacité de la chimiothérapie. Pour cela, nous utiliserons des souris hyperthyroïdiennes (avec un niveau d’HT plus élevé que la normale) auxquelles nous grefferont des cellules cancéreuses. Une fois que les tumeurs se seront développées, ces souris recevront une chimiothérapie. Nous pourrons alors étudier l’impact des HT sur le développement des tumeurs et estimer si les HT ont un impact sur l’efficacité de la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Des patients atteints de cancers colorectaux se retrouvent dans une situation d’hyperthyroïdie. Nous savons qu’il existe un lien entre les HT et le développent tumoral. SI cet effet est caractérisé et mieux compris, les traitements pourront être mieux adaptés pour les patients.

Procédures

Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 18 semaines. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure. Cette hyperthyroïdie induit des modifications physiologiques légères, en particulier une tendance à une légère hyperthermie. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes. La chimiothérapie peut provoquer des effets secondaires comme des diarrhées et du sang dans les selles. Les manipulations se feront sur animal vigile.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but est de mener des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes) afin d'évaluer l'impact des hormones thyroïdiennes lors d'une chimiothérapie.

Remplacement

Un travail en amont a été réalisé in vitro sur les cellules cancéreuses utilisées dans ce projet. A présent, il s'agit d'étudier l'impact des hormones thyroïdiennes et leur effet sur un traitement de chimiothérapie. Pour cela, ces cellules cancéreuses doivent être implantées dans un organisme afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles les tumeurs se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris, de par leur statut immunodéficient, seront hébergées en groupes sociaux dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux seront commandés chez un fournisseur et à leur arrivée au laboratoire, ils bénéficieront d’une période d’acclimatation pour leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Une habituation à la manipulation sera également réalisée après cette période d’acclimatation. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, taille des tumeurs) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Dans notre projet, l'étude de l'effet des hormones thyroïdiennes (HT) sur le développement de tumeurs cancéreuses et l’étude de l'impact de ces hormones lors d'un traitement de chimiothérapie ne peuvent se faire que dans des organismes complets. La culture sur cellules ne permet pas d'étudier la totalité des mécanismes ni d'évaluer l'efficacité d'un traitement et ses effets. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte.