Souris

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du côlon humain sont greffées dans leur caecum par chirurgie, puis la tumeur est suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à trois mois, 266 souris recevant en plus douze injections d'inhibiteurs dans la queue. Le porteur décrit des atteintes digestives et un amaigrissement liés au développement tumoral, et vise à valider les canaux sodiques NaV comme cible thérapeutique. Il affirme que la complexité multicellulaire du cancer ne pouvant pas être étudiée in vitro, le recours aux souris est "indispensable".

Objectifs

Il a été montré l’expression aberrante des canaux sodiques dépendants du voltage NaV dans les cellules cancéreuses et leur implication dans la progression des cancers. Ces canaux sont anormalement exprimés dans les biopsies humaines de carcinomes, et dans des cellules cancéreuses non-excitables de différentes origines épithéliales. C’est le cas de NaV1.5 qui est anormalement exprimé dans le cancer du sein et dans le cancer sporadique du côlon, et dont le niveau d’expression semble associé à un mauvais pronostic chez les patients. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. Quant à NaVBeta4, son niveau d’expression est réduit dans les tissus cancéreux coliques en comparaison des tissus non-cancéreux appariés. L’inhibition de l’expression de NaVBeta4 dans les cellules cancéreuses coliques SW60 et HCT116 augmente l’invasivité cellulaire in vitro. L'hypothèse de notre client est que les canaux NaV1.5, qui peuvent être inhibés par des composés pharmacologiques existants ou en cours de développement, pourraient représenter des cibles pour des nouvelles thérapies anticancéreuses. Pour valider cette hypothèse, il est important d’utiliser un modèle orthotopique de cancer colique qui consistera à greffer au niveau du caecum de souris, des cellules cancéreuses coliques humaines (HCT-116 ou SW620) bioluminescentes. Les souris que nous utiliserons seront donc des souris immunodéficientes, à phénotype dommageable, qui seront hébergées en portoir ventilé dans des conditions n'entraînant pas l'expression du phénotype.

Bénéfices attendus

La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse.

Procédures

482 souris auront des greffes de cellules tumorales au niveau du caecum (procédures 1, 2, 3, 4) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirurgie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 482 souris auront une imagerie de bioluminescence 1 fois par semaine à partir du 7ème jour post greffe sous anesthésie gazeuse Isoflurane 2% dans l’air avec injection vigile 4 minutes avant l’examen de 100µL de luciférine par voie intrapéritoléale pour le suivi de la prolifération tumorale. En parallèle une échographie sera réalisée 1 fois par semaine ou toutes les 2-3 semaines en fonction de la vitesse de prolifération des tumeurs. Ces 2 examens successifs ont chacun une durée inférieure à 10min et seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% dans l'air), sur support chauffé à 37°C. Par ailleurs, un monitoring cardio respiratoire est réalisé simultanément en cours d’échographie qui permet de s’assurer que l’animal supporte bien l’examen. Soit sur une durée de 3 mois (temps maximal de l’étude) chaque souris aura 11 séances d’imagerie de bioluminescence et 11 séances d’imagerie échographique au maximum. 266 souris vigiles (procédures 2, 3 et 4) recevront 3 fois/semaine pendant 4 semaines (= 12 injections par souris) 150-200μLd’inhibiteurs par voie intraveineuse au niveau de la queue.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus pour les animaux sont liés au développement d'une tumeur primaire au niveau du colon et éventuellement de métastases (problèmes digestifs, amaigrissement).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chque procédure.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres complexes, multicellulaires et multiorganes, ne pouvant pas être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études pharmacologiques sur animaux sont nécessaires. Les expérimentations pourront mettre en évidence un nouvel acteur du développement métastatique, les canaux NaV, qui pourraient servir de nouveau marqueur prédictif et éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer colique.

Réduction

La mise en oeuvre de l'imagerie permet un suivi longitudinal du même animal ce qui permet de réduire leur nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale primaire et secondaire (métastases) sera réalisé par imagerie de bioluminescence in vivo et d’échographie, approches non invasives et indolores pratiquées par ailleurs sur animal anesthésié. Des antalgiques seront utilisés lors de la chirurgie et 24h après. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé et en accord avec les directives européennes. des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel observera quotidiennement les animaux afin d'anticiper la souffrance animale.

Choix des espèces

Dans notre projet, les informations attendues ne peuvent pas être obtenues in vitro car à ce jour l'animal de laboratoire reste le seul recours permettant d'étudier le développement tumoral et l'efficacité thérapeutique en tenant compte de la complexité de la physiologie d'un organisme vivant. La souris est un animal chez qui il est possible d'obtenir le développement de tumeurs d'origine murine et humaine. La souris est ainsi une espèce animale classiquement utilisée, pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), de par la possibilité d’avoir accès à des animaux immunodéprimés permettant l’implantation de cellules cancéreuses humaines, ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo (bioluminescence, échographie). Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris adulte (6 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, nous avons rencontré des difficultés pour implanter des cellules tumorales humaines avec un taux de prise de greffe moins important.

Vérifier sur la souris l'effet d'une lumière dirigée vers le crâne sur des lésions de type Alzheimer permettrait, écrit le porteur, d'"entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine". 100 souris, dont 60 femelles génétiquement modifiées pour développer ces lésions, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant onze à douze mois, elles reçoivent chaque jour trente minutes de lumière dans leur cage, à une heure qui varie selon les groupes, subissent trois prises de sang éveillées sous la mâchoire, puis un à deux mois de tests : labyrinthe radial à huit bras, labyrinthe de Barnes, Rotarod et open field. Sous une dose létale d'anesthésique, leur sang et leur liquide céphalo-rachidien sont prélevés avant une perfusion par le cœur. Le porteur affirme qu'"un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux, en prenant en compte des connaissances du modèle transgénique par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en prenant en compte des paramètres statistiques sur le logiciel G*Power (f=0.25, pouvoir statistique=0.7, p value

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse.

2 700 souris, soit 1 200 adultes et 1 500 souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent une vingtaine d'injections, sont maintenus tête fixée jusqu'à une heure et équipés d'électrodes cérébrales, avant une perfusion cardiaque terminale, pour étudier le rôle de l'ocytocine dans les comportements maternels. Le porteur indique que les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère, parfois sédatés, puis tués car ils ne peuvent être gardés sans elle. Il affirme que l'étude d'animaux vigiles en comportement rend l'in vitro et l'in silico impossibles.

Objectifs

L’ocytocine (OXT) est un neuropeptide synthétisé par les neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN), principalement connu pour son rôle dans la lactation et l’accouchement suite à sa libération dans la circulation sanguine. Cependant, des études récentes mettent en évidence les effets de l’OXT sur le système nerveux central, notamment sur les comportements sociaux et maternels. Chez les rongeurs, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Dans le système olfactif, le cortex piriforme (PIR) est un des premiers et principal relais en aval du bulbe olfactif. Il présente chez la souris une densité exceptionnelle de récepteurs à l’OXT par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous avons fait l’hypothèse que l’OXT dans le PIR est nécessaire à la mise en place de comportements maternels chez des souris femelles. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours, et manipuler la transmission oxytocinergique dans le PIR pour tester le rôle de l’OXT au niveau comportemental ainsi qu’au niveau des réponses neuronales.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux. Elles seront soumises à des injections et à des phases de contentions pendant les périodes d'habituation et d'expérimentation (environ 20 injections par souris, moins de 3min par injection/jour). Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir certaines souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. La durée de contentention par maintien de la tête en position fixe n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, nous prévoyons aussi de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable (injections réalisées dans un autre établissement) et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

Les 1200 souris adultes pourront être mises à mort par perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale avec traitement antidouleur adapté. La préservation du tissu nécessite que cette procédure de perfusion soit réalisée et permet ainsi de réaliser des contrôles histologiques en fin d’expérimentation. Cette procédure, en utilisant la voie circulatoire sanguine, favorise la pénétration du fixateur dans les tissus de manière homogène et suffisamment rapide pour empêcher la détérioration du tissu cérébral en condition d'anoxie (normalement engendrée par l'arrêt cardiaque). Les 1500 souriceaux seront aussi euthanasiés à la fin des procédures car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 2700 (1200 souris adultes et 1500 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’oxytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux entre P1 et P10 seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne créant un défaut osseux sous anesthésie, puis un suivi par imagerie avant mise à mort échelonnée jusqu'à 60 jours, pour étudier le rôle d'une molécule de l'inflammation dans la cicatrisation osseuse. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, hémorragie et rarement une hypertension intracrânienne constituant un point limite. Il affirme que les modèles in vitro et ex vivo ne reproduisent pas la complexité cellulaire ni l'apport vasculaire, rendant le recours à un modèle in vivo nécessaire.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de caractériser le rôle d’une molécule clé de l’inflammation (interleukine 33) dans la réparation osseuse. En effet l’interleukine 33 est une cytokine (protéine soluble jouant un rôle de signal) jouant un rôle important dans le maintien de l'éauilibre des tissus et dans la défense contre les infections parasitaires. Le dérèglement de cette cytokine est impliqué dans de nombreux phénomènes allergiques et inflammatoires chroniques. Cette molécule est plus présente dans l’os ostéoporotique et joue un rôle protecteur chez la femme ménopausée1. En revanche son rôle dans la cicatrisation osseuse après une fracture ou une chirurgie orthopédique reste inconnu. Cette étude scientifique nous permettra de mieux comprendre son rôle dans la réparation osseuse pour pouvoir moduler ses effets lors de la phase inflammatoire de la cicatrisation osseuse et pour, in fine, améliorer la réparation osseuse. Enfin, nous voulons connaitre l’influence de l’âge sur l’expression de cette molécule pour pouvoir améliorer la prise en charge clinique de la cicatrisation osseuse chez les patients âgés et affiner la prise en charge pour une médecine plus personnalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le contexte des recherches en immuno-ostéologie. En effet, ces expérimentations permettront, dans un premier de temps, de mieux comprendre l’influence de l’âge sur le profil inflammatoire après des résections osseuses de différentes tailles. Par ailleurs, ces études vont permettre d’améliorer nos connaissances sur l’influence d’IL33 dans ce processus de cicatrisation osseuse. Enfin, les bénéfices à long terme d’un tel projet sont l’amélioration de la prise en charge des patients jeune et âgés souffrants de pertes osseuses importantes et une meilleure prise en charge de la cicatrisation osseuse chez les patients jeunes et âgés.

Procédures

Tous les animaux (320 souris) seront soumis à J0 à une chirurgie de la calvaria (procédure 1), conduite sous anesthésie générale de 30-45 minutes. Une analgésie pré- et post-opératoire (3 jours) sera fournie. Les animaux seront mis à mort à J2, J9, J14, J30 et J60 post-opératoires. La moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera également soumise à une analyse en bioluminescence de l’inflammation (procédure 2) à J2, J9, J14, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore. L’autre moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera soumise à une analyse au microscanner de la formation osseuse à J2, J9, J14, J30 et J60, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore.

Impact sur les animaux

La chirurgie sur calvaria de souris peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, ou un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire ou post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). L’hypertension intracrânienne est une complication rare et constitue un point limite. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire immédiat peut-être également observé occasionnellement. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire), qui constitue également un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs dans notre étude (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). Les anesthésies nécessaires à l’imagerie non invasive en micro-CT et en BLI vont également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Suite à la chirurgie sur la calvaria tous les animaux seront gardés en vie. Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de l’étude : J2 (64 souris), J9 (64 souris), J14 (64 souris) J30 (64 souris) J60 (64 souris). Suite à l’analyse en bioluminescence (procédure 2, 32 souris) à J2, J9 J14, ou en microscanner (procédure 3, 32 souris) à J2, J9 J14, J30 les animaux seront réveillés et gardés en vie. A J60, les animaux seront mis à mort juste après l’examen (sans réveil).

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénoués de système vasculaire. Or la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier le rôle d’IL33 dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir un test statistique significatif (puissance de test 90%, seuil de signification < 0,05) est de 6 /groupe /temps / type d’analyse, mais le nombre d'animaux inclus dans les expérimentations sera de 8/groupe /temps / type d’analyse, afin de conserver une puissance statistique malgré la perte inopinée de certains animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. De plus, la réparation osseuse et l’inflammation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort. Afin de réduire le nombre de procédure subies par les animaux, seuls les animaux mis à mort à J60 seront soumis l’imagerie non invasive en micro-CT J2, J9, J14, J30 et J60 et en BLI à J2, J9, J14. Les variables quantitatives seront testées pour leur normalité (test de Kolmogorov-Smirnov). Si les variables suivent une loi normale, elles seront analysées par des modèles de régression linéaire générale basés sur l’analyse de variance et les effets significatifs testés par un test post-hoc (LSD-Fisher). Sinon, un test non-paramétrique de Kruskal-Wallis sera utilisé pour une comparaison globale entre les groupes et un test de Mann-Whitney pour une comparaison de groupes deux par deux.

Raffinement

L’état général de l’animal et du site chirurgical seront évalués grâce à un tableau scoré. Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. Suite à la procédure chirurgicale des points surveillés et scorés (feuille de score) sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques cette procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des soins et une médication analgésique appropriés post-opératoires seront mis en place pour s’assurer de l’absence de douleurs ou d’inconfort. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si les points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), papier et dôme cartonné afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris initialement hébergées ensemble (3 ou 4 souris/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les animaux seront également observés visuellement quotidiennement par les zootechniciens.

Choix des espèces

Souris C57/BL6 : Modèle de défaut de calvaria de référence dans la littérature internationale, fiable, reproductible, peu couteux ; souche la plus décrite dans la réparation osseuse et l’analyse de l’inflammation 1 Souris adultes de 8 semaines (jeunes) : âge optimal pour analyser la réparation osseuse ; à ce stade aucune influence de la croissance sur le crâne. Souris adultes 18 mois (âgées) : âge optimal pour analyser l’effet du vieillissement sur la réparation osseuse.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un mélanome à métastases pulmonaires, elles reçoivent des injections intraveineuses, des inoculations intranasales d'un parasite et des prises de sang, pour identifier les cellules immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et que la mort survient rapidement après l'apparition des symptômes, la mise à mort étant planifiée juste avant. Il reconnaît qu'une approche in vitro a été développée en amont mais affirme qu'elle ne reproduit pas un modèle de régulation complexe.

Objectifs

Les premiers résultats publiés montrent que l’injection intratumorale de tachyzoïtes de Neospora caninum et de N. caninum modifiés pour sécréter de l’IL15 permet le contrôle du développement d’une tumeur sous-cutanée solide EG-7 par action oncolytique, induction d’une forte réponse immunitaire et reprogrammation de l’environnement tumoral. De même, l’efficacité de N. caninum dans un modèle murin de mélanome à métastases pulmonaires (B16F10) a été démontrée par voie sous-cutanée, intraveineuse et intranasale avec une très bonne protection antitumorale induite par voie intraveineuse et intranasale. Le modèle de mélanome à métastases pulmonaires est à la fois un modèle plus relevant d’un point de vue clinique humaine puisqu’il s’agit d’un cancer contre lequel nous avons besoin de développer de nouvelles approches thérapeutiques efficaces, mais aussi un modèle nous permettant d’étudier la réponse antitumorale induite par N. caninum dans un modèle métastatique. La réponse antitumorale induite par N. caninum dans ce modèle a été caractérisée, il nous faut maintenant déterminer si les populations cellulaires qui sont recrutées dans les poumons des souris traitées sont indispensables à la réponse antitumorale et de confirmer ainsi leur rôle. Le rôle des populations cellulaires présentes dans les poumons sera étudié par déplétion locale de ces dernières (n=420souris).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet nous pourrons identifier les cellules immunitaires dont le rôle est primordial dans la réponse antitumorale induite par N. caninum. En effet, si nous observons un développement tumoral après traitement par N. caninum chez les souris ayant une population cellulaire déplétée, nous pourrons conclure que le rôle de cette population cellulaire est primordial dans la réponse antitumorale. En plus de déterminer quelles populations cellulaires sont impliquées dans la réponse antitumorale, nous pourrons aussi déterminer dans quelle mesure elles sont impliquées.

Procédures

Lot témoin non traité : 1 injection intraveineuse (1 minute), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur au niveau pulmonaire peut induire chez la souris une souffrance due à une difficulté respiratoire. Les effets indésirables pouvant apparaitre sont : - Signes cliniques modérés : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/hyporéactivité, stéréotypies, Poil piqué, Coloration anormale de la peau, Flacidité musculaire généralisée, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée, Perte de poids inférieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Diminution/absence de prise de nourriture. - Signes cliniques : Akinésie, Tremblements généralisés, Convulsions, Persistance du pli cutané, Voussure du dos/dos cambré, Difficultés respiratoires, Perte de poids supérieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Absence de prise de nourriture> à 2 jours. L’apparition des symptômes précède de peu l’apparition des points limites et la mort de l’animal, qui surviennent rapidement (généralement en deux à trois jours). Dès l’apparition des symptômes sur l’une des souris du lot contrôle, l’ensemble des animaux des animaux sera mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si les points limites cités précédemment sont atteints, les animaux seront mis à mort sans délai. D’après notre expérience, le développement de la tumeur sans traitement devrait conduire à l’apparition des symptômes cités précédemment vers J30 et conduira à la mise à mort des animaux sans délai. Ce délai d’apparition des symptômes est pris en compte lors du développement du protocole expérimental et la mise à mort des animaux est planifiée pour être réalisée quelques jours avant l’apparition des premiers symptômes pour éviter toute souffrance aux animaux.

Devenir

Afin de pouvoir étudier la réponse immunitaire induite par N. caninum lors du traitement des nodules pulmonaires et de déterminer l’impact de l’absence d’une population cellulaire spécifique sur cette réponse immunitaire, nous devons mettre à mort les animaux pour collecter les poumons et étudier la réponse locale dans cet organe. Il n’existe à ce jour aucune méthode nous permettant de nous affranchir de la mise à mort des animaux.

Remplacement

Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation des composés sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques (disponibles sur Anastats.fr) garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature. L’étude statistique des résultats sera réalisée avec le test non paramétrique Kruskall-Wallis pour l’étude des réponses immunitaires humorale (titre en anticorps) et cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude du développement tumoral.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les normes réglementaires, en animalerie A2 à raison de 5 souris maximum par cage sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites.

Choix des espèces

Les souches de souris immunocompétentes sont adaptées à la greffe de cellules tumorales syngéniques présentant le même fond génétique que la souche de souris utilisée. Dans le cadre de précédentes études chez la souris, l’utilisation de protozoaires en tant que thérapie antitumorale a montré des résultats probants. Adulte. Il n’y pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants.