Souris
Rôle du mycobiote dans l’homéostasie et l’inflammation intestinale dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur provoque chez elles une inflammation intestinale par le dextran sulfate de sodium ou l'indométacine, se traduisant par des diarrhées et du sang dans les selles, après des gavages quotidiens de micro-organismes. Toutes sont euthanasiées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas l'écosystème intestinal et que le recours à la souris est "indispensable".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre les rôles des différents acteurs entrant en communication dans l'écosystème intestinal : l'hôte (par l'intermédiaire de son système immunitaire), le microbiote bactérien et le microbiote fongique (mycobiote). Pour cela nous souhaitons évaluer l'impact de la modulation d'un ou plusieurs de ces acteurs sur l'équilibre et l'inflammation intestinale. Dans le cadre de notre projet, nous utiliserons des souris ayant des mutations sur des récepteurs immunitaires impliqués dans la reconnaissance du microbiote fongique (notamment les récepteurs Dectin1 et 2, Card9). Grâce à ces souris, nous pourrons approfondir les connaissances sur l'impact du microbiote sur l'inflammation intestinale (comme observée chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique). A l'aide de procédures d'administration de traitements microbiens et antimicrobiens et d'induction d'inflammation, nous pourrons modifier le microbiote et observer l'effet d'une telle modification sur l'évolution de l'inflammation intestinale. Ces recherches nous permettront de participer à l'élaboration de nouvelles voies thérapeutiques pour traiter les personnes atteintes de maladies inflammatoires de l'intestin.
Bénéfices attendus
Grâce à ces recherches, la découverte de souches fongiques bénéfiques ou néfastes pour l'homéostasie intestinale pourrait conduire à l'élaboration de nouvelles pistes thérapeutiques à base de probiotiques fongiques ou de traitements anti-fongiques ciblés pour traiter les pathologies inflammatoires intestinales.
Procédures
Lors de certaines procédures, les animaux recevront des micro-organismes administrés par gavage par voie orale. Ces administrations seront quotidiennes sur toute la durée de l'expérimentation (de 7 à 21 jours, en fonction de la procédure). Des prélèvements de fèces seront effectués aux points clés de la procédure (2 fèces par souris). Durant les procédures impliquant une inflammation intestinale, chaque procédure étudiera l'effet de traitements différents induisant des inflammations aux mécanismes spécifiques, dans le but de reproduire les symptômes de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, observées chez l'humain. L'induction d'une inflammation intestinale par traitement chimique au dextran sodium sulfate (DSS) afin d'établir un modele d'inflammation qui nous rapproche de celle observée chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de recto-colite hémorragique, et l'induction d'une inflammation intestinale par administration d'un traitement anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), l’indométacine. Les AINS modifient le système immunitaire et participent a l'apparition d'une inflammation intestinale chez certains individus. Le traitement au DSS durera 7 jours, tandis que le traitement à l'indométacine durera 5 jours. Nous effectuerons les prélèvements de fèces dans la matinée (les souris ayant été actives et ayant consommé de la nourriture durant la nuit, leur transit intestinal est plus rapide le matin). Pour cela nous isolons chaque souris durant quelques minutes (5 minutes généralement), nous récupérons deux fèces au maximum puis nous replaçons la souris en cage.
Impact sur les animaux
L'inflammation intestinale provoquée chez les animaux dans nos différents modèles induiront une douleur légère à modérée. Lors de ces procédures, les animaux seront soumis à une inflammation intestinale qui se caractérise par une modification du transit intestinal avec apparition de diarrhée et ponctuellement de sang dans les selles. Aucune autre nuisance n'est associée à ce projet.
Devenir
La fin de chaque procédure nécessite de prélever différents organes afin d'effectuer nos analyses, et donc d'euthanasier tous les animaux.
Remplacement
Les modèles in vitro ne parviennent pas à reproduire l'écosystème intestinal complexe que nous cherchons à étudier. En effet, les interactions entre les différentes populations cellulaires de l'hôte, le microbiote intestinal, mais également les facteurs génétiques, sont des éléments indivisibles lorsque l'inflammation intestinale est étudiée, rendant indispensable l'utilisation de modèles animaux dans nos recherches.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure, nous avons calculé, grâce à des calculs statistiques, le nombre de souris minimum dont nous aurons besoin pour nous assurer des résultats interprétables. Basés sur un paramètre clé nous permettant de valider une expérimentation, ces calculs statistiques nous ont permis de déterminer que chaque groupe doit être constitué de 20 animaux pour chaque procédure. Nous avons choisi d’effectuer deux expérimentations indépendantes et donc d’utiliser 10 animaux par groupe pour chaque expérimentation.
Raffinement
L'état de santé des animaux est un point crucial lors des procédures, c'est pourquoi une attention particulière y sera apportée pour respecter le bien-être animal. Un enrichissement du milieu de vie des animaux sera réalisé ave des cages supplémentées de cellulose et d'abris. Enfin, les animaux seront hébergés en groupe dans les cages, en nombre adapté à l'espace disponible dans la cage (5 animaux maximum pour une cage de 370cm² par exemple) et feront l'objet d'un suivi et d'une observation quotidiens par un personnel compétent et formé afin de détecter tout signe de souffrance animale. Ainsi, les animaux seront immediatement euthanasiés si l'un de ces critères est observé : immobilité de l'animal, perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids en début d'expérimentation, poil hirsute.
Choix des espèces
Notre projet implique l'étude des interactions hôte/microbiote. Ce type d'interaction complexe nécessite un modèle présentant un système immunitaire et des voies de signalisation proches de ce qui est observé chez l'humain. Le modèle murin est un modèle de référence pour étudier l'inflammation intestinale et présente une homologie avec l'humain sur plusieurs niveaux. Dans notre cas, c'est-à-dire les pathologies intestinales, de nombreuses données bibliographiques démontrent que ce modèle rentre en adéquation avec le type de recherche que nous souhaitons effectuer. De plus, l'utilisation du modèle murin offre une plus grande disponibilité de mutation de gènes associés aux récepteurs immunitaires. Toutes nos expérimentations utiliseront des souris âgées de 6 à 8 semaines, âge correspondant à la période où le système immunitaire est mature et fonctionnel.
Evaluation de l’efficacite et de la toxicologie des cellules T regulatrices genetiquement modifiees
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Le porteur leur injecte des cellules T humaines génétiquement modifiées, leur inflige jusqu'à trente prélèvements sanguins rétro-orbitaux et, pour une partie, une greffe de peau, avec le développement attendu d'une réaction du greffon contre l'hôte provoquant une inflammation sévère et une perte de poids. Toutes sont euthanasiées pour analyse, certaines souris conditionnées mais non injectées servant d'abord à "maintenir les compétences" du personnel. Il affirme qu'un modèle de souris humanisée est le plus pertinent pour évaluer ces cellules avant les premiers essais chez l'humain.
Objectifs
Les objectifs du projet sont : 1) vérifier l'impact des cellules Natural killer (NK) sur la persistance des cellules T régulatrices en présence ou non de traitement concomitant 2) l'efficacité des cellules T régulatrices génétiquement modifiées dans des modèles de transplantation (GvHD et transplantation de peau) 3) vérifier la distribution et l'innocuité du produit dans un modèle de souris humanisées relevant par bioluminescence
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont: 1) détermination de la dose à injecter aux patients pour obtenir une efficacité thérapeutique 2) obtenir des données précliniques d'efficacité thérapeutique du produit 3) obtenir des données de sécurité/innocuité du produit thérapeutique avant les premiers tests chez l'humain
Procédures
Les prélèvements de sang se font par voir rétro-orbitale sous anesthésie locale. Nous prélèverons 100uL de sang toutes les semaines jusqu'à semaine 6 à partir de Jour7 après injection des cellules (6 prélèvements) puis le cas échéant une fois toutes les 2 semaines jusqu'à semaine 15 (9 prélèvements) et enfin 1 prélèvement une fois par mois jusqu'à semaine 30 (15 prélèvements) soit au total 30 prélèvements si l'expérience dure jusqu'à semaine 30. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2 minutes/souris maximum. Pour la procédure de greffe de peau, les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et traitement anti-douleur. La douleur des animaux sera atténuée par une injection de buprénorphine. L'intervention chirurgicale dure environ 1heure mais nous surveillerons les souris jusqu' à leur réveil complet (durée de l'intervention: 2 heures maximum)
Impact sur les animaux
Développement de signes de Graft versus Host Disease (GvHD) (perte de poids, pilo-érection, prostration...) qui est une réaction immunitaire du greffon contre l'hôte, entraînant une inflammation sévère.
Devenir
Tous les animaux qui ont reçu une injection de cellules seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour l'analyse ex-vivo Les animaux qui ont été conditionnés au busulfan mais n'ayant pas reçu de cellules (le nombre de cellules peut ne pas être suffisant en fonction de leur expansion in vitro qui peut être variable d'un donneur à un autre) pourront être utilisés pour le maintien des compétences du personnel puis euthanasiés
Remplacement
De nombreux tests in vitro permettant une sélection importante de nos cellules seront effectués afin de valider leur qualité et leur efficacité avant les tests in vivo
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents. Nous prévoyons 3 expériences mais si les 2 premières expériences donnent le même résultat, la 3eme sera annulée pour réduire le nombre de souris utilisé. Utilisation de la bioluminescence pour déterminer le temps de mise à mort et ainsi réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Pour les actes de prélèvement invasifs comme les prélèvements sanguins, nous utiliserons un anesthésique local pour limiter la douleur. Les actes de chirurgie seront faits sous anesthésie générale avec administration de produits analgésiant et anti-douleur jusqu'à la prise de greffe et rétablissement de l'animal. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Pour les souris qui recevront une greffe de peau, nous réduirons le nombre de souris par cage de 6 à 4 animaux.
Choix des espèces
Nous avons développé des méthodes permettant de modifier génétiquement les cellules humaines et en particulier les cellules T régulatrices (Tregs). Afin de pouvoir estimer l'efficacité, l'innocuité et la persistance de ces Tregs humains, nous devons utiliser un modèle murin humanisé le plus relevant possible. Un tel modèle n'existe que chez la souris et permet l'analyse de la biologie des cellules humaines in vivo. Souris adultes de 8 à 12 semaines pour leur poids relativement stable en fin de croissance, pour la facilité de manipulation, de prélèvement et d'analyses d'échantillons, d'évaluation physique (bien-être) Pour les souris NSG/NXG et HLA-A2 NSG reconstituées par des cellules CD34+ (huNSG, huHLA-A2 NSG) chez Jax Labs ou Janvier labs (huNXG), seules des souris de plus de 12 semaines sont disponibles car c'est le temps nécessaire pour que les cellules CD34+ se greffent et se différencient en cellules immunes matures.
Analyse des cellules Bêta du pancréas dans le cas de diabète
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur leur administre du tamoxifène pour induire une mutation dans les cellules bêta du pancréas, puis les soumet à une thoracotomie et une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde, sans réveil. Il précise que la mutation ne provoque ni diabète ni tumeur aux stades étudiés et que les analyses sont post-mortem. Il affirme que ses souris transgéniques sont les seules à permettre une telle étude représentative de la pathologie humaine.
Objectifs
Chez l’homme, la mutation d'un régulateur de l'expression d'un gène pancréatique cause le développement d’un diabète ou/et d’insulinome (tumeur). Ceci démontre que ce facteur est un acteur clef de ces pathologies. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans l’apparition de ces maladies, le laboratoire a généré une souris transgénique représentative de la mutation de ces patients. Cette souris est porteuse de la mutation dans toutes ses cellules (modèle A). Nous avons également généré une variante de cette souris, dans laquelle la mutation étudiée est inductible spécifiquement dans les cellules bêta suite à l’injection d’une molécule particulière (Modèle B). Les cellules bêta sont les cellules du pancréas qui sécrètent de l’insuline, une hormone qui régule les niveaux de glucose dans le sang. Sur la base de la littérature, nous pensons que la masse de cellules bêta pourrait être perturbée chez nos animaux mutants. Nous allons donc utiliser une technique qui nous permettra de visualiser et mesurer la quantité de cellules bêta. Une altération de la masse de cellules bêta pourrait être associée à un diabète et une quantité excessive pourrait être liée à un insulinome. Ces expériences nous permettront ainsi de mieux comprendre le diabète et les insulinomes chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet constitue une méthode innovante pour visualiser les îlots de Langerhans (cellules endocrines) dans le pancréas entier. Il permettra notamment de quantifier la masse totale de cellules bêta productrices d’insuline, en fonction de la présence d’un allèle sauvage ou d’une forme mutée du facteur de transcription pancréatique étudié. Les conclusions apportées par ce projet permettront de mieux comprendre l’implication de ce facteur dans le développement d’un diabète ou d’un insulinome (tumeur du pancréas endocrine) chez les patients porteurs de telles mutations. A ce jour, on ne connaît pas de drogue capable de moduler la voie de signalisation étudiée. Nous espérons qu’à l’avenir, nos travaux permettront de développer de nouveaux traitements du diabète et de l’insulinome.
Procédures
Les animaux vigiles recevront 1 injection intrapéritonéale ou 1 administration par voie orale de tamoxifène. Tous les animaux profondément anesthésiés subiront ensuite une procédure sans réveil (perfusion par voie intracardiaque (durée de l’anesthésie
Impact sur les animaux
Les mutations induites suite à l’injection d’une molécule particulière (tamoxifène) n’induisent pas de diabète ou d’insulinome chez nos souris aux stades étudiés. Nous souhaitons toutefois analyser en profondeur les changements des cellules bêta au niveau histologique et génétique (analyses post-mortem). Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s’arrêteront en fin de chirurgie (sans réveil)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les effets de la mutation étudiée ont déjà été décrits au laboratoire. Pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses in silico lors de comparaisons transcriptomiques. Nous souhaitons analyser les effets de la mutation du facteur étudié sur la masse et la biologie des cellules bêta. Les souris transgéniques sont les seules permettant une telle analyse représentative de la pathologie humaine.
Réduction
Une première étape de mise au point expérimentale sera réalisée sur un nombre restreint d’animaux Nous analyserons ensuite un minimum d’animaux. Si la significativité est atteinte avec ce nombre, nous stopperons ces expériences. Cela permettrait de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux injectés au tamoxifène seront observés de façon hebdomadaire, de manière à surveiller l'état général de la souris. Nous n’avons pas observé de diabète ou d’insulinome chez ces animaux aux stades étudiés. Néanmoins, une grille de score sera utilisée afin d’avoir un suivi objectif des animaux. Au moindre signe de mal-être, les souris seront euthanasiées. Lors de la thoracotomie les animaux seront anesthésiés profondément avec une prise en charge de la douleur. Pour limiter la douleur, les contentions sont douces et la perfusion intra-cardiaque ne se fait que lorsque les animaux sont anesthésiés et complètement insensibles à la douleur (test de sensibilité par pincement au niveau des espaces interdigités des postérieurs). Nous utiliserons à la fois des antalgiques et des anesthésiques pour limiter la douleur.
Choix des espèces
Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier les effets des mutations étudiées. La souris constitue de par son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, un modèle de choix pour mener nos expériences. Les animaux seront analysés à 3 stades adultes : 3 mois, 12 mois et 24 mois, représentants différents stades du vieillissement de la souris. Par ailleurs, on sait que ce type de phénotype lié aux cellules bêta est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris. De plus, nous nous intéressons à la senescence des cellules bêta, qui pourrait être liée au vieillissement.
Effets d’une exposition périnatale à l’acide perfluorooctanesulfonique (ou PFOS) sur la physiologie de la myéline
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
70 souris, dont dix femelles gestantes et leurs petits, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur expose les mères à un polluant perfluoré, le PFOS, dans l'eau de boisson de la gestation au sevrage, puis euthanasie tous les souriceaux à 21 jours pour prélever leurs tissus. Il indique n'attendre aucune souffrance notable et s'appuie sur des données non publiées chez le rat. Il justifie le passage à la souris in vivo par les limites de ses précédents modèles ex vivo et sur têtard de xénope.
Objectifs
Depuis une trentaine d'années, l'incidence de la sclérose en plaques (SEP) est en constante augmentation dans les pays développés. Des facteurs environnementaux sont suspectés de favoriser le développement et/ou la progression de la SEP. Notre hypothèse centrale est qu'une exposition à des perturbateurs endocriniens, notamment les retardateurs de flammes que nous retrouvons dans notre environnement quotidien (revêtement des poeles, vêtements déperlants...) comme les fluorofactants, peut interférer avec le processus de formation de la myéline. En particulier, ces polluants chimiques étant liposolubles, notre hypothèse de travail est qu'ils s'accumulent dans les structures riches en lipides, comme la myéline, et destabilisent ainsi sa structure et sa fonctionnalité. Ce projet vise à comprendre dans quelle mesure certains perturbateurs endocriniens auxquels nous sommes tous exposés, les perfluorés (PFOS), affecte l’intégrité de la membrane myélinique. Il s'agit de la première étude visant à montrer un lien entre une exposition environnementale à un polluant chimique de type perturbateur endocrinien et la formation de la myéline. Ainsi, nous souhaitons explorer le rôle de l’acide perfluorooctanesulfonique ou PFOS dans la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires (OPCs) et la myélinisation chez le jeune souriceau. Pour ce faire, nous déterminerons les effets cellulaires au sein de la zone sous-ventriculaire, niche neurogénique majeure chez les mammifères pour la production d'OPCs. De plus, nous déterminerons si les PFOS s'accumulent dans les faisceaux de substance blanche et altère la composition en lipides de la membrane myélinique par des expériences innovantes d'imagerie par spectroscopie de masse. Les résultats de cette étude pilote devraient aboutir à un faisceau d'arguments visant à soutenir l'hypothèse d'un lien entre une exposition développementale à certains perturbateurs endocriniens et la génération de cellules myélinisante
Bénéfices attendus
Cette approche in vivo menée chez la souris postnatale viendra compléter nos données récemment obtenues à l’aide de modèle ex vivo chez la souris (neurosphères, explants de cervelet) et in vivo chez le têtard de xénope. Plus largement, notre projet démontrera (ou non) si une exposition environnementale pendant le développement - à certains perturbateurs endocriniens, comme les perfluorés -modifie le profile lipidique de la membrane myélinique et la fragilise. Les bénéfices de cette étude pilote sont doubles : (i) une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires aboutissant à la production d'oligodendrocytes matures, processus susceptibles d'être affectés par les perfluorés chez tous les mammifères, y compris chez l'homme et (ii) l'apport d'une nouvelle voie d'étude témoignant du rôle néfaste des polluants environnementaux - auxquels nous sommes tous exposés tout au long de la vie - sur la stabilité de la myéline qui pourrait ainsi expliquer l'augmentation des cas de SEP via l'inhibition de la capacité à générer une myéline fonctionnelle.
Procédures
Les femelles recevront la molécule dans l'eau de boisson à partir du 15eme jour de gestation jusqu'au sevrage de la portée , les petits seront exposés in utero et lors de la lactation (de E15 à P21). A P21, tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement.
Impact sur les animaux
Notre procédure unique soumise ici dans le cadre de ce projet pilote est considéré comme légère. Les animaux seront étroitement surveillés. Le poids des nouveau-nés sera suivi 2-3 fois par semaine. Si trop d’effets négatifs sont observés (prostration, non-alimentation, blessure), l’animal sera euthanasié et retiré du groupe expérimental. Cependant, cette expérience ne devrait pas induire de souffrance ou d'effets néfastes ni sur la femelle en gestation/lactation ni sur les petits jusqu'au stade de 21 jours après la naissance. Dans le cadre du projet européen ENDpoiNTs , auxquels nous participons , notre collaborateur a récolté un ensemble de données (pas encore publiées) chez le rat montrant que des doses orales de la molécule utilisée en dessous de 2mg/kg bw sont bien tolérées par l’animal, notamment sans conséquences délétères en période néonatale. De plus, un ensemble de publications confirme également l’absence de problèmes chez les rongeurs en période postnatale pour des doses autour de 2mg/kg bw, donné soit dans le régime alimentaire, soit dans l’eau de boisson, soit par gavage. Les dommages attendus sont donc réellement réduits. Les femelles gestantes seront regroupées par 2 ou 3 par cage. De plus, ne sachant pas si le PFOS modifie le goût de l’eau, la quantité d’eau absorbée par les mères gestantes et en lactation sera mesurée en pesant 2 à 3 fois par semaine les biberons. Ainsi, la prise hydrique des animaux exposés à la molécule pourra être comparée aux animaux contrôles. Cependant, aucun changement dans la consommation hydrique n’est attendue. En effet, une précédente étude menée chez la rate a montré que la consommation d’eau ne différait pas entre les animaux contrôles et traités.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Dans une étude antérieure récente, nous avons accumulé des données à l'aide de modèles ex vivo (culture chez la souris) et in vivo (tétard de xénope) afin de répondre à un effort de remplacement et de réduction. Cependant, la nouvelle question qui découle de nos résultats prometteurs - obtenus par ces approches - nous incite à utiliser le modèle murin in vivo afin de reproduire au mieux les conditions d'une exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens lors de la période périnatale et d'examiner les conséquences sur la physiologie de la myéline. Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d'oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l'accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Par ailleurs, le modèle du tétard de xénope a permis de montrer un effet de cette molécule sur la remyélinisation au niveau du nerf optique. En revanche, nous souhaitons étudier en amont les mécanismes cellulaires à l'origine de la génération de nouveaux précurseurs oligodendrocytaires. Pour ce faire, nous nous focalisons sur la zone sous-ventriculaire chez la souris où sont concentrées les cellules souches neurales à l'origine des OPCs. Cette niche est parfaitement définie en terme de types cellulaires chez la souris, contrairement au xénope. De plus, la composition en lipides n'est pas connue chez le xénope alors qu'elle est parfaitement définie chez la souris. Or, nous voulons étudier l'influence d'une accumulation potentielle du perturbateur sur le profil lipidomique. Ceci nous pousse à explorer le lipidome chez la souris. Nous souhaitons ainsi étudier l'influence des perfluorés sur le choix du destin cellulaire des cellules souches neurales et a fortiori sur la génération des précuseurs oligodendrocytaires qui migrent ensuite dans le corps calleux où ils se différentient en oligodendrocytes myélinisants. Ce modèle in vivo nous permettra d'étudier l'impact des perfluorés sur toutes les étapes du lignage oligodendrocytaire, de la cellule souche à l'oligodendrocyte mature.
Réduction
Avec notre approche ex vivo précédemment décrite, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés afin de répondre à notre question première, celle des effets des perfluorés sur la génération d'oligodendrocytes myélinisants et la remyélinisation. Désormais, nous devons valider in vivo chez la souris nos résultats car nos précédents modèles ex vivo ne nous permettent pas de répondre à la problématique de l'accumulation des perfluorés dans la substance blanche ni de ses conséquences sur la stabilité de la myéline. Nous avons volontairement restreint le nombre d'animaux utilisés dans ce projet afin de s'en tenir au strict minimum pour obtenir rapidement des résultats préliminaires qui devraient nous conforter dans notre hypothèse, à savoir que les PFOS, de part leur propriété hydrophobe et liposoluble, s’accumulent dans la gaine de myéline, structure riche en lipides. Ainsi, la membrane myélinique serait modifiée en sa composition lipidiques ce qui pourrait entraîner une déstabilisation de celle-ci, favorisant ainsi sa vulnérabilité. Au cours d’une précédente expérience, nous avons exposé des mères gestantes (de E15 à P21) à un autre perturbateur endocrinien, le bisphénol F. Les résultats ont mis en évidence qu’un nombre de 8 souriceaux par groupe était nécessaire et suffisant pour obtenir des données statistiques significatives et robustes. Dans l'actuelle procédure, nous estimons donc à 8 le nombre de souris par condition (contrôle versus PFOS). Trois expériences seront réalisées à l'issu de cette procédure, chacune composée de 8 animaux contrôlés et 8 animaux traités. Cependant, compte tenu que le nombre de petits par portée pour les souris C57bL/6 n'est pas prédictible à l'avance (en moyenne 5 à 6 petits), nous préférons envisager une marge de 20% pour le calcul du nombre de petits afinde pallier cette variabilité. Ainsi nous augmentons notre besoin à 10 souris P21 par groupe et donc 10 femelles gestantes, soit 70 animaux au total.
Raffinement
Les indicateurs comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissage est vérifiée par les animaliers), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) sont particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varie de manière significative, l’animal est dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Comme déjà mentionné, nous ne nous attendons pas à un phénotype sévère. Cependant, il n'est pas à exclure que des cas isolés réagissent plus fortement au traitement. En particulier, pour les nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au suivi hebdomadaire du poids. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie. Les femelles gestantes et en lactation seront placées par 2 ou 3 par cage. Elles ne seront donc pas isolées et garderont ainsi des contacts sociaux. De plus, les femelles pourront s’entraider durant la lactation et ce, jusqu’au sevrage des petits. Durant toute la durée du traitement (de E15 à P21), l’environnement des animaux sera enrichi à l’aide de papier kraft et d’une maisonnette en carton. Les femelles pourront également construire leur nid avec du coton.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). Ce choix est dicté par plusieurs raisons -théoriques : la souris étant l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale, les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques et comportementaux impliqués dans le maintien de la balance énergétique et le vieillissement. Par ailleurs, l’utilisation des outils de séquençage à haut débit a permis un assemblage complet du génome de la souris, constituant un outil essentiel dans la détermination des gènes impliqués dans les processus étudiés. Pratiques : étant de petite taille, la souris est un modèle facile à maintenir en animalerie, avec un taux de reproduction élevé. Par ailleurs, tous les protocoles utilisés dans les projets de recherche ont été optimisés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. La souche C57bL/6 est notre souche de référence. La procédure sera réalisée sur des souris à P21 afin d'étudier les effets à court terme d’une exposition périnatale à un perturbateur endrocrinien sur la physiologie de la myéline. 60 nouveau-nés sont prévus afin de réaliser trois analyses pilotes post-mortem faisant appel à des expériences d'immunohistochimie, d’imagerie par spectrométrie de masse et d'analyses lipidomiques par spectrométrie de masse après extraction de la myéline. De plus, la procédure fait appel à de jeunes femelles gestantes afin de générer les nouveau-nés impliqués dans la procédure. Au sein d’un même cage, deux à trois femelles gestantes seront exposées soit à l’eau de boisson standard soit à l’eau supplémentée avec le perturbateur. A P21, les animaux d’une même condition (contrôle versus traité) seront sexés puis divisés en 3 groupes (chaque groupe correspondant à une expérience). Pour chaque condition expérimentale, nous attendons 30 souriceaux. Ainsi, les 30 souriceaux issus des 5 femelles contrôle ou traitées seront mélangés et répartis en 3 groupes selon leur poids et leur développement, le but étant d’avoir trois groupes expérimentaux homogènes. Dans cette procédure, nous débuterons l’exposition des embryons à E15, juste avant que le système endocrinien du souriceau ne devienne autonome. Les souriceaux seront exposés jusqu’à P21, stade post-développemental où la myélinisation est maximale.
Identifier les cellules progénitrices dans le rein adulte
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les traite à la doxycycline pour forcer la surexpression de la télomérase dans le rein, ce qui provoque une protéinurie élevée, le traitement étant interrompu avant l'insuffisance rénale mortelle qu'entraînerait sa poursuite. Les souris sont ensuite mises à mort par dislocation cervicale ou sans réveil, à divers délais, pour prélever les reins. Il affirme que seuls les modèles animaux permettent d'étudier la régénération d'un organe "dans son ensemble".
Objectifs
L'épithélium rénal assure des fonctions structurales et métaboliques cruciales qui permettent de filtrer le plasma sanguin afin d'éliminer les déchets de l'organisme dans les urines. L'ultrafiltration rénale dépend de l'intégrité de cellules épithéliales du glomérule rénal nommées podocytes. Ces cellules hautement spécialisées sont lésées chez 90% des patients souffrant de maladies chroniques rénales et leur faible capacité de régénération conduit à terme au développement d'insuffisance rénale terminale. Toutefois, des résultats récents montrent qu’une induction forte et transitoire de l’expression de la télomérase dans le rein de souris adulte stimule des cellules progénitrices dans le rein et provoque une régénération efficace des podocytes. Ces données ont été obtenues grâce à l’analyse de souris transgéniques permettant de surexprimer la télomérase de manière contrôlée dans l’organisme adulte. Dans ce projet, nous allons utiliser ce modèle de régénération forcée des podocytes afin de caractériser les cellules progénitrices rénales et définir la trajectoire moléculaire de ces cellules lors du processus de régénération. La complétion du projet présenté ici permettra d’éclaircir les mécanismes responsables du renouvellement de l’épithélium rénal, et fournira des connaissances cruciales pour le développement de stratégies thérapeutiques permettant de traiter les patients atteints de maladies rénales.
Bénéfices attendus
Les résultats générés par ce PEA permettront de caractériser les les cellules progénitrices des podocytes. Suite à ce travail, nous pourrons déterminer si et comment ces cellules sont perturbées dans des modèles de maladie rénale chronique et lors du vieillissement ce qui permettra à terme de tester des approches thérapeutiques innovantes visant à stimuler ou à restaurer la fonction de ces cellules en conditions pathologiques.
Procédures
Les animaux vont être traités à la doxycycline dans l'eau de boisson. Cette eau de boisson est additionnée de sucre afin d'atténuer le goût amer de la doxycycline et de favoriser l'hydratation des animaux. Ce traitement durera 10 à 20 jours (les jours de traitement à la doxycycline sont numérotés de D0 à D20). Le traitement à la doxycycline sera interrompu dès que l’analyse des urines des animaux montre une protéinurie de 10 mg/mL. Ces souris seront alors soumises à une période de récupération (au cours de cette période, les jours sont numérotés de R1 à R20) dont la durée varie en fonction des groupes d'animaux : sacrifice le jour de l’arrêt de la doxycycline (R0), sacrifice 5 jours après arrêt de la doxycycline (R5), sacrifice 8 jours après arrêt de la doxycycline (R8), sacrifice 11 jours après arrêt de la doxycycline (R11), sacrifice 14 jours après arrêt de la doxycycline (R14), sacrifice 17 jours après arrêt de la doxycycline (R17), sacrifice 20 jours après arrêt de la doxycycline (R20).
Impact sur les animaux
Modèle murin employé : souris double transgéniques permettant de surexprimer de manière conditionnelle la télomérase chez la souris adulte. L'expression de la télomérase dans ces souris doubles transgéniques est induite par administration de doxycycline dans l'eau de boisson des animaux. Ces souris sont inductibles et ne présentent pas de phénotype dommageable tant que l’expression du transgène n’est pas induite. Le phénotype engendré par l’induction de la surexpression de la télomérase dans les reins est caractérisé par une protéinurie élevée observable environ 10-20 jours après le début du traitement à la doxycycline. Si la surexpression de la télomérase est maintenue, les animaux développent une insuffisance rénale causant la mort dès 70 jours de traitement. Ici, la surexpression de la télomérase sera interrompue dès que les animaux présentent une protéinurie élevée, environ 10-20 jours après le début du traitement à la doxycycline : un temps suffisant pour stimuler les cellules souches rénales, mais pour lequel les animaux ne montrent pas d'insuffisance rénale pouvant entrainer la mort de l'animal. Nous utiliserons comme animaux témoins, des souris issues des mêmes portées que les souris expérimentales mais qui ne sont pas doubles transgéniques (souris simples transgéniques).
Devenir
Les 48 animaux destinés aux analyses par scRNA-seq seront sacrifiés selon la procédure sans réveil n°2. Les autres animaux de la procédure n°1 seront tous sacrifiés par dislocation cervicale à l’issue de cette procédure expérimentale.
Remplacement
Suite à ce projet, des analyses moléculaires complémentaires seront mises en place sur des cellules en culture in vitro. Cependant, bien que les techniques de culture cellulaire aient fortement évoluées, les études in vitro ne permettent pas d’étudier des processus biologiques complexes. Seuls les modèles animaux permettent d’aborder des questions relatives au fonctionnement d’un organe dans son ensemble. En effet, le processus de régénération des organes est un mécanisme qui résulte d’interactions fines entre plusieurs types cellulaires au sein de l’organe, ainsi qu’entre différentes zones de l’organe. Aussi, par définition, notre objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Aussi, la taille des effectifs a été défini grâce à l'emploi du logiciel G*Power: les groupes sont comparés 2 à 2 (souris expérimentales vs témoins) - Test family t tests - Statistical test Means: difference between two independent means (two groups) - Type of power analysis A priori: Compute required sample size, given alpha, power, and effect size. Dans notre cas, la grandeur de l'effet observé a été calculé sur la base de la pénétrance du phénotype chez les souris expérimentales. Pour un seuil à 0.05, et une puissance de 80%, la taille prédictive des groupes est de 24 (2 x 12 animaux par groupe). Ainsi, pour réaliser ce projet, nous utiliserons un maximum de 216 animaux.
Raffinement
L’évolution de la dysfonction de la filtration rénale sera surveillée étroitement dès le début de la procédure. Aussi, dans le but de limiter l'impact de l’expression forte de la télomérase sur l’état général des animaux, et conformément à la réglementation éthique en vigueur qui impose de mettre en place les mesures permettant d’augmenter autant que possible le bien-être des animaux de laboratoire, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par la procédure expérimentale décrite dans ce projet grâce à l’utilisation d’une grille de score. Cette grille de score est systématiquement ouverte dès le début de la surexpression de la télomérase, et celle-ci est complétée 2 fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. Si un problème est détecté sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permet de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).
Choix des espèces
La réalisation du projet présenté permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur la régulation des processus biologiques impliqués dans l'homéostasie et la régénération des tissus chez le mammifère adulte. Ainsi, la souris apparaît comme un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car elle présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’Homme. De plus, nous proposons dans le cadre de ce projet d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées déjà disponibles au sein de notre animalerie. Les souris représentent un modèle de choix du fait des nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiées déjà générées dans les différents laboratoires permettant de répondre à la question scientifique posée dans le présent projet. Pour ce PEA, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, d’après nos résultats préliminaires, c’est dans cette classe d’âge que la régénération des podocytes est la plus efficace chez les souris i-TERTci.
Exploration des mécanismes responsables du déficit immunitaire humoral associé à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit chez elles une insuffisance rénale chronique, soit par une chirurgie des deux reins en deux temps, soit par un régime enrichi en adénine toxique pour le rein, avant de les immuniser et de leur infliger jusqu'à huit prélèvements sanguins. À la fin, toutes sont mises à mort sous anesthésie pour prélever ganglions, rate et sang. Il affirme que la complexité des mécanismes immunitaires et l'emploi d'une lignée génétiquement modifiée rendent les modèles in vitro insuffisants.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique (IRC) se définit par une diminution de la capacité de filtration des reins, et est une maladie extrémement fréquente (de causes multiples) touchant près de 10% de la population générale. Parmis les complications associées à l'IRC, on observe un profond défaut de réponse immunitaire humorale (capacité à générer des anticorps contre une cible) : cela se traduit par une augmentation de la mortalité infectieuse (100 à 1000x supérieure à celle d'une population non IRC du même âge), et à un défaut de réponse post vaccinale (par exemple, moins de 50% des patients ont une réponse anticorps satisfaisante après 2 doses de vaccin mRNA anti SARS-CoV-2). Cependant, les mécanismes responsables de ce défaut de réponse immunitaire humorale associée à l'IRC restent à ce jour non compris. Dans ce projet, nous souhaitons 1/ Valider dans un 2nd modèle les observations réalisées dans un 1er modèle murin d'IRC dans lequel nous avons identifié certains éléments de dysfonctions de l'immunité humorale. 2/ Determiner à quelle branche du système immunitaire (adaptatif et/ou inné) est du ce défaut de réponse immunitaire humorale.
Bénéfices attendus
Ce projet à pour but d'augmenter la compréhension des mécanismes physiopathologiques responsables du défaut de réponse immunitaire humoral lié à l'IRC, et donc par la suite de dévelloper des thérapeutiques permettant de diminuer le risque infectieux de ces patients et d'améliorer leur réponse vaccinale.
Procédures
Nous induirons l'IRC chez les animaux de 2 manières différentes (procédure 1: chirugie au niveau des 2 reins réalisée en 2 étapes à une semaine d'intervalle sous anesthésie générale et prise en charge de la douleur en pré et post-opératoire / Dans la deuxième procédure, le modèle d'IRC, modèle déjà utilisé dans une précédente étude, est mis place par un régime alimentaire enrichi en adénine pendant 6 semaines pour induire une toxicité rénale. Ces 2 modèles permettent d'induire une maladie rénale de stade modéré). Ces animaux seront ensuite immunisés par une injection sous cutanée réalisée sous anesthésie générale gazeuse (1min). Des prélévements sanguins seront réalisés (1min) sous anesthésie gazeuse, avec une alternance des techniques et des lieux de prélévement afin de limiter leur impact sur l'animal (8 prélévements au total pour la procédure 1 et 6 prélévements au total pour la procédure 2). Enfin, dans la procédure 2, les animaux recevront une injection intraveineuse (1min) après anesthésie générale gazeuse. La durée totale de la procédure 1 est basée sur 2 temps différents après l'immunisation soit 112 jours pour le lot 1 et 54jours pour le lot 2. La durée totale de la procédure 2 est de 45jours
Impact sur les animaux
Concernant le modèle chirurgical, dans de précédentes études, la mortalité était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l'induction d'une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la néphrectomie totale (2° chirurgie). De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Néanmoins, l’état général des animaux sera évalué le soir de la chirurgie, matin et soir pednant les 2 jours suivants puis 5 jours par semaine afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou une angoisse. Concernant le modèle adénine, la mortalité est exceptionnelle. Le régime entraine une perte de poids modérée, et les animaux seront donc suivis cliniquement et pesés 3x par semaines pendant l'ensemble de la procédure. Enfin, bien que les injections intraveineuses et sous cutanées ne soient pas connues pour entrainer d'effet indésirables particuliers, les animaux seront suivis de manière rapprochés et différents points limites ont été fixés qui si ils sont dépassés, entraineront la mise à mort de l'animal concerné.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole afin de permettre le prélévements de différents organes (ganglions, rate, sang) pour permettre des analyses complémentaires dans le but d'identifier et de comtabiliser les différentes cellules du système immunitaire.
Remplacement
Le but de cette étude est de préciser les mécanismes par lesquels l’insuffisance rénale chronique affecte la réponse humorale. La complexité des mécanismes immunologiques en jeu, ainsi que la complexité de l’état d’IRC ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. De plus, ce projet necessite l'emploi d'une lignée génétiquement modifiée permettant de disséquer l'effet de l'IRC sur l'immunité adaptative et innée, ne permettant pas d'être approchée par des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupes expérimentaux dans chaque procédure expérimentale a été calculé a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Ainsi, le nombre d'animaux controle à pu être diminué de moitié dans la procédure 1 compte tenu de l'homogénéité des résultats chez ces animaux. On prévoit cependant la possibilité de répéter une fois les procédures en cas de problème experimental.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sur tapis chauffant (37°C), en condition d'asepsie, sous anesthésie générale médicamenteuse ou gazeuse. Une protection oculaire sera effectuée. L'antalgie sera assurée dans un délai suffisant en pré-opératoire (30min avant la chirurgie) puis pendant 48h matin et soir. Il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant souffrance ou anxiété. Une surveillance rapprochée sera mise en place 2 fois/jour pendant 48h en post-opératoire puis 1 fois par jour 5 jours/semaine et le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole. En post opératoire immédiat, de l'eau gélifiée et de l'alimentation seront mis dans les cages à disposition des souris pour faciliter leur alimentation/hydratation. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale pour permettre un prélèvement de sang total nécessaire aux dosages immunologiques. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place afin d'anticiper toute douleur liée aux protocoles et permettre d'internevir en cas de necessité. Le régime alimentaire enrichi en adénine est bien toléré par les souris. Les animaux seront placés 5/cage afin de garder leurs interactions sociales.
Choix des espèces
Le présent protocole sera conduit sur des souris de 8-10semaines, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme. Enfin, et du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire humorale.
Caractérisation du rôle du recepteur CD169 et des macrophages CD169+ dans l’immunité pulmonaire au cours de l’infection par Mycobacterium tuberculosis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 427 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. La plupart sont infectées par Mycobacterium tuberculosis au moyen d'instillations intranasales et reçoivent de multiples injections, une partie subissant une chirurgie de microscopie du poumon de deux à six heures menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique une possible perte de poids et des altérations respiratoires, avec des expériences de survie prolongées au-delà de cent jours, et justifie la mise à mort par le classement du pathogène en risque biologique de niveau 3. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule l'immunité anti-tuberculeuse et que la microscopie intravitale n'est applicable que chez la souris.
Objectifs
La tuberculose, causée par l’infection respiratoire de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, est la deuxième pathologie infectieuse la plus meurtrière après COVID-19. Cela est partiellement dû à une forte résistance de la bactérie face aux traitements existants. C’est pourquoi dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, il est aujourd’hui important de mieux comprendre les interactions entre le pathogène et l’hôte. Ces interactions incluent notamment les mécanismes par lesquels Mycobacterium tuberculosis parasite les macrophages qui sont à la fois les premières cellules immunitaires impliquées dans la lutte contre le pathogène, mais aussi le principal réservoir cellulaire permettant sa survie. Les macrophages CD169+ (Sialoadhésine, Siglec-1) forment une sous-population de macrophages dans la rate et les ganglions lymphatiques. Dans ces organes, ils sont capables de piéger divers antigènes et d’activer la réponse immunitaire adaptative. Les macrophages CD169+ sont également présents dans les poumons humains, ainsi que dans ceux de macaques et de souris. Cependant, le rôle de ces cellules pulmonaires lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis reste inexploré. Notre projet s’attache à caractériser les fonctions biologiques de CD169, que ce soit en tant que molécule ou en tant que marqueur de sous-populations de macrophages. Il existe dans le poumon deux populations de macrophages distinctes qui expriment CD169 : les macrophages alvéolaires (AM) et les macrophages associés aux nerfs (NAM). Il existe également une population de macrophages exprimant CD169 présente dans l’espace pleural. L’hypothèse centrale de notre projet est que le récepteur CD169 et/ou les macrophages CD169+ jouent un rôle critique dans la pathogenèse de la tuberculose. Notre stratégie expérimentale se divise en trois axes. Ce projet a pour objectifs : 1/ de caractériser la biologie des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose et le rôle de la molécule CD169 à la surface de ces macrophages, 2/ identifier les voies métaboliques impliquées dans le fonctionnement des macrophages pulmonaires CD169+, 3/ visualiser le comportement des macrophages pulmonaires CD169+ et leur capacité à interagir avec d’autres cellules dans leur environnement pulmonaire au cours de la tuberculose.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) évaluer le fonctionnement biologique des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose et cartographier les principales voies métaboliques impliquées ; (ii) visualiser le comportement des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose, (iii) caractériser les mécanismes de communication intercellulaire de ces cellules ; et (iv) identifier potentiellement une nouvelle cible cellulaire pour une thérapie ciblée sur l'hôte et à des fins de vaccination contre la tuberculose.
Procédures
Dans cet APAFIS, - 45 souris seront mises à mort sans autre intervention - 500 souris recevront une à cinq injections intranasales réparties sur une semaine - 360 souris recevront une injection intranasale et une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant 7 à 10 jours - 1584 souris recevront une à cinq injections intranasales espacées de 1 à 5 jours et une injection rétro-orbitale - 192 souris recevront des injections intranasales quotidiennement pendant une semaine, puis tous les deux jours pendant une semaine, puis elles recevront une injection rétroorbitale - 120 souris recevront 4 injections intrapéritonales espacées de 2 à 5 jours et une injection intranasale - 800 souris recevront 2 à 4 injections intrapéritonales espacées de 1 à 5 jours, une injection intranasale et une injection rétro-orbitale - 576 souris recevront une injection intranasale, sept injections intrapéritonéales (1 jour sur 2) et une injection rétro-orbitale - 410 souris recevront une à deux injections intranasales (ou une intranasale + une intratrachéale) et subiront une chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon pendant 2 à 6h - 840 souris recevront une à deux injections intranasales (ou une intranasale + une intratrachéale), sept injections intrapéritonéales (1 jour sur 2) et subiront une chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon pendant 2 à 6h Les injections intranasales sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Les injection-rétro-orbitale sont effectuées sous anesthésie générale avec un analgésiant local. La chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon est effectuée sous anesthésie générale avec des antalgiques et des analgésiques. L’hydratation et la température de l’animal sont maintenus tout au long de la procédure. Les mises à mort seront réalisées par injection intrapéritonéale de pentobarbital, par disclocation cervicale sous anesthésie ou par asphyxie au CO2.
Impact sur les animaux
Dans cet APAFIS, les infections et les injections seront effectuées sous anesthésie afin d’améliorer le bien-être des animaux. La majorité des souris seront infectées par Mycobacterium tuberculosis. Pour les infections allant jusqu’à J42, aucun voire peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux (aucun signe indicateur d’un mal-être). Parfois, de légères altérations de l’aspect (état corporel, pelage) peuvent être observés ainsi que des altérations de la respiration et du comportement (posture et mobilité). Ces effets n’apparaissent généralement qu’à partir de J35. Pour les expériences de survie, de plus fortes altérations de l’aspect, de la respiration et du comportement peuvent survenir au-delà de J100. Une perte de poids peut également être observée (généralement
Devenir
Toutes les souris de cet APAFIS seront mises à mort à la fin des procédures. Les souris des procédures 1-7 seront infectées par la bactérie Mycobacterium tuberculosis qui est responsable de la tuberculose. Ce pathogène étant classé risque biologique de niveau 3, il n’est pas envisageable de garder les souris en vie à la fin de ces procédures. Dans la procédure 8, nous utiliserons une technique de chirurgie afin d’imager les cellules immunitaires présentes dans les poumons. Les souris seront anesthésiées et analgésiées, mais la procédure est trop invasive pour pouvoir les réveiller sans douleur. Enfin, nous avons besoin de récupérer les ganglions lymphatiques des souris à l’issu de la procédure 9 afin de déterminer si les cellules T de l’immunité adaptative ont été activées. Le prélèvement de ces organes ne peut avoir lieu sur souris vivante ce qui nécessite leur mise à mort.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la réponse immunitaire contre la tuberculose. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler que sur des modèles cellulaires qui ne récapitulent pas l’ensemble de l’immunité anti-tuberculeuse. En particulier, notre projet a pour but d’étudier une population cellulaire dans son contexte pulmonaire. Notre projet est basé sur l’étude de la dynamique et du comportement des ces cellules par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation de souris vivantes. Elles seront infectées puis mises à mort afin d’analyser la réponse immunitaire pulmonaire, ou nous réaliserons de la chirurgie afin d’observation les cellules immunitaires pulmonaires par microscopie intravitale.
Réduction
Notre équipe a une expertise dans l’utilisation de modèles animaux d’infection par Mycobacterium tuberculosis et l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous avons notamment développé des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés (exemple : la préparation d’ARN, analyse de cytokines et charges bactériennes peuvent maintenant être réalisées sur le même échantillon).
Raffinement
Dans cet APAFIS, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. - Les instillations intranasales seront réalisées sous anesthésie générale fixe ou gazeuse. - Les injections rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie locale et gazeuse. - Pour la chirurgie (microscopie intravitale) nous utiliserons un analgésiant, un anesthésique local, un anesthésique fixe puis un anesthésique gazeux. La température corporelle et l’hydratation des animaux seront maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. De l’ocrygel, sera appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. - Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement jusqu’à J100 et biquotidiennement jusqu’à J120, le point le plus tardif. Les souris infectées par Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas pneumonie ou du lipopolysaccharide seront monitorées pendant 24h, durée maximale de l’expérience. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation (grille de score en pièce jointe de cet APAFIS et détaillée pour chaque procédure) et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation. Les animaux présentant des signes de souffrance sur cette base seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer le rôle de CD169 dans l'infection par Mycobacterium tuberculosis, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques et de la variabilité de résistance à la pathologie, et ii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique et du comportement des macrophages CD169+ par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez Mus musculus. Nous considérons l'utilisation de modèles animaux plus complexes comme le cochon d'inde et le macaque comme des modèles réservés à des étapes plus avancées dans l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques. De tels projets, s’ils s’avèrent nécessaires, seront réalisés au travers de structures de service impliquant des consortiums de recherche et dépassant le cadre de ce projet. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature pour étudier la réponse immunitaire à Mycobacterium tuberculosis.
KO thermique frequence Modélisation numérique de l’interaction des champs RF sur les récepteurs thermiques – Mécanismes et expérimentations vivo (MOTHERR1 )
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.
Objectifs
Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.
Bénéfices attendus
L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.
Procédures
Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).
Impact sur les animaux
L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.
Devenir
A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.
Remplacement
Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.
Étude de l’efficacité de candidats médicaments à base de vecteur viral (AAV) sur un modèle d’épilepsie du lobe temporal (ELT) chez la souris SWISS
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque chez elles une épilepsie chronique du lobe temporal par injections répétées de pilocarpine, ce qui déclenche des crises généralisées, des tremblements et une perte de poids, avec une mortalité attendue d'environ 25 %. Les souris survivantes passent un test d'open field mesurant l'activité locomotrice, subissent une chirurgie intracérébrale pour recevoir un vecteur viral puis un prélèvement sanguin terminal. Il conclut qu'aucun modèle alternatif ne peut remplacer la souris pour tester ces candidats médicaments avant un passage en clinique.
Objectifs
L’épilepsie chronique représente une des causes majeures de trouble neurologique dans le monde, dont le type le plus répandu est l’épilepsie du lobe temporal (ELT). Elle se caractérise par des crises récurrentes et spontanées provoquées par une hypersynchronie excessive et incontrôlée de l’activité neuronale. Les molécules pharmacologiques antiépileptiques actuellement utilisées visent essentiellement à soulager les symptômes associés à l'épilepsie chronique en réajustant l'équilibre entre excitation et inhibition de l'activité neuronale. Cependant, ces traitements n'agissent pas directement sur les processus sous-jacents responsables de la progression de la pathologie, dont l'origine provient souvent d'un ou plusieurs gènes défaillants. Le projet a donc pour objectif de tester l'effet de candidats médicaments à base d'AAV sur un modèle in vivo de souris reproduisant fidèlement les manifestations histologiques et comportementales d'ELT observés chez l'humain. Le projet est focalisé sur l'une des structures du lobe temporal, l'hippocampe, qui joue un rôle central dans la génération des crises d'épilepsies et les troubles du comportement associés. Les souris épileptiques chroniques subiront une analyse comportementale à partir d'un test mesurant l'activité locomotrice spontanée. Cela permettra d'évaluer la réponse comportementale des mêmes souris avant et après l'administration de traitement à base d'AAV pour en tester l'efficacité. À la fin du protocole, ces mêmes souris subiront un prélèvement de l'encéphale afin de comparer les effets des candidats médicaments AAV sur les caractéristiques histologiques principales de l’ELT.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements à base de vecteurs viraux sur le modèle rongeur d'épilepsie du lobe temporal en agissant sur l'aspect histologique et les troubles comportementaux associés. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d'épilepsie chronique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux subissent 4 interventions distinctes. Durant la 1ère intervention du protocole, les souris (âge: 7-9 semaines) subissent une série d'injections (4-6) par voie intrapéritonéale (i.p) de plusieurs molécules (i.e. scopolamine, pilocarpine, caféine, diazépam) afin d'induire un état d'épilepsie chronique (durée de l'intervention: 2h30-3h30 environs). Les animaux sont ensuite immédiatement hébergés dans les cages de manière individuelle pour toute la durée restante du protocole (i.e. 3 mois). Après une période de 2 mois (durée correspondant à la phase de latence ou phase d'épileptogenèse), la seconde intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris, mesurant l'activité locomotrice spontanée à partir du test de l'open field (OF) avant et après traitement (durée d’intervention : 20min environs). Une semaine après, durant la 3ème intervention, ces mêmes souris subissent une chirurgie dans le but d'administrer le candidat médicament ou le véhicule au niveau intracérébral sur 4 sites de la zone hippocampique sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 2,5% mix air et oxygène) (durée de l'intervention: 1h environs). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 2,5% mix air et oxygène) avant prélèvement de l'encéphale sur animaux morts après perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L'induction de l'épilepsie chronique se réalise à partir d'injections répétées en i.p. Pour cela, la souris est disposée de manière isolée dans un cylindre plexiglas transparent durant une période de 2h30-3h30 pouvant générer du stress. L'induction de l'ELT provoque des crises d'épilepsies généralisées s'exprimant par des tremblements neuromusculaires plus ou moins importants et une hyperactivité caractérisée par des bonds et des courses. Une fois l'induction terminée, les souris sont hébergées dans des cages individuelles pour une durée de 6-8 semaines. Durant les 1ers jours post-induction, les animaux sont susceptibles de subir une perte de poids ainsi qu'une diminution temporaire de leur mobilité. Les animaux sont ensuite soumis à une administration intracérébrale d'AAV (sur 4 sites) nécessitant une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour disséquer les tissus cutanés et pour percer l'os crânien réalisée sur un cadre stéréotaxique. La peau du crâne est ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation et un risque retrait du point par l'animal. En fin de protocole, l'animal est de nouveau anesthésié afin de subir un prélèvement sanguin intracardiaque avant d'être sacrifié pour récupérer le cerveau.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, le protocole se termine par un prélèvement de sang terminal suivi par la mise à mort de l'animal suite à la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale (Kétamine/xylazine (150mg/kg - 15mg/kg) afin de prélever l'encéphale pour analyser la réorganisation synaptique notamment au niveau de l'hippocampe. Ainsi, tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort.
Remplacement
L'objectif du projet étant en partie de tester l'efficacité du candidat médicament sur une échelle multidimensionnelle et notamment sur les mécanismes pathologiques handicapants (crises, altérations du comportement) de l'ELT afin d'améliorer la qualité de vie des patients ainsi que sur les caractéristiques histologiques, il n'est donc pas possible de substituer les souris par des modèles alternatifs (e.g. in vitro). En effet, les rongeurs sont un excellent outil pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices), et sont un très bon substrat pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurologiques humaines, en l'occurrence l'épilepsie. En ce qui concerne cette dernière pathologie, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de l'épilepsie du lobe temporal humaine.
Réduction
Bien que le modèle d'ELT de souris pilocarpine soit connu pour induire un taux de mortalité important (~50%), le protocole choisi pour ce projet est basé sur une méthodologie récemment raffinée et publiée ayant engendrée une forte diminution du taux de mortalité (~25%; Vigier et al., 2021). Cela permet donc d'augmenter du même ordre le taux de réussite d'induction de l'épilepsie et de limiter le nombre d'animaux. Par ailleurs, chaque lot de souris utilisé pour ce projet subit toutes les étapes expérimentales à savoir l'induction de l'épilepsie chronique, l'évaluation comportementale, les injections intracérébrales (du candidat médicament ou du véhicule) ainsi que les prélèvements de sang et de tissus cérébral. Ceci permet donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. Pour ce projet, un lot expérimental inclut au minimum 1) un groupe de souris contrôles traitées avec une solution saline (SHAM) et 2) un groupe de souris traitées avec une dose donnée du composé candidat. Le calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N) est basé sur les données obtenues préalablement par le sponsor en prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre (e.g. distance parcourue à l'OF). Une taille d’échantillon de 10 animaux pour chaque condition serait nécessaire pour atteindre une puissance statistique supérieure ou égale à 0,8. Deux animaux supplémentaires sont ajoutés au regard du taux de mortalité avoisinant les 25%. Au total, cela représente donc un lot expérimental de 10 animaux par groupe + 2 animaux de sureté: 12 animaux x 2 conditions = 24 animaux. Un nombre de 6 lots par an sur 5 ans est estimé par rapport au nombre de projets des années antérieures soit 720 animaux (24 animaux x 6 séries x 5 ans). Cependant un à deux groupes pourront être ajoutés à la demande du sponsor afin de moduler les doses du composé candidat. Cela porte donc notre nombre à un total d'animaux d'au maximum 1440 animaux (12 animaux x 4 conditions x 6 séries x 5 ans).
Raffinement
Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations selon un score de sévérité (cf. annexe 2). Les animaux sont familiarisés avec les outils de mesures et les nouveaux environnements. Pour l'induction de l’ELT par injection i.p de pilocarpine : - les administrations sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. - pour les injections i.p, pour éviter l'inflammation locale, le site d’injection est alterné entre gauche et droite. - le protocole est basé sur une méthodologie raffinée à la base d'une forte diminution de la souffrance des souris. Au cours des sessions : - les souris sont placées de manière individuelle dans des cylindres plexiglas transparents. La pilocarpine générant une hyperactivitée, il est préférable de les disposer ainsi afin d'éviter toutes blessures pour elles-mêmes ou les autres souris. - des critères comportementaux basés sur l'observation de l'animal, dérivée de l'échelle de Racine et adaptée à la souris, permettent d'anticiper le SE (status epilepticus) mais aussi les problèmes cardio-respiratoires de la souris. Suite à l'injection i.p de pilocarpine, si l'animal atteint un score > ou = 4, une injection i.p de caféine (40 mg/kg) est effectuée. Cette dose limite les problèmes respiratoires sans provoquer d'effets néfastes à long terme. Lorsque le SE de la souris atteint une durée d’1h, une injection i.p de diazépam est effectuée pour stopper le SE. À la fin de la procédure d'induction de l’ELT : - les souris sont placées dans des cages individuelles à température constante (20-24°C) avec alternance jour/nuit de 12h00 pour favoriser leur récupération physiologique. - du gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris est disposé dans chaque cage pour 2 jours minimum (avant retour à l'alimentation normale) pour favoriser l'alimentation et la réhydratation. - des injections s.c de NaCl 0,9% sont réalisées pour favoriser la réhydratation. - les animaux sont surveillés dans les 2h après l'induction de l’ELT) puis quotidiennement: en cas de d'atteinte de points limites = à 1, de la buprénorphine (0,05mg/kg; 0,1-0,2ml) est injectée en i.p. - Si un score de points limites est = à 2, ils sont mis à mort. Selon la chirurgie, les souris sont anesthèsiées soit à l'isoflurane (4%-2,5% - mix air/02) soit à la kétamine/xylazine (150-15mg/kg).
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux des patients souffrant d'ELT (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeurs) mais reproduisent également des manifestations histologiques de l'ELT (mort neuronale, remodelage anormal du réseau, etc.). Ils sont donc un excellent modèle pour cette maladie humaine. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la suite du projet pour le sponsor. Des souris de 7-9 semaines (30-45g) sont préférentiellement utilisées car ce groupe d'âge a le taux de survie et de réussite de l'induction de l'épilepsie le plus élevé.
Etude du rôle des récepteurs astrocytaires mGluR5 dans la transmission synaptique, la plasticité synaptique à long-terme et la mémoire chez la souris adulte.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie crânienne avec deux craniotomies pour injecter un virus dans les deux hippocampes, l'implantation d'une lentille miniature puis des tests comportementaux sur cinq semaines, avant décapitation ou perfusion intracardiaque. Le porteur vise à comprendre le rôle des récepteurs astrocytaires mGluR5 dans la mémoire de la souris adulte, les retombées pour des maladies comme Alzheimer restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" et qu'aucune technique sans animaux ne peut se substituer à la souris.
Objectifs
De nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la communication neurone-neurone via la libération de gliotransmetteurs. Nous avons précédemment montré que l’astrocyte était capable de réguler l’efficacité de la transmission synaptique chez l’animal juvénile, notamment grâce à l’activation du récepteur astrocytaire glutamatergique mGluR5. Cependant, afin d’aller plus loin dans la compréhension du transfert d’information dans l’hippocampe, une région cérébrale jouant un rôle clef dans la mémoire, il est donc nécessaire de déterminer si ce processus est toujours présent à l’âge adulte. Les objectifs de ce projet sont donc de déterminer la contribution des récepteurs mGluR5 astrocytaires dans la transmission synaptique, ainsi que dans les processus de mémoire chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
-Injections intra-péritonéales de tamoxifène : Ces injections seront réalisées sur animal vigile. Les animaux recevront au total soit 5 ou 8 injections sur 5 ou 8 jours consécutifs. Chaque injection durera moins d’une minute. En fonction du protocole choisi, 120 ou 860 animaux seront concernés. -Chirurgie pour injections intra-hippocampiques : les animaux seront anesthésiés sous isoflurane durant toute la chirurgie (soit environ 1h par animal). Elle consiste en une incision de la peau au niveau du crâne, puis deux craniotomies permettant la descente de l’électrode d’injection au niveau des deux hippocampes. Les animaux subiront donc au total 2 injections (5min chacune). 400 ou la totalité des animaux seront concernés en fonction du protocole choisi. -Implantation du système nVista INSCOPIX : Les animaux seront anesthésiés sous isoflurane pendant 1h30 environ. Les craniotomies déjà effectuées pour les injections virales seront réutilisées pour l’implantation de la lentille intégrée. Un animal sera implanté une seule fois. Le système sera laissé en place le temps de réaliser les tests comportementaux (soit 5 semaines après la chirurgie). Au total, 160 animaux sont concernés. -Anesthésie pour perfusion : Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange kétamine/xylazine (
Impact sur les animaux
Suite aux différentes procédures, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Pour prévenir ces phénomènes, du méloxicam (5 mg/kg) sera injecté en préemptif par voie sous-cutanée. Si nécessaire, l’injection sera renouvelée 24 heures après la chirurgie pour calmer la douleur. La plaie chirurgicale sera observée quotidiennement afin de déceler les traces d’infection au niveau du site opératoire (rougeur, enflure, écoulement, saignement). Si la plaie présente un de ces signes, nous appliquerons du Picri-Baume® (spray désinfectant et cicatrisant à base de cire d’abeille) quotidiennement, jusqu’à complète cicatrisation et pendant 7 jours maximum. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2. Les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon la grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si l’animal présente des signes de douleur, nous injecterons immédiatement en sous-cutané du Méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur (score entre 5 et 9). Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.
Remplacement
Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo et sur tranches aigües de cerveau est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au cours de la chirurgie, pipette utilisée pour injecter le virus bouchée, injection dans la mauvaise structure cérébrale, problème au moment de la dissection, problème rencontré au moment de l’expérience d’électrophysiologie). Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest et sizzle nest), au nombre de 4-5 par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement en sous-cutané de méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur (score entre 5 et 9). Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Ce modèle permet de produire des tranches aiguës de cerveau afin de réaliser des études d’électrophysiologie et d’imagerie. Les souris C57BL6/J seront réceptionnées à l’âge de 6 semaines afin d’être âgés de 7 semaines minimum au moment des injections intra cérébrales. Ensuite, les diverses études seront réalisées 5 à 9 semaines après les injections intra cérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 12 à 16 semaines.
Impact de la modulation du microbiote intestinal par un régime riche en fibres (prébiotiques) dans la prévention des cancers
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié suit un régime riche en fibres, toutes reçoivent une injection de substance cancérigène sous la peau, et une partie est enfermée sous cloche sans eau ni nourriture pendant une à quatre heures pour mesurer le dihydrogène produit. Le porteur indique que les animaux peuvent développer des nécroses au point d'injection et une tumeur, et sont tués aux points limites pour prélèvement. Il affirme que le rôle du microbiote et l'immunosurveillance des cancers ne peuvent s'étudier qu'in vivo, sans alternative à ce jour.
Objectifs
Il a été montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de certains lymphocytes au niveau intestinal. Dans un modèle murin de mélanome, un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale. Au sein des tumeurs résiduelles, nous retrouvons ces lymphocytes avec des fonctions augmentées.Ceci suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. Afin de pleinement démontrer le rôle de la nutrition dans la prévention des cancers, nous proposons ici d’évaluer les capacités préventives des cancers d’un régime HFD, dans un modèle de cancer chimio-induit, qui se développe « naturellement » suite à l'exposition à un carcinogène. Cette démonstration au plus proche de la situation clinique des patients renforcera nos observations et sera rapidement transférable en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.
Bénéfices attendus
Le modèle de mélanome utilisé jusqu'à présent est très artificiel, car il consiste en l'injection directe de cellules cancéreuses. En conditions physiologiques, un cancer apparait progressivement, suite à une exposition à un carcinogène. Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet préventif du régime riche en fibres (High Fiber Diet – HFD) sur l'apparition de cancer, dans des conditions physiologiques normales, suite à une exposition à un carcinogène. L'ajout d'un anticorps bloquant les lymhocytes chez les animaux n'ayant pas développé de tumeur sera une preuve de concept de l'implication de l'immunosurveillance dans la prévention de l'apparition de tumeurs. La mesure de dihydrogène sera un argument supplémentaire pour expliquer cette immunosurveillance accrue suite au régime HFD.
Procédures
La moitié des animaux (92) suivra un régime High Fiber Diet (HFD) durant la totalité de la procédure, pendant que l'autre moitié aura un régime standard. Après 3 semaines de pré-conditionnement, chacune des 192 souris recevra une injection sous-cutanée de carcinogène, et leurs fécès seront prélevés une fois par mois. Durant les neufs mois suivant l'injection du cancérigène, maximum 20% des animaux (40) développeront une tumeur, puis de nouveau 20% (40) après l'injection de l'anticorps bloquant les lymphcytes. 24 animaux, n'ayant pas développé de tumeur, seront mis sous cloche pour mesurer le dihydrogène qu'ils produisent (2 séquences de 3 mesures d'1 à 4h par semaine).
Impact sur les animaux
Les nuisances au bien-être animal apportées par ces expérimentations seront visibles par des caractères physiques (manque de toilettage, poil ébouriffé, écoulement nasal/oculaire posture prostrée), comportementaux, (mobilité réduite, vocalisations), ainsi que par la perte de poids. Les animaux pourront aussi déveloper des nécroses au site d'injection du carcinogène et seront manipulés pour les collectes de fécès. Dans la cloche pour la mesure de dihydrogène, les animaux n'auront pas d'accès à l'abreuvement et à l'alimentation pour la durée de la mesure.
Devenir
Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements.
Remplacement
Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu’in vivo. En effet les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l’hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n’existe donc pas d’alternative à ce jour.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse à l'agent carcinogène d'une part (20% des animaux exposés développent une tumeur) et au régime HFD d'autre part, ainsi que des aléas dus au maintien des animaux durant toute la durée de la croissance tumorale, deux groupes de 96 souris seront constitués, afin de s'assurer 18 à 20 animauxdéveloppant une tumeur dans le groupe contrôle in fine. Ainsi malgré la variabilité, ce nombre d’animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique.
Raffinement
Afin d'assurer le bien être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire n'est associé à aucune contrainte. L'injection de l'agent carcinogène n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés la première semaine suivant l'injection du carcinogène, puis 1 fois par semaine au minimum jusqu'à J70. Au delà, et ce jusuqu'au jour 250, les animaux seront cliniquement suivi au minimum 3 fois par semaine. Les animaux seront sacrifiés dès lors que la tumeur nécrose ou atteind la taille définie comme point limite. En plus des points limites liés à la tumeur, les animaux seront suivis pour évaluer l’apparition de stress/douleur liés à l’expérience selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, perte de poids).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d’étude. La manipulation de leur flore est acquis. De plus, les modèles tumoraux et d’immunothérapie, ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développer pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique scientifique l'ont été avec ces mêmes souris. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d’âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées, et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.
Étude du rôle de Smurf1 dans la propagation du norovirus
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après un gavage initial de norovirus, elles subissent des prélèvements quotidiens de selles pour mesurer la charge virale et le rôle d'une protéine dans la propagation du virus. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhée, saignements et perte de poids, une diarrhée de quatre jours ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort par dislocation cervicale. Il précise avoir mené des travaux préalables sur cellules et présente l'étape animale comme une analyse "intégrée" de la réponse immunitaire.
Objectifs
De nombreuses études suggèrent un rôle important joué par l’autophagie dans la dégradation de divers agents pathogènes. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement de l’autophagie. Nous cherchons maintenant à comprendre comment il parveint à le faire. Ainsi, nous étudions plus précisément le rôle joué par une protéine cellulaire, Smurf1, dans l'evitement de la dégradation.
Bénéfices attendus
À travers l’étude du dialogue moléculaire entre la protéine cellulaire Smurf1 et la capside virale nous cherchons à comprendre comment le norovirus murin parvient à accroître sa survie à l'intérieur de la cellule infectée. Nos données préliminaires indiquent que le norovirus est capable d’empêcher le bon déroulement d'un mécanisme de dégradation. Notre projet nous permettera de mesurer l’impact de l’inactivation génétique de Smurf1 sur la charge virale. Une réduction de celle-ci dans les souris KO ouvriait la voie vers une nouvelle piste thérapeutique pour limiter la propagation des norovirus.
Procédures
Au début de l'expérience un gavage initial avec du PBS (condition contrôle) ou avec les différentes souches de norovirus sera réalisé. Ensuite, des prélèvements quotidiens de selles seront réalisés pour mesurer la charge virale.
Impact sur les animaux
Diarrhée, saignements, perte de poids excessive.
Devenir
A la fin de l'expérience les anaimaux seront euthanasiés par dislocation cervicale conformément aux régles éthiques en vigeur sur le sacrifice des animaux lors de procédures expérimentales. De même, au cours de l'expérience, si les points limites définis pour chaque procédure sont atteints pour éviter une détresse et une souffrance excessive des animaux, ils seront également euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
Nos expériences in vitro avec une lignée de macorphage avec Smurf1 transitoirement inactivé, puis celles avec les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris KO vs WT nous ont permis de ne pas utiliser des animaux pour ces expériences prléiminaires. Nos futurs expériences in vivo permetteront de compléter ces études in vitro et de réaliser une analyse intégrée de la réponse immunitaire dans la prise en charge de l'infection norovirale.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 6 souris seront utilisés. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité entre les souris et associant la dispersion des valeurs individuelles intra-groupes et la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse ainsi que l’impact environnemental, les animaux seront observés quotidiennement par des personnes formées. Un suivi régulier du poids des animaux, de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration...), sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, de perte de sang nous permettant de réaliser un score de sévérité de la maladie, ainsi qu'un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe. Une diarrhée prolongée sur 4 jours, des saignements répétés au delà de 3 jours avec selles sanginolantes et/ou saignements au niveau anal, ainsi qu'une perte de poids supérieur ou égale à 20% du poids initial nous améneront à euthanasier les animaux concernés. Nos expérinces se focaliseront sur les souches virales S99 et MNV-1 qui sont respectivement persistente et aigue. Par ailleurs, nos expériences in vitro montrent des réponses cellulaires (signalisation) différentes entre ces deux souches. Par conséquence nous chercherons à mesurer dans nos expériences in vivo si la pathogénécité de ces deux souches dans nos souris WT et Smurf1 Ko est également différente. La dose virale que nous utiliserons est de 10e7 PFU. Elle a été validée par des expériences précédentes. La durée totale des expériences in vivo n'excédera pas 21 jours. Nos expériences précédentes montrent des effets de l'infection precepetibles entre 7 et 14 jours dans les souris WT. Les effets dans les souris Ko devraient être du même ordre. Le délai de 14 à 21 jours devrait nous permettre de détecter un eventuel décalage dans le temps entre les souris WT et Ko. Les effets de l'infection sont mesurables via une perte de poids progressive accompagnée ou non de diahrrées ou de saignements liée à une activation de l'inflammation intestinale. Ces effets sont résorbés en quelques jours avec la résolution de la phase aigue de l'infection et la prise en charge du virus par le sytème immunitaire inné. Dans le cas contraire, si l'inflammation persiste ou s'aggrave avec un ou plusieurs points limites atteints les animaux concernés seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle animal ‘souris’ permet une analyse intégrée de la réponse immunitaire à l’infection norovirale. L’inactivation de Smurf1 nous permettra de comprendre plus particulièrement le rôle joué par celui-ci dans la clearance virale par autophagie. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés entre 6 et 12 semaines. Des expériences in vitro sur des cellules dérivées de souris WT ou KO nous ont permis d'établir cette fourchette d'âge. Les protocoles d'infection peuvent durer jusqu'à 3 semaines.