Souris
Évaluation de l’impact de l’activité physique sur la réponse à l’immunothérapie dans un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques (APICaP).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, quarante étant classées en gravité sévère. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses prostatiques puis sont soumises à un exercice forcé, pour voir si l'activité physique lève la résistance à une immunothérapie. Le porteur prévoit une anesthésie sans réveil pour la totalité des animaux en fin de projet, afin de prélever tumeur et organes. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe et que la recherche "rend incontournable" le recours à la souris.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes moléculaires impliqués, dans un modèle murin de cancer de la prostate. L’anti-PD1 utilisé est celui décrit dans de nombreuses publications : BioXCell, InVivoPlus anti-mouse PD-1 (CD279). Dans notre modèle, cette immunothérapie n’a pas d'efficacité et nous cherchons à déterminer si l’activité physique peut lever cette résistance à l’immunothérapie. Le modèle TRAMP-C2 n’engendre pas de métastases.
Bénéfices attendus
L'activité physique sur tapis roulant pourrait ralentir la croissance tumorale comparativement aux souris ne pratiquant pas d'AP. Cela rejoindrait des résultats précédemment obtenus. L'activité physique pourrait améliorer la perfusion tumorale et donc améliorer les effets de l'immunothérapie (anti-PD1) dans le modèle de souris TRAMP-C2. Il s’agit de nouveaux traitements et de nouvelles alternatives de prise en charge de patients avec cancer de la prostate. Le tout, sur un modèle déjà bien utilisé dans notre laboratoire.
Procédures
Les animaux sont soumis à une injection en sous cutanée (aiguille 26G) de 100µl d'une solution contenant un million de cellules TRAMP-C2 de cancer de prostate. Aucune procédure chirurgicale, ni prélèvement sur animaux vigiles, ne seront effectués.
Impact sur les animaux
De possibles problèmes de locomotion chez les animaux porteurs de la tumeur peuvent être observés. Nous analyserons donc la mobilité, le toilettage, la perte de poids (ne doit pas être inférieure à 20% du poids initial à aucun moment, pendant la durée de la procédure), et le volume de la tumeur qui ne doit pas excéder 1500mm3. Dans ce modèle de TRAMP-C2, aucune perte de poids supérieur à 20% n’a été documentée sur la durée du projet. Si ces changements sont observés, ils seront considérés comme un point limite et les animaux seront euthanasiés.
Devenir
A l'issue de la procédure 1-4, les animaux sont gardés en vie. A la fin du projet une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélèvements sanguins ( Il s'agit de 0.3-0.5 ml de sang que nous récupérons à l'aide d'une seringue dans la cavité du coeur de l'animal, aprés avoir été euthanasié) , de prélever la tumeur,le foie, la rate, les intestins, les poumons, les reins, les muscles gastrocnémiens, tibialis antérieurs, extensor digitorum longus et soleaires pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettront d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes et les acteurs moléculaires impliqués.
Remplacement
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes moléculaires impliqués. Ceci n'est pas démontrable "in vitro". Nous cherchons ici à étudier les interactions entre la tumeur, le plasma et le muscle. Il n'existe donc pas d'altérnative in vitro pour ce type d'évaluation. La nécessité de la recherche biologique, en vue de contribuer à améliorer la prise en charge médicale, rend incontournable le recours à l'expérimentation animale pour faire progresser les connaissances et améliorer la prise en charge et la survie de patients atteints de cancer de la prostate.
Réduction
Les cohortes seront constituées de 10 souris par groupe afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique (Sample size test). Afin de juger des effets de l'activité physique et de l'immunothérapie sur le cancer de la prostate, des ANOVA à deux facteurs seront utilisées. En cas de différences significatives sur ce test, un Bonferroni post hoc test sera employé pour isoler les effets et les interactions entre les différentes conditions expérimentales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages transparente, individuelle, côte à côte et enrichies avec des jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire demande de suivre et de noter les signes visibles d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à la sortie de l'animal du protocole.
Choix des espèces
Le modèle de souris syngéniques C57/BL6 est un modèle pertinent pour étudier le cancer de la prostate car il va permettre l'injection de cellules cancéreuses prostatiques murines et l'evolution de la tumeur. De plus, c'est un modèle de souris immunocompétent. L'implantation de la lignée cellulaire TRAMP-C2 dans ce modèle permet de développer un modèle de cancer de la prostate similaire à ceux observés chez l'Homme. C'est-à-dire qu’il s’agit d’un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques. Les cohortes seront constituées de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un nombre de sujets suffisant pour juger de la significativité de notre étude. Dans le cas présent, nous avons fait le choix d’une injection sous-cutanée afin de suivre la croissance tumorale plus aisément et comparer les résultats avec ceux déjà obtenus dans notre laboratoire. Mâles, agés de 8 semaines.
Evaluation pré-clinique de nouvelles cibles et molécules anticancéreuses seules ou associées dans les modèles murins de mélanome uvéal (MU)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de mélanome de l'œil humain leur sont injectées pour générer tumeurs et métastases, suivies par imagerie et prélèvements sanguins, la mise à mort intervenant quand la tumeur atteint sa taille maximale ou quand les métastases couvrent 40 % du péritoine. Le porteur indique qu'entre 20 et 50 % des animaux dont la tumeur ne prend pas sont aussi tués. Il présente ces essais précliniques comme "indispensables" pour augmenter la survie des patients, aucun traitement n'existant contre la forme métastatique.
Objectifs
Le cancer reste parmi les premières causes de décès dans le monde. Le mélanome de l’uvée est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Même s’il existe des traitements efficaces pour éliminer la tumeur primaire (chirurgie ou radiothérapie), aucun traitement n’existe actuellement contre la phase métastatique de la maladie. L'évaluation des nouvelles thérapies disponibles aujourd'hui nécessite le développement des modèles pertinents. Un modèle métastatique a été développé dans le laboratoire suite à l’injection de cellules tumorales humaines sur souris ce qui permet la réalisation d’études pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique mais également au niveau péritonéal dans certains cas. Ainsi elles constituent un outil primordial pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou schémas d'administration de médicaments. Ces essais précliniques ont différents objectifs : déterminer le type tumoral qui présentera le plus de bénéfice au traitement, déterminer les combinaisons et les fréquences d’administration qui seront les plus efficaces mais également effectuer des études moléculaires de la tumeur qui permettront d’expliciter le mécanisme d’action des molécules testées ou encore les mécanismes de résistance de ces tumeurs par rapport à ces thérapeutiques. Ces essais précliniques sont des phases préliminaires aux phases cliniques. Ils permettent d’orienter les développements futurs des nouvelles molécules et d’optimiser des traitements qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Les modèles murins de mélanome uvéal de notre laboratoire représentent des tumeurs générées par injection de lignées cellulaires humaines tumorales. Ces tumeurs représentent la diversité de la maladie chez l’homme et sont utilisées dans le cadre de collaboration avec des partenaires pour évaluer des nouvelles drogues. L’évaluation de l’effet de ces molécules comprend l’étude de la tolérance qui permet de déterminer la dose des molécules ou des associations de molécules sur de petits groupes d’animaux jusqu’à l’étude de l’efficacité anticancéreuse de ces mêmes molécules.
Bénéfices attendus
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Dans la grande majorité des cas, le mélanome uvéal apparait suite à une surprolifération des mélanocytes au niveau de la choroïde, qui est une des couches de la paroi du globe oculaire. Mais il peut également survenir dans deux autres couches de l’œil, l’iris ou le corps ciliaire. Il représente 5% de tous les mélanomes et se distingue du mélanome cutané au niveau biologique et génétique. Il existe des thérapies efficaces comme la chirurgie et la radiothérapie pour éliminer la tumeur primaire. Cependant plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique et péritonéal. Malheureusement il n’existe actuellement aucun traitement de référence contre la phase métastatique de la maladie. A la fin de l’expérience la tumeur primaire et les métastases seront prélevées pour étude post-mortem. Une partie sera congelée à sec pour analyse génomique et une autre sera fixée pour analyses histologiques. Le but de ces expériences in vivo est donc dans un premier temps de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du MU (croissance de la tumeur primaire ainsi que des métastases). Cette étude a également pour but de trouver un traitement afin de lutter contre la croissance de la tumeur au niveau de sa localisation initiale mais surtout d’évaluer l’efficacité de différentes « molécules actives » ou nouvelles cibles thérapeutiques sur le développement métastatique de la maladie. Ces avancées sont indispensables et majeures afin d’augmenter le pourcentage de survie des patients.
Procédures
>Injection intradermique sur animal vigile de cellules dans un volume de 100µL de tampon dans le derme de la souris au niveau du flanc droit / 1 fois en début d’expérience >Injection intrasplénique sur animal anesthésié de cellules dans un volume de 50µL de tampon / 1 fois en début d’expérience. Durée de l’anesthésie : 30 minutes >Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en IP sous un volume de 100µL / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure. Durée de l’anesthésie : 15 minutes >Prélèvements sanguins sur animal vigile au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant sacrifice >Injection/ingestion de molécules chimiques sur animal vigile (dont le volume maximal ne dépassera pas 10% du volume sanguin total de l’animal) / de 1 fois par semaine à 2fois par jour selon le traitement tout au long de la procédure
Impact sur les animaux
Avant passage chez l’animal tout effet antitumoral d’une molécule est validé sur des modèles cellulaires in vitro. Afin d’évaluer l’effet de différentes molécules actives sur le développement du mélanome uvéal, l’apparition de tumeurs de MU chez la souris doit être induite. Ces tumeurs sont générées au début de l’expérience par injection de cellules tumorales humaines. Cette étape est indispensable pour l’étude de potentiel anti-cancéreux au niveau de la localisation initiale de la tumeur Pour l’étude de la croissance métastatique un modèle d’injection représentant le développement métastatique de la maladie chez le patient (c’est-à-dire apparition de métastases au niveau hépatique et péritonéal) doit également être utilisé. Un système luminescent permet alors de suivre la dissémination métastatique chez la souris vivante au cours du temps. Les animaux seront pesés et leur état général sera contrôlé toutes les semaines. Les tumeurs seront mesurées et les souris seront sacrifiées lorsque la taille éthique atteinte. L’évolution des métastases sera également suivie par imagerie tous les 15jours au début de l’expérience puis toutes les semaines quand les métastases commenceront à se développer. Les souris seront sacrifiées lorsque le pourcentage de métastases aura atteint 40% de la surface du péritoine de l’animal. Pour chaque procédure, si un animal montre des signes de douleur, des antalgiques lui seront administrés.
Devenir
Dans chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem dès l’apparition des points limites (taille de la tumeur primaire maximale atteinte ou pourcentage métastatique atteint) ou bien en fin de l’expérience (durée de traitement prévu). Les animaux dont la tumeur ne s’est pas développée après l’injection seront mis à mort. Ce nombre est très variable d’une tumeur ou d’une injection de lignées à l’autre et en moyenne de l’ordre de 20% des animaux suite aux injections intradermique ou de l’ordre de 40-50% suite aux injections intrasplénique. Le délai de la décision de sortie des souris dépend de la vitesse de pousse des tumeurs et peut aller de 2 à 8 semaines selon le type d’injection.
Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les traitements est préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seules les molécules ayant montré une efficacité in vitro sont alors ensuite utilisées in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. L’injection de lignées cellulaires tumorales constitue l’outil d’analyse pharmacologique des nouveaux composés le plus proche de l’utilisation clinique aujourd'hui. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets du médicament en association et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance. Les effets des thérapies testées sur la dissémination métastatique et sur les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés.
Réduction
En se basant sur notre expérience, pour les expériences de toxicité, l’utilisation de 3 souris/dose est le minimum suffisant pour déterminer les effets secondaires des molécules. Dans les expériences d’efficacité, le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence de réponse de 20% (= biologiquement significative via les tests statistiques t-test ou ANOVA) entre les groupes traités et contrôles. Ce nombre tient compte du taux de prise tumorale et l’hétérogénéité des réponses des animaux.
Raffinement
Les injections de cellules tumorales par voie intradermique sont peu invasives, avec un suivi de croissance tumorale facile et avec peu de manipulation. Pour les injections par voie intrasplénique, les souris reçoivent des antalgiques avant et après la chirurgie La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les précautions suivantes seront prises : - Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : tapis ou lampe chauffante dès l’anesthésie des animaux et jusqu’à leur réveil - apport gel nutritif(dans la cage , en post chirurgie Evaluation de l’état général de la souris : une grille de score déterminera le point limite. Les animaux sont mis à mort dès atteinte d’un point-limite Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront à nouveau administrés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Cette greffe de cellules humaines est plus difficile dans d’autres espèces (le Zebrafish est moins permissif) Jeune adulte : L’injection a lieu entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience pourrait diminuer avec l’âge. De plus le temps de croissance des cellules tumorales MU est long ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements
Etude comparative de différents anticorps thérapeutiques pour le traitement du cancer du foie par induction de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps.
- Recherche appliquée
- Cancers
90 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du foie humain sont greffées sous leur peau, puis elles reçoivent jusqu'à vingt injections d'anticorps sur dix semaines, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs. Le porteur décrit des ulcérations cutanées possibles aux sites de greffe et d'injection, et un anticorps pouvant endommager des tissus sains. Il indique avoir mené des essais in vitro préalables mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester différents anticorps dirigés contre une protéine localisée sur la membrane des cellules qui a été clairement montré comme participant au développement de différents cancers, notamment le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier au monde. Depuis une dizaine d’année nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette protéine membranaire. Nous avons montré que cet anticorps conduit à une inhibition partielle de la croissance tumorale de cellules cancéreuses humaines transplantées dans des souris très immunodéficientes. Nous avons ainsi montré que l’anticorps ralentit la croissance de la tumeur. Récemment, nous avons développé un panel de différents anticorps reconnaissant cette protéine membranaire. Ainsi, afin d’explorer et d’exploiter pleinement le potentiel thérapeutique de ces anticorps, nous souhaitons tester leur efficacité dans un modèle de souris immunodéficientes afin de déterminer lequel présente l’effet le plus prononcé sur la croissance tumorale. Cette étude nous permettra ainsi de déterminer quelle forme d’anticorps est la plus optimale pour un développement clinique ultérieur.
Bénéfices attendus
Ce projet doit nous permettre d’évaluer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour le traitement du cancer du foie afin de profiter aux patients atteints de ce type de cancer pour lequel les options thérapeutiques sont actuellement très limitées, voire inexistantes.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Une injection unique, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines, réalisée sous anesthésie générale gazeuse, temps nécessaire environ 5 minutes par animal anesthésie comprise. -Une injection bi-hebdomadaire d’anticorps sur animaux vigiles pendant maximum 10 semaines, soit un maximum de 20 injections. Temps nécessaire pour chaque injection environ 1 minute par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. De même, les injections répétées d’anticorps peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Un de nos anticorps peut de se fixer à la protéine membranaire de la souris, ce qui pourrait éventuellement induire des dommages au tissus sains exprimant normalement cette protéine et entrainer une dégradation de l’état général des animaux.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tumeurs qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, les tailles d’effectifs ont été déterminée à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes sont des modèles reconnus dans la communauté scientifique pour la greffe sous cutanée de lignées cancéreuses humaines afin de tester rapidement la pertinence d’une approche thérapeutique. La souche immunodéficiente choisie possède néanmoins certaines cellules capables d’améliorer l’effet thérapeutique des anticorps. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin que ces cellules en question soient matures. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses ou non d'une mutation liée à une maladie neurologique rare, elles reçoivent quatre traitements par injection, gavage ou alimentation, suivis de tests comportementaux répétés, avant d'être tuées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. Le porteur affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et que la mutation "n'engendre aucune souffrance". Les doses testées sont décrites comme faibles, très en deçà de la dose létale.
Objectifs
Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostique vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans l’homéostasie de striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones dans le striatum exprimant le récepteur à la dopamine 1 (Drd1+), alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une sous population de neurones exprimant le récepteur à la dopamine 2 (Drd2+). Notre premier objectif est de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant la signalisation dopaminergique de deux manières : - Par l’augmentation simultanée de l’activité de la signalisation par les neurones Drd1+ et Drd2+, à la suite de l’administration du traitement L-DOPA, un précuseur de la dopamine, utilisé pour le traitement de la maladie de Parkinson. - Par l’augmentation de l’activité dopaminergique liée aux neurones Drd2+ par l’administration de pramipexol. Notre deuxième objectif est d’utiliser des traitements précoces, déjà utilisés dans la maladie de Parkinson, afin de prévenir l’apparition des symptomes : - L’utilisation de la molécule cGP connue pour son implication dans le neurodégénrescence lorsque qu’elle est dérégulée. C’est un traitement qui est déjà utilisé dans la maladie de Parkinson pour favoriser la survie neuronale. - L’utilisation de rétinyl acetate permettra quant à elle la normalisation de la voie de l’acide rétinoïque qui est extrêmement importante pour le développments et les fonctions striatales.
Bénéfices attendus
Pour chacun des quatre traitements (pramipexol, L-DOPA, cGP et rétinyl acetate), nous testerons des doses faibles afin de normaliser la signalisation dopaminergique dans le striatum ou de prévenir l’apparition des premiers symptomes liés à la neurodégénérescence. Dans ce but, le pramipexol sera injecté (et comparé à des injections de salin (véhicule), qui permettra de contrôler les effets de l’injection) à une dose très faible de 0.2 mg/kg et à une dose faible de 2 mg/kg avant des tests comportementaux (5 differents). Ces traitements seront réalisés sur le même lot d’animaux à 1 semaine d’écart afin d’étudier l’effet dose réponse du traitement. En résumé, la procédure se déroulera comme suit : J 1 : Injection n°1 (0.2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 4 : Injection n°2 (0.2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 7 : Injection n°3 (0.2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 9 : Injection n°4 (0.2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Une semaine de battement entre les injections J 17 : Injection n°1 (2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 20 : Injection n°2 (2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 23 : Injection n°3 (2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 26 : Injection n°4 (2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Toutes les injections seront effectuées avec des aiguilles fines. Les molécules sont injectées à des doses pharmacologiques faibles. Ce dosage est couramment utilisé dans les tests comportementaux chez les souris sans poser de problème. Il est d'ailleurs très largement en deça à la dose létale murine de 168,8mg/kg par injection intra-veineuse. L’administration de L-DOPA se fera par gavage des animaux à une dose de 10mg/kg, qui se fera avant chaque test comportemental. Ces tests seront réalisés de la même manière et dans le même ordre que pour le pramipexol. Le traitement cGP se fera par l’eau des biberons à une dose de 3mg/kg pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux. Le traitement se fera donc par l’intermédiaire des mamans qui allèteront les jeunes souris. A la suite du traitement, les cinq différents tests comportementaux se feront dans le même ordre et de la même manière que décrit pour les traitements au L-DOPA. Enfin, le traitement au rétinyl acetate se fera grâce à une supplémentation de la nourriture avec du rétinyl acetate (1.8mg/kg). Ce traitement sera effectué pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux et sera suivi des mêmes tests comportementaux indiqués pour lestraitements au L-DOPA.
Procédures
Tous les traitements notifiés ci-dessous se feront sur 3 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation agés de 15 à 30 semaines pour les traitements au pramipexol et L-DOPA et agés de 6 à 10 semaines pour les traitements au cGP et rétinyl acetate. Dans un premier temps, un traitement au pramipexol (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et d’un traitement contrôle (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (test 1 = 30min; test 2 = 3 x 5min; test 3 = 32h; test 4 = 30min; test 5 = 30min). Les tests comportementaux 1 et 2 feront suite à la même injection. Les souris changeront de groupe pramipexole-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 8 injections, dont 6 maximum de pramipexol. Dans un deuxième temps, un traitement au L-DOPA (15 secondes par traitement), admisnistré par gavage, (12 animaux traités/groupe) et d’un traitement avec de la solution saline (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (voir ci-dessus). Les souris changeront de groupe L-DOPA-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 4 traitements, dont 3 maximum de L-DOPA. Dans un troisème temps, un traitement au cGP administré dans l’eau des biberons pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux visant à évaluer la motricité et la cognition des animaux traités (identiques aux autres traitements). Dans un quatrième temps, un traitement au rétinyl acetate administré par l’intermédiaire de la nourriture pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux (identiques aux autres traitements). La moitié des animaux de chacun des quatre traitements = 180 animaux, sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal. En effet, les tests comportementaux moteurs effectués avant et après les traitements ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. De plus, la mutation n’engendre aucune souffrance chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé, permise par le PFA4% administré de manière sistémique par voie intracardiaque.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique des signalisations dopaminergique et rétinoïdiennes ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés : le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues chez des souris à la suite du test qui est le moins discriminant parmis les tests effectués ici, ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques provenant d’autres laboratoires. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée par application d’un test statistique cohérent avec les analyses effectuées. De plus, les animaux traités avec le vehicule (contrôle de l’effet des traitements pramipexol et L-DOPA) seront reparti dans deux groupes de 6 animaux (et pas 12 comme pour les autres groupes). En effet la méthode de traitement ne devrait pas modifier le comportement de l’animal, ce qui permettra de regrouper les deux sous groupes lors des analyses.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans injection préalable de composés pharmacologiques. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses faibles permettant simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Des plus, les points d’injections de promipexol seront alternés entre les côtés gauche et droit de l’abdomen de l’animal. Ils seront attentivement surveillés pendant les heures suivant l’injection afin d’éviter toute infection.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de les mutations du gène RARb (identifiée chez l’homme) dans la mise en place et la progression de la maladie MCOPS12, les performances comportementales et les fonctions du système dopaminergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux adultes d’entre 15 et 30 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements et de diminuer l’hétérogénéité des résultats qui pourraient être apporté par l’augmentation de l’âge des souris. Pour les tests au cGP et au rétinyl acetate, les animaux seront testés entre 6 à 10 semaines pour évaluer l’effet des traitements directement après l’arret de ces derniers.
Impact du stress prenatal sur le développement des troubles anxieux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
371 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil à modéré. Des femelles gestantes sont soumises à un stress répété, trois séances de 45 minutes par jour pendant sept jours, pour induire chez leurs descendants un phénotype anxieux étudié par des tests comportementaux d'exploration. Le porteur indique ne pas pouvoir limiter ce stress puisqu'il est "le but recherché", et que tous les animaux sont ensuite tués pour analyser leur cerveau. Il décrit le modèle rongeur comme "incontournable", les bénéfices pour l'humain étant renvoyés au long terme.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier l'émergence des troubles anxieux dans un modèle de stress précoce. Nous avons précédemment montré que les souris soumises à un stress développemental in utero (stress prénatal) présentent à l'âge adulte de nombreux troubles comportementaux caractérisés notamment par un phénotype de type anxieux. Sur la base de ces résultats, notre objectif est de déterminer à quel moment du développement ces troubles se mettent en place et d'en étudier les substrats neuroanatomiques. En particulier, nous nous interessons aux neurones granulaires du gyrus denté dont nous avons montré par ailleurs qu'ils étaient impliqués dans les troubles anxieux. Nous testerons donc l'hypothèse que le stress prénatal modifie la genèse ou l'activité des ces neurones, et que ces modifications sont associées à une augmentation de l'anxiété.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur l'émergence des troubles anxieux et sur les processus neuronaux impliqués. Elles permettront à moyen terme d'identifier des marqueurs biologiques précoces prédictifs d'une vulnérabilité comportementale ultérieure. La transposition à l'humain, à plus long terme, permettra la prise en charge des individus à risque.
Procédures
Trois groupes d'animaux sont à considérer: le premier est constitué de femelles dont le niveau d'anxiété sera évalué par deux tests comportementaux d'une durée de 10 min et 5 min, respectivement à 2 jours d'intervalle (n=173) et dont une partie sera soumise à un stress comportemental léger durant la gestation (n= 40 souris; stress divisé en 3 sessions quotidiennes de 45 min pendant 7 jours); le deuxième est constitué de leurs descendants qui seront soumis à des tests comportementaux basés sur l'exploration spontanée avant étude des structures cérébrales impliquées (n=168 souris: un lot subit 3 tests comportementaux de 10 min maximum à raison d'un test par jour pendant 3 jours et le deuxième lot subit 1 test de 10 min); le troisième est constitué des descendants servant de population témoin puisqu'ils ne subissent aucun test comportemental (n=60). Pour analyser les structures cérébrales, tous les descendants (groupe 2 et 3) subiront au jour postnatal P1 une injection intrapéritonéale d'un marqueur de division cellulaire.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont soumises à des stress répétés qui vont générer un état de léger stress chronique. Il ne nous est pas possible de limiter ce stress ou de compenser cet état puisqu'il est le but recherché, et qu'il a pour objectif de mimer la situation observée chez l'humain (le modèle a été établi pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles comportementaux observés dans la population humaine soumise à des situations environnementales délétères durant la vie intra utérine). Les tests comportementaux qui seront effectués sur les descendants sont quant à eux non invasifs et basés sur le comportement exploratoire naturel de la souris. Nous n'attendons pas d'effet indésirable de leur mise en oeuvre.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis mort à l'issue des procédures pour une étude de l'impact du stress sur les structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de souris de laboratoire. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons : 1) les troubles anxieux que nous analysons sont des troubles du comportement; à ce titre, ils nécessitent une approche intégrée prenant en compte l'ensemble de l'organisme et ils ne peuvent pas être récapitulés sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux.
Réduction
Nous avons travaillé sur la réduction du nombre d'animaux sur 2 plans: 1) lorsque cela est possible (pas d'impact attendu sur les résultats obtenus), les souris seront utilisées dans plusieurs tests comportementaux afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires; 2) Un effectif de 14 souris par groupe représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, compte tenu de la variabilité comportementale attendue chez les souris, il faut obtenir un effectif final minimum de 12 individus. Etant donné que le pourcentage de perte liée aux aléas expérimentaux est estimé à 20% en fin d’expérience, il nous faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 souris.
Raffinement
Dès leur arrivée les souris sont hébergées en cages transparentes munies d’enrichissement (carrés de coton et de cellulose permettant l'élaboration d'un nid et tunnels). Durant les sessions de stress, les souris sont observées et manipulées 3 fois par jour et pesées tous les 2 jours. Hors périodes de stress les femelles et leurs descendants sont observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect du pelage) et une pesée hebdomadaire est réalisée. Dans tous les cas, dès qu’un animal présent un signe de mal-être (pour les adultes: poil hérissé, prostration, plaie , perte de poids de plus de 15% par rapport à la pesée précédente; pour les jeunes: absence de poche de lait, corpulence anormale par rapport à la portée, couleur des muqueuses anormale, comportement aggressif de la mère), il sera isolé.
Choix des espèces
Le modèle d’étude employé doit permettre de reproduire un système biologique fonctionnel et complexe, dont les mécanismes ontogénétiques sont comparables à ceux qui régissent le développement des mêmes fonctions chez l’humain. Dans ce cadre, le modèle rongeur constitue un outil incontournable. Nous avons opté pour l'utilisation de souris dans un souci d'homogénéité de l'ensemble de nos expériences, ce qui permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Le but du projet étant d'étudier l'émergence des troubles anxieux au cours du développement, les souris seront étudiées à 3 stades de développement: période juvénile (entre 3 et 4 semaines) , période adolescente (entre 6 et 7 semaines), et âge adulte (entre 12 et 13 semaines).
Évaluation de la combinaison d’un anticorps anti-progastrine avec d’autres traitements dans le cancer colorectal
- Recherche appliquée
- Cancers
312 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent spontanément des polypes intestinaux pouvant évoluer en prolapsus rectal, et reçoivent des injections d'anticorps deux fois par semaine pendant six semaines, avant d'être tuées pour compter les tumeurs. Le porteur indique renoncer à toute analgésie au motif qu'elle "risquerait de modifier la réponse" au traitement et ne traiterait pas le prolapsus. Il décrit ce modèle comme "indispensable" car proche de la physiopathologie humaine.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche d’un traitement contre le cancer colorectal. Il existe aujourd’hui de nouvelles solutions thérapeutiques mais malheureusement dans le cas du cancer colorectal notamment, ces traitements ont des effets limités. Nous voudrions tester si une combinaison avec notre anticorps pourrait améliorer la réponse à ces nouveaux traitements. Nous utiliserons comme modèle une souris transgènique qui a la particularité de développer des tumeurs intestinales à un âge précoce, ce qui permet d’étudier l’effet du traitement sur un modèle proche de la physiopathologie humaine. L’objectif est donc de tester l’effet de notre anticorps en combinaison avec un autre anticorps sur le nombre et la taille des tumeurs qui se développent au niveau de l’intestin chez ces souris.
Bénéfices attendus
Nous attendons un effet synergique de la combinaison sur le développement des polypes et/ou la progression tumorale. Cela sera determiné par un comptage des polypes et/ou lésions tumorale après sacrifice des animaux. Ces résultats nous permettront d'avancer sur notre stratégie de combinaison de notre anticorps avec d'autres traitements afin d'améliorer les effets thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement par injection péritonéale deux fois par semaine pendant 6 semaines.L’injection sera faite du côté droit de l’abdomen à l’aide de seringues 29G. La durée de l'injection est de 15 à 20 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Le modèle APC∆14 induit le développement de polypes intestinaux pouvant induire des prolapsus rectaux chez les animaux à un stade tardif. Notre traitement anticorps n’a, quant à lui, pas d’effet indésirable attendu et le mode d’injection intra-péritonéale n’est pas connu pour induire des douleurs autres que légères.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à la fin du traitement pour pouvoir prélever leurs intestins et procéder au comptage des polypes et/ou tumeurs qui se seront développés. Nous n’avons pas d’autre moyen que de les sacrifier pour répondre à l’objectif initial.
Remplacement
L’étude chez la souris APCΔ14 est indispensable car elle développe des polypes évoluant en tumeurs malignes intestinales de manière spontanée. Cela permet d’étudier l’effet du traitement dans un modèle physiologiquement plus relevant car immunocompétent et à un stade précoce du développement tumoral.
Réduction
Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux et d’utiliser au maximum les portées obtenues par les croisements. Le nombre d’animaux par groupe a été établi à 12. Ce nombre, qui a été défini de manière statistique, tient compte de la variabilité du modèle qui est minime et du fait que nos résultats préliminaires ont montré un effet du traitement seul.
Raffinement
L’angoisse des animaux sera réduite par l’apport d’un enrichissement sous forme de papier et coton qu’ils pourront utiliser pour se faire un nid, et par le fait qu’ils cohabiteront par groupe de 5. Le degré de souffrance est estimé comme léger car le traitement est sous forme d’injection intra-péritonéale et le traitement en lui-même n’a pour le moment jamais montré d’effet secondaire. L’analgésie ne peut être utilisée car elle risquerait de modifier la réponse à notre traitement, de plus elle ne permettrait pas de traiter le prolapsus qui est le risque majeur de ce modèle. En cas de signes de douleur, les souris seront euthanasiées par asphyxie au CO2
Choix des espèces
L’objectif est d’étudier l’effet de la combinaison de deux anticorps sur le développement tumoral. L’étude chez la souris APCΔ14 est indispensable car elle développe des polypes évoluant en tumeurs malignes intestinales de manière spontanée. Cela permet d’étudier l’effet du traitement dans un modèle physiologiquement plus relevant car immunocompétent et à un stade précoce du développement tumoral. Les animaux seront utilisés à deux stades. Le premier stade est à 5 semaines de vie lors de l’apparition des premiers polypes. Le deuxième stade est à 12 semaines de vie lorsque les polypes sont installés et commencent à se développer en tumeurs malignes. Ces deux stades sont importants pour étudier l’efficacité de notre combinaison sur l’initiation des polypes et/ou le développement tumoral.
Etude du pouvoir anti-inflammatoire de nanoparticules de methotrexate dans un modèle murin de psoriasis induit par l’application repetée d’imiquimod
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation cutanée de type psoriasis est induite sur leur dos rasé par application répétée d'imiquimod, puis des nanoparticules de méthotrexate y sont appliquées, avant la mise à mort pour analyser la réponse immunitaire. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire de la peau dans son ensemble. Les bénéfices annoncés, une nouvelle formulation réduisant les effets secondaires, sont renvoyés au "long terme".
Objectifs
Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui évolue par poussées dont la fréquence et l'intensité sont imprévisibles. Si des traitements permettent aujourd'hui de soulager les poussées, le psoriasis reste toutefois une maladie qui, selon sa localisation et son étendue, peut avoir des conséquences esthétiques et nuire à la vie relationnelle et professionnelle. Le méthotrexate est un agent anti-inflammatoire qui diminue la prolifération des cellules. C’est l’un des traitements de référence du psoriasis modéré à sévère. Il se prend de manière systémique, par voie orale ou en injection, le plus souvent sous-cutanée, ce qui peux engendrer des effets secondaires importants. Dans ce projet, nouvelle formulation de ce traitement appliqué directement sur la peau sera testée . Ce type d’application, ciblant directement la zone à traiter, devrait diminuer fortement les effets secondaires en comparaison des traitements déjà présents sur le marché.
Bénéfices attendus
Il est attendu que l'application topique de methotrexate inhibe le développement de l'inflammation dans ce modèle de psioriasis. Ce projet sur le long terme, devrait permettre la mise sur le marché potentielle d'une nouvelle formulation pour le traitement actuel contre le psoriasis, et donc aune amélioration de la prise en charge des patients avec une diminution des effets secondaires .
Procédures
Un modèle standard d'inflammation de type psoriasis, induit par l'application répétée de crème à base d'Imiquimod sera utilisé. Pour ce faire, les animaux seront rasés sur le dos, puis la crème contenant l'Imiquimod sera appliquée sur le dos sur souris vigile pendant 3 jours consécutifs. Les différents traitements seront egalement appliquées sur le dos en topique, dès le premier jours, avec des animaux anesthesiés à l'isofluorane et ce, pendant 5 jours consecutifs.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort. A noter que l'induction de psoriasis chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente et ne conduit pas les souris à se gratter. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.
Devenir
tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire
Remplacement
Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de l’allergie
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 9 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes (tests non paramétriques de Kruskal-Wallis pour comparer l’ensemble des groupes ainsi que tests de Mann-Whitney en comparaison deux à deux). La pénétration des nanoparticules d'or contenant le methotrexathe a été évalué en amont dans un systeme ex vivo.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.
Etude des processus sensorimoteurs chez la souris non anesthésiée tête-fixée au cours des états de veille et de sommeil
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation de deux à quatre heures, une partie recevant des injections virales et une craniotomie, puis est maintenu tête fixée pour enregistrer l'activité cérébrale pendant l'éveil et le sommeil. Le porteur décrit une habituation progressive à la contention pour limiter le stress, et affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux modèles animaux pour étudier la perception sensorielle à l'échelle cellulaire. Les bénéfices relèvent de la recherche fondamentale, avec un lien seulement "indirect" évoqué vers l'autisme.
Objectifs
La plupart de nos expériences sensorielles relèvent d’une exploration active du monde, tels la locomotion, les mouvements oculaires, le toucher. Face à une affluence d'informations, nous sélectionnons les plus pertinentes pour une décision rapide; en fonction du contexte, seules celles nécessaires à une action adaptée sont traitées, les autres filtrées. Mieux comprendre notre perception sensorielle du monde est un enjeu majeur des neurosciences modernes. Le système des vibrisses (moustaches) du rongeur est un système de choix pour étudier le traitement des informations sensorielles car il possède une organisation anatomique très précise. Les rongeurs en outre utilisent leurs vibrisses de façon active pour explorer leur environnement en les faisant bouger volontairement. Des mouvements rapides des vibrisses sont également observés lors du sommeil paradoxal, permettant de faire un parallèle avec les mouvements rapides des yeux chez l’humain lors de cette même phase de sommeil. Les informations sensorielles relatives à la déflection des vibrisses chez le rongeur sont transmises de la périphérie au cortex par plusieurs voies. Toutefois, la nature du message codé par chacune de ces voies reste mal connue et sujet de controverse, notamment au niveau du thalamus, une structure cérébrale centrale par laquelle les informations sensorielles transitent avant d’atteindre le cortex. Dans cette étude, nous voulons révéler sous quelles conditions physiologiques les différentes voies sensorielles transmettent efficacement cette information. Pour répondre à cette question, nous proposons d'étudier les réponses sensorielles au niveau du thalamus dans un contexte comportemental pertinent pour la souris au cours des différents états de vigilance de l’animal.
Bénéfices attendus
Le thalamus est une structure essentielle au fonctionnement du cortex cérébral, où se déroulent les opérations cérébrales les plus élaborées. Il est composé de plusieurs noyaux dont la fonction dans le traitement de l’information sensorielle reste imprécise à ce jour. En combinant des enregistrements électrophysiologiques intracérébraux chez la souris et des techniques de manipulation ciblée de neurones du réseau sensoriel, nous pourrons identifier le rôle clé de ces noyaux dans ce réseau chez un animal en comportement. Les bénéfices escomptés seront une meilleure compréhension des mécanismes du traitement de l’information sensorielle par le cerveau, ce qui relève de la recherche fondamentale. De plus, le thalamus étant essentiel à la perception sensorielle et aux processus attentionnels, les résultats attendus pourront révéler la base neuronale des opérations délétères dans les troubles du spectre autistique et contribuer ainsi indirectement à une meilleure compréhension de cette maladie. Ensuite, ce projet apportera un éclairage nouveau sur la fonction du sommeil. Des travaux chez l’homme ont montré que le cerveau peut réaliser une tâche cognitive lors du sommeil paradoxal : les réponses évoquées à l’écoute de son propre nom sont différentes de celles évoquées par un nom inconnu. Cependant, nos connaissances sur ce sujet restent très limitées. Ce projet constitue une première étape vers la compréhension du traitement différentiel des informations sensorielles et des processus sensorimoteurs et cognitifs au cours des différents états d’éveil et de sommeil afin de comprendre comment sont traitées ces informations dans un cerveau éveillé versus non conscient.
Procédures
Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisé sur un animal vigile, toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie profonde et analgésie appropriée. Interventions sous anesthésie - Une chirurgie d’implantation (2 à 4 heures) sera réalisée sur tous les animaux sous anesthésie (n=270). - Une Injection localisée d’adéno-virus associés (AAVs) ou de traceurs conventionnels sous contrôle électrophysiologique et sous anesthésie (4 à 6 heures); cette intervention concerne n= 194/270 souris. - Une craniotomie sous anesthésie gazeuse et Buprénorphine (< 2 heures) sera pratiquée sur n= 168/270 souris. L'ensemble des trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié (122/270) des souris. - Enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie pour 50% des souris de la procédure #2 (une journée), suivis de la perfusion de l'animal : pas de réveil de l'animal - Tous les animaux (n=270) seront anesthésiés (s'ils ne le sont pas déjà) et perfusés en intracardiaque (30 minutes). Manipulations de l'animal vigile, spécifique à la Procédure #1 - Plusieurs sessions journalières de handling (10 min) pendant tout le temps de la procédure (2 à 3 mois) - Habituation à la contention, journalière, pendant 20-30 jours. Elle dure de 1 min le premier jour à 4h les derniers jours. - Enregistrements électrophysiologiques, session de 3 à 4 heures pendant 1 à 7 jours successifs - Optogénétique, stimulation lumineuse, pulses de 20 à 100ms pendant 1 à 10 sec, répétées modérément et aléatoirement lors des sessions d'enregistrements. - Stimulations sensorielles, quelques secondes, répétées modérément et aléatoirement lors des sessions d'habituation et d'enregistrements.
Impact sur les animaux
Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisé sur un animal vigile, toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie profonde et analgésie appropriée. Une chirurgie d’implantation de 2 à 4 heures sera réalisée sur tous les animaux sous anesthésie. Ensuite, après 5 jours de repos, 194/270 animaux seront à nouveau anesthésiés 4 à 6 heures pour une injection localisée d’AAVs ou de traceurs conventionnels sous contrôle électrophysiologique. Quatre à 8 semaines après, une anesthésie gazeuse (avec Buprénorphine) inférieure à 2h sera pratiquée sur 168/270 animaux pour réaliser les craniotomies. Les trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié (122/270) des souris. Ce projet nécessite des enregistrements électrophysiologiques sur la souris vigile. L’immobilisation est une source de stress pour la plupart des animaux. Dans ce projet, la souris est partiellement immobilisée : elle est placée dans un tube de carton sur un petit matelas doux et absorbant (changé régulièrement), sa tête maintenue de manière indolore par un système de contention. Contrairement aux protocoles de contention utilisés pour induire un stress, le corps et les pattes de la souris ne sont ici pas contenus ou immobilisés : elle est libre de bouger, ajuster sa posture, se toiletter. Dans le but de juguler le stress de l’animal, nous procédons à une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention, que nous alternons avec de nombreuses périodes de "handling" de l’animal. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif et non douloureux de la contention, ainsi que d’associer les sessions de travail à la récompense.
Devenir
Une perfusion intracardiaque d’une solution de paraformaldéhyde 4% sera réalisée à la fin de chacune des procédures, sur tous les animaux. Cette procédure permet de fixer le cerveau de l’animal en vue d’une étude immunohistochimique afin de valider la position des enregistrements électrophysiologiques, l’étendue de la transfection virale ou le traçage de voies anatomiques.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour l’approche des mécanismes de la perception sensorielle. La neuropsychologie humaine, la modélisation théorique des fonctions cognitives de haut niveau, ainsi que les cultures de neurones ne constituent pas actuellement une alternative pour l’étude des processus de perception sensorielle et de la vigilance à l’échelle cellulaire. L’étude des mécanismes neurophysiologiques des processus cognitifs se faisait jusqu’à maintenant essentiellement chez des modèles primates non-humains. Avec cette étude nous voulons profiter des avantages qu’apporte la souris (modèles génétiques et identification des neurones plus aisée) pour raffiner notre compréhension des processus sensorimoteurs à un niveau cellulaire.
Réduction
La technique de l’animal tête-fixée est un modèle unique qui permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour une étude donnée - un même animal participe à plusieurs sessions d’enregistrements, jusqu’à 7 jours consécutifs - les différents tests comportementaux que nous proposons pourront être réalisés sur chacune des souris, évitant la multiplication des groupes d’animaux - la multiplicité des données recueillies sur chaque animal : activité de plusieurs régions cérébrales, au cours de différents états de vigilance et comportements (et nos données sont partagées avec nos collaborateurs) - chaque souris est son propre contrôle pour toutes les procédures, divisant par deux le nombre d’animaux nécessaires et permettant d'appliquer des tests statistiques pour mesures répétées, plus puissants (donc moins de souris nécessaires), paramétriques : test-t de Student ou ANOVA (selon le nombre de groupes à comparer) ou non paramétriques au regard de la normalité de la distribution des valeurs : Wilcoxon et Friedman. Le nombre d’animaux sera également réduit par l’utilisation de tests statistiques basés sur des modèles GLM (modèles linéaires généralisés) qui prennent en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre animaux. - Les injections virales ou de traceurs sont réalisées sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation, et diminuant de facto drastiquement le nombre d’animaux inexploitables car injectés en dehors de la zone d’intérêt. - La procédure #2 vise à établir sur des animaux non contraints le protocole d’injection le plus efficace de façon à réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la Procédure #1. - Pour la procédure #1, nous estimons, de par notre expérience, à 20 le nombre de souris "contrôles" nécessaires pour chaque région d’intérêt et à 22 les souris transfectées (dont 15 souris porteuses du virus associé à la Rhodopsine et 7 souris "contrôle" pour le virus, virus associé au fluorophore seul) nécessaires pour chaque région d’intérêt. Ces estimations tiennent compte de la diversité neuronale dans les régions d’intérêt. Pour chaque étude, nous commençons avec un nombre restreint d'animaux (n=3 à 6), i.e. étude pilote, et poursuivons seulement si les réponses aux protocoles de transfection et de stimulation lumineuse sont optimales. Les données acquises avec le projet DR#03330 permettent de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
1- La technique de la souris tête-fixée a été développée dans un souci de raffinement et avec une attention particulière au bien-être de nos souris a- pour réaliser des enregistrements au cours du cycle veille-sommeil naturel de l’animal b- sans générer de douleur. Toutes les interventions chirurgicales étant réalisées sous anesthésie c- en prenant soin de juguler le stress de l’animal par une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention d- avec de nombreuses périodes de "handling" de l’animal e- des jouets sont placés dans leur cage afin qu’ils disposent d’un environnement enrichi. Après chaque manipulation (habituation ou handling) l’animal retourne dans sa cage et est récompensé. La procédure d’habituation permet à la souris de se familiariser avec la contention par la tête. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif et non douloureux de la contention, ainsi que d’associer les sessions de travail à la récompense. e- des jouets sont placés dans leur cage afin qu’ils disposent d’un environnement enrichi. 2- Les injections virales sont classiquement réalisées uniquement sur la base de coordonnées stéréotaxiques calculées pour un individu moyen. Or, premièrement, chaque animal diffère de cette moyenne, et deuxièmement nous visons des structures sous-corticales de petit volume (d’autant plus petit chez la souris). Nous proposons donc de réaliser les injections virales sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation, et diminuant de facto drastiquement le nombre d’animaux inexploitables car injectés en dehors de la zone d’intérêt.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d'étude car il existe présentement des outils moléculaires et génétiques développés chez la souris uniquement, donc non disponibles à ce jour pour d’autres espèces animales. Par exemple, la technique d’optogénétique permet d’activer ou d’inactiver de manière spécifique une région cérébrale. L’impact d’une telle manipulation sur l’activité des régions cérébrales étudiées peut être quantifié, et le rôle fonctionnel de ces régions peut être élucidé. Nous aurons ainsi la possibilité de comparer directement l’activité électrophysiologique, les réponses sensorielles et le comportement chez les mêmes souris avant et pendant manipulation d'une région cible. Chaque animal devient ainsi son propre contrôle, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étude. Nous travaillons avec des animaux de 8 à 16 semaines c'est-à-dire de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale.
Caractérisation de modèles murins d’autisme et développement de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés par plusieurs voies et, pour une partie, une chirurgie stéréotaxique implantant une fibre optique ou une canule, avec douleur post-opératoire et risque d'infection déclarés, pour caractériser des modèles murins d'autisme et tester des traitements. Le porteur affirme que l'autisme, dont le diagnostic repose sur le comportement, "ne peut être modélisé qu'au niveau de l'animal entier". Les bénéfices thérapeutiques annoncés restent formulés comme une perspective.
Objectifs
La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques requière le développement de nouveaux traitements pharmacologiques permettant de soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objet (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique des modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques et (3) l’évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, tout ceci à des fins strictement scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permetra une meilleur compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et permetra de proposer de nouvelles solution thérapeutique pour soulager la pathologie.
Procédures
Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudiés des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subUne partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudiés des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subiront une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés soit via la canule d’injection soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implanté avec une fibre optiqueiront une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés soit via la canule d’injection soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implanté avec une fibre optique
Impact sur les animaux
Pour le groupe d’animaux soumis à des administration répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connue pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique, présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).
Devenir
A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis a mort pour des expériences ex-vivo ultérieur
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront hébergées en groupe sociaux de 2 à 4 individus, en leurs mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture et leur point d’injection. Pour réaliser les chirurgies, nous mettront en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique) ainsi qu’un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous donnerons un traitement anti-inflammatoire à nos animaux pour réduire la douleur et un suivi journalier de la cicatrisation de la plaie ainsi qu’un suivi journalier du poids et de la posture des animaux sera effectué. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.
Validation de mesures d’activité musculaire par télémétrie sur du long terme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
12 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sonde télémétrique est implantée par chirurgie dans un muscle de leur patte, puis l'activité musculaire est enregistrée plus de trente jours avec des séances de marche sur tapis, avant la mise à mort pour prélèvements musculaires. Le porteur décrit une simple étude de faisabilité visant à valider la tenue de l'implant, sans test statistique prévu. Il affirme qu'un tel suivi sur la durée ne peut être mené par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans une étude internationale portant sur l'inactivité physique et ses effets sur les propriétés électriques musculaires. Il s’agit d’une étude de faisabilité pour valider la capacité à mesurer sur une longue période l’activité musculaire de la patte postérieure chez la souris grâce à des sondes télémétriques. La méthode télémétrique permet d’enregistrer des paramètres physiologiques ici l’électromyogramme chez un animal vigil, non contraint et dans son environnement habituel. Ce protocole a pour objectif la vérification du maintien de la sonde électromyogramme (EMG) sur le muscle avec récupération d’un signal exploitable sur plus de 30 jours. Ce suivi longitudinal permettra également de caractériser l’activité musculaire grâce à des mesures de marche rapide sur tapis de course et d’évaluer l’impact d’un implant dans un muscle de la patte postérieure sur le métabolisme de l’animal.
Bénéfices attendus
Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude du système musculaire squelettique et ses altérations lors de situations de dysfonctionnement ou de non-utilisation. Parmi les critères permettant de déceler les altérations musculaires, l’étude de l’activité électromyographique peut fournir des indications précieuses sur le bon fonctionnement ou non du muscle squelettique. Notre projet consiste à affiner une technique d’enregistrement électromyographique par télémétrie chez la souris en évaluant l’impact des implants sur le métabolisme de l’animal et en validant leur tenue sur plus de 30 jours. De plus, nous souhaitons proposer un référentiel pour l’analyse électromyographique avec l’étude de faisabilité sur tapis de course. Ces avancées sur la technique d’électromyographie par sondes télémétriques, permettront d’étudier plus finement les mécanismes impliqués dans l’atrophie musculaire, conséquence liée au vieillissement, à l’immobilité prolongée de certains patients ou dans des pathologies comme le cancer.
Procédures
Les animaux seront équipés par voie chirurgicale d'une sonde télémétrique permettant d'enregistrer l'électromyogramme, caractéristique de l'activité électrique musculaire. La procédure chirurgicale pour implanter la sonde sera d’une durée d’une heure environ sous anesthésie générale avec une prise en charge de la douleur par des analgésiques pendant l’opération et les 2 jours suivants. La souris recevra 3 injections sous-cutanées (SC) le jour de la chirurgie puis 1 injection SC/jour pendant 2 jours. Durée de l’injection SC 30 secondes maximum. Les animaux seront isolés le jour de la chirurgie puis 5 min les 3 jours suivants pour vérifier la présence du signal EMG puis 30 min/jour pendant 42 jours pour la mesure de l’activité musculaire. L’étude du métabolisme par calorimétrie indirecte nécessitera 2 x3 jours d’isolement. Les mesures de marche rapide sont réalisées sur un tapis de course 15 min pendant 2 jours. Les animaux seront manipulés à l’aide d’un tube de transfert pour les changements de cages.
Impact sur les animaux
Notre expérience du modèle nous permet d’avancer qu’aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’implantation des sondes électromyogrammes grâce à l’utilisation d’anesthésique et analgésiques adaptés. La sonde utilisée est constituée d’une partie contenant le module électronique et la batterie (transmetteur) et de 2 électrodes souples pour la mesure des biopotentiels. L’implantation du transmetteur de la sonde en sous cutané permet une meilleure récupération de l’animal (moins invasif qu’une implantation intra-péritonéale) et évite des tensions sur les électrodes placées sur le muscle.Le stress lié à l’isolement (mesures de calorimétrie, mesures de l’EMG) sera réduit au maximum tout en permettant une exploitation correcte des résultats. Les vitesses utilisées pour le tapis de course sont proches de la marche et n’engendreront pas d’effort intense pour la souris. Ces éléments permettent d’estimer des nuisances et effets indésirables modérés pour ce projet. Pour comparaison, cette chirurgie est similaire à celle d’un pacemaker réalisé chez l’homme sauf qu’ici, l’implant permettra seulement l’enregistrement et aucune stimulation ne sera faite sur le muscle.
Devenir
Les 12 animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire pour prélèvements musculaires post mortem. Ces prélèvements seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires et partagés avec nos différents collaborateurs pour compléter nos connaissances sur la fonctionnalité du muscle.
Remplacement
Il s'agit d'un projet portant sur un suivi longitudinal de mesures d’activité électrique musculaire qui, en plus de caractériser l’activité musculaire permettra d’évaluer l’impact d’un implant dans un muscle de la patte postérieure sur une longue période (>30jours). Un tel projet ne peut être mené avec des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
Ce protocole a pour objectif la vérification du maintien de la sonde électromyogramme (EMG) sur le muscle avec récupération d’un signal exploitable sur plus de 30 jours. Il n’est pas envisagé de tests statistiques pour cette étude de faisabilité. Le nombre d’animaux (12) a été réduit au minimum en tenant compte des pertes de la qualité du signal tout en permettant l’obtention de résultats satisfaisants. La méthode télémétrique contribue à limiter le nombre d’animaux utilisés en permettant un suivi continu chez un même animal.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de 3 dans une cage standard utilisé en élevage et hébergement avec un enrichissement dans la cage (coton, igloo, paillage). Les animaux seront anesthésiés par un mélange gazeux et recevront une analgésie adaptée au préalable de la chirurgie et en post-opératoire afin de limiter la douleur liée à l’implantation des sondes. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence du réflexe oculopalpébral et du réflexe de retrait de la patte au pincement. En fin de chirurgie, les animaux seront réhydratés et surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet et dans les 4 heures suivantes. Pour limiter les risques de blessures, les ongles seront coupés sous isoflurane avant le début de la chirurgie et les points de suture seront internalisés puis sécurisés avec de la colle chirurgicale. Un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux pour la chirurgie. Les animaux seront en cage individuelle après chirurgie avec des croquettes et de l’eau gélifiée au sol pour faciliter l’accès puis remis en groupe le lendemain limitant le stress lié à l’isolement. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement. Elles seront remises en cage individuelle uniquement pour le suivi des enregistrements télémétriques (30min/jour) et pour les enregistrements de calorimétrie indirecte (2 x 3 jours). Pour les enregistrements télémétriques quotidiens, nous utiliserons la même cage par groupe de 3 souris. De cette façon, les souris retrouveront les mêmes odeurs que dans leur cage d’hébergement. Au cours de la procédure, seule la litière souillée sera changée pour préserver au maximum l’odeur de la cage. Les animaux seront manipulés à l’aide d’un tube de transfert pour les changements de cages Après l’implantation des capteurs et le suivi post-opératoire, les animaux ne sont plus soumis à aucune intervention susceptible d’induire de la souffrance ou de la douleur grâce à la méthode télémétrique qui permet de suivre l’électromyogramme en continu chez l’animal vigil et non restreint.
Choix des espèces
Afin de pouvoir comparer les résultats avec les études antérieures, il est important de conserver la même espèce animale, à savoir la souris. La souche choisie : C57BL/6J est un modèle polyvalent utilisé dans de nombreux domaines d’application. Les animaux utilisés seront uniquement des mâles. Le sexe mâle a été choisi dans la mesure où ces travaux viennent en prolongement d’études antérieures. Il est donc important de conserver le même sexe pour comparer ces différentes études. Le choix d’animaux adultes de même sexe exclut toute variation possible des résultats suite à des fluctuations ou différences hormonales. Les animaux utilisés seront des mâles adultes, matures au niveau du développement, soit des souris âgées de 9 semaines au début de la phase expérimentale.
Effets protecteurs combinés des bactéries propioniques laitières et des dérivés acides gras polyinsaturés n-6 à renforcer la barrière intestinale et à diminuer le développement de la colite dans un modèle de souris C57BL6.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent des gavages quotidiens puis une colite induite au DSS, connue pour provoquer diarrhées et perte de poids, avant d'être tuées pour prélever leurs organes, afin de tester si des bactéries laitières et des acides gras protègent l'intestin. Le porteur affirme que la complexité de la colite ne peut être modélisée in vitro, y compris par des organoïdes. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin restent au conditionnel.
Objectifs
L’intégrité de la barrière épithéliale intestinale (BEI) est un paramètre physiologique crucial. Elle est compromise dans de nombreuses pathologies à composante inflammatoire, du diabète de type I à l’autisme en passant par les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Malgré les progrès des biothérapies, les patients atteints de MICI ont une qualité de vie très altérée, ne disposent pas de thérapies efficaces et 70% d’entre eux vont devoir avoir recours à la chirurgie au moins une fois au cours de leur vie. Il est nécessaire d’augmenter nos connaissances sur la physiopathologie des MICI et de définir de nouveaux moyens pour renforcer le tube digestif. Un intérêt croissant est donc porté aux composés alimentaires capables de renforcer la BEI. L’objectif de ce projet est de tester un régime riche en dérivés en acides gras polyinsaturés (AGPI) n-6, combiné ou pas à un enrichissement en bactéries propioniques laitières, peut contrer le développement d’une colite induite chez la souris. Nous souhaitons déterminer si des souches de bactéries propioniques peuvent renforcer la BEI, diminuer l’inflammation et freiner le développement de colite par des dérivés AGPI n-6, ou s’il faut combiner les 2 agents pour optimiser une nouvelle stratégie thérapeutique pour les MICI. Notre projet testera l’effet combiné bénéfique de la fermentation propionique et des n-6 (provenant de produits laitiers ou non) sur la santé de notre tube digestif, et déterminera si un produit fermenté seul peut augmenter la biodisponibilité intestinale d’agents protecteurs de la BEI. Il mettra en évidence des mécanismes d’action des produits fermentés mais surtout leur effet santé à maintenir l’homéostasie du tube digestif et à contrer des mécanismes pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de déterminer - si un régime enrichi en AGPI n-6 peut protéger de développement d’une colite - si une supplémentation en matrice laitière contenant une souche précise de bactéries propioniques laitières peut protéger de développement d’une colite - quelle souche peut être utilisée pour protéger de développement d’une colite - si les 2 régimes sont complémentaires ou synergiques
Procédures
La supplémentation en lait fermenté se fait par gavage quotidien avec une contention de moins de 20 sec par animal. Les mesures de perméabilités et de temps de transit se font (1) au début du protocole, (2) avant et après supplémentation, ou non, en lait fermenté (La mesure de perméabilité se fera le jour d’avant, puis le jour d’après la supplémentation en lait pour éviter 2 gavages/jour) et (3) après induction, ou non, de la colite, par gavage avec une solution permettant la mesure de perméabilité et du temps de transit. Le gavage, et donc la contention le permettant dure moins de 20 sec par animal. 4 heures après le gavage les animaux sont à nouveaux manipulés pour leur prélever une goutte de sang à la queue.
Impact sur les animaux
L’induction de la colite par du DSS est connue pour induire des diarrhées (donc une déshydratation potentielle), voir même une perte de poids. Les souris seront surveillées (comportement et mesure du poids) quotidiennement.
Devenir
Procédures 1, 2 et 3 : nous effectuerons le traitement des animaux. Etape importante dans la compréhension de notre problématique et donc essentielle pour garder les animaux en vie Procédures 4 et 5 : ensemble de procédures permettant l’étude digestive en lien avec les traitements effectués en procédures 1, 2 et 3. Les animaux doivent rester dans l’étude à la suite de ces procédures sauf si bien entendu, un des points limites est apparu. Procédure 6 : elle correspond à la fin de l’expérimentation in vivo donc procédure sans réveil et collecte de différents organes afin de réaliser la suite des expérimentations mais cette fois-ci ex vivo.
Remplacement
Le développement de la colite met en jeux différents systèmes cellulaires (bactéries, épithélium, système nerveux entérique, cellules immunitaires, muscles lisses). Il est, au jour J, impossible de modéliser cette complexité par des modèles in vitro de co-culture ou même d’organoïdes.
Réduction
Nous avons déjà travaillé sur les supplémentations en AGPI n-6 ou en bactéries propioniques laitières et avec le modèle de colite induite par le DSS, ce qui nous a permis de faire des calculs de puissance, et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur a de 0.05 et une puissance de 80%.
Raffinement
Une table de points limites est bien sûr établie. Une surveillance quotidienne tout au long du protocole nous permettra de vérifier que le score de point limite reste inférieur à 1, d’augmenter notre surveillance (matin et soir) si le score est de 1 ou de 2, de réhydrater les animaux et de leurs donner des analgésiques s’il est de 3, et de les sacrifier s’il est de 4.
Choix des espèces
Au sein du laboratoire, et plus généralement, le modèle murin de colite induite par le DSS est classiquement utilisé pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Il induit rapidement une inflammation digestive, des défauts de barrière (protocole aigu) et un remodelage tissulaire semblables aux pathologies humaines. Il est, de plus, par la suite applicable sur des souris génétiquement modifiées pour valider des acteurs moléculaires candidats. La supplémentation en AGPI n-6 doit se faire pendant au minimum 8 semaines chez des animaux jeunes. Nous la ferons sur des souris de 3 semaines de vie et pendant 8 semaines.
Impact de l’absence de Npc1 sur la mobilisation des réserves de calcium contrôlées par SERCA3.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
16 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, anesthésiées puis tuées avant tout réveil. Leur cœur est exposé pour prélever le sang par ponction intracardiaque et isoler les plaquettes, afin d'étudier la mobilisation du calcium en lien avec l'activité plaquettaire. Le porteur indique que les plaquettes se conservent mal et que leur production in vitro reste limitée, ce qui l'amène à conclure que l'accès à ces animaux mutants est "la seule approche" possible. Les retombées thérapeutiques annoncées, des antithrombotiques sans risque de saignement, restent formulées comme une perspective.
Objectifs
Le calcium fonctionne comme un messager dans les cellules. Il contrôle ainsi de nombreux mécanismes d'activation cellulaire et nous cherchons à comprendre comment se construisent ces messages afin de mettre au point de nouvelles thérapies. L'objectif de ce projet est d'évaluer si l'absence d'un lipide précis chez une souris modifiée génétiquement, se traduit par un défaut de mobilisation de calcium dans les plaquettes sanguines, calcium qui est impliqué dans l'activation de ces cellules qui jouent un rôle majeur dans l'arrêt du saignement.
Bénéfices attendus
Le blocage de la mobilisation du calcium semble réduire l'activité des plaquettes sanguines, ce qui pourrait réduire les accidents ischémiques (AVC, Infarctus). L'identification des mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité des plaquettes ouvre une nouvelle voie thérapeutique permettant des traitements anti-thrombotiques sans risque de saignement.
Procédures
Les souris sont sous anesthésie générale profonde pour ne ressentir aucune douleur. Un prélèvement sanguin est réalisé par ponction intracardiaque et les plaquettes sanguines sont isolées. L'intervention ne dure que quelques minutes (moins de 5 min).
Impact sur les animaux
contention et injections d'anesthésie/analgésie
Devenir
Les souris sont euthanasiées à la fin de la procédure car pour optimiser la qualité du prélèvement de sang, le cœur est exposé afin de permettre l'insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche.
Remplacement
Les plaquettes sont des éléments cellulaires très fragiles dont la conservation est d’une durée très faible (quelques heures) et dont la production in vitro est encore très limitée. Pour caractériser le signal calcique des plaquettes, il faut utiliser des plaquettes isolées à partir du sang. Les mécanismes que nous étudions ont été observés dans les plaquettes de souris génétiquement modifiées. La possibilité d'avoir accès à ces animaux est aujourd'hui la seule approche pour la concrétisation de ce projet.
Réduction
Pour ce projet, nous avons calculé le nombre d'animaux de façon à obtenir des résultats reproductibles et de prendre en compte la possibilité d'une différence de résultats entre les mâles et les femelles. Les plaquettes issues de chaque animaux seront étudié en utilisant à chaque fois deux des activateurs principaux des plaquettes à plusieurs doses pour être sûr de pouvoir utiliser les données obtenues avec chacun des animaux utilisés.
Raffinement
Au cours de sa captivité en animalerie, le bien-être de l’animal est contrôlé tous les jours et nous avons établi un score concernant les conditions générales de façon à pouvoir définir les points limites pour permettre d'éviter la douleur à son minimum. A leur arrivée, les animaux pourront s’acclimater pendant au moins une semaine. La nourriture sera renouvelée toutes les semaines et nous nous assurerons que les animaux aient une consommation régulière. Pour la procédure, les souris sont anesthésiées. Après l'anesthésie, l'animal est surveillé (respiration, réflexe) pour s’assurer que l’animal ne se réveille pas et reste insensible à la douleur. Si l’animale montre de signe de réveil, mouvement de la patte, une nouvelle dose d’anesthésiant lui sera immédiatement administrée.
Choix des espèces
L’espèce animale sélectionnée pour ce projet est la souris. Nous utilisons cette espèce car elle partage de nombreuses voies de signalisation plaquettaire avec l'homme. Et c'est en utilisant ce modèle animal que nous venons de mettre en évidence cette nouvelle signalisation. De plus le modèle murin permet l'utilisation d'animaux transgéniques qui fournissent des plaquettes sanguines portant ces mutations et qui sont impossible à produire in vitro. La possibilité de disposer d’une lignée génétiquement modifiée est un atout essentiel pour montrer ces effets protecteurs et permettre de développer une approche thérapeutique par la suite. Les souris seront utilisées à taille adulte permettant de récupérer un volume de sang suffisant pour purifier suffisamment de plaquettes de bonne qualité.