Souris

1 088 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un surdosage de paracétamol par injection pour provoquer une atteinte du foie, puis sont tuées par dislocation cervicale afin de prélever foie, rate et reins. Le porteur affirme que le surdosage entraîne un inconfort mais aucune douleur dans les vingt-quatre heures. Sur le remplacement, il affirme que l'intoxication au paracétamol est un processus complexe non modélisable in vitro et une étape préclinique "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de trouver de nouveaux traitements de l'insuffisance hépatique induite par le paracétamol.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements de l'intoxication au paracétamol basés sur l'utilisation de la N-Acétyl Cystéine et d'inhibiteurs de nécrose régulée.

Procédures

Deux injections intrapéritonéales pour procédure 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs", une injection intrapéritonéale et une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie isoflurane pour procédure 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse", et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant sacrifice par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Le traitement par un surdosage contrôlé de paracétamol entraine certes un inconfort des animaux mais il n’est pas accompagné de douleurs dans les 24h qui suivent son injection (actions antalgique et antipyrétique du paracétamol).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après la procédure n° 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs" (soit 960 souris) ou la procédure n° 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse" (soit 128 souris). Tous les animaux (1088 souris) sont mis à mort après la procédure n°3 "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale" afin de prélever les différents organes (rate foie et reins) pour les analyses.

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celle posée dans notre projet cherche à identifier le rôle protecteur d’une molécule vis-à-vis d’une pathologie, l’intoxication au paracétamol qui implique un grand nombre d’évènements moléculaires et cellulaires. Cette pathologie est un processus complexe non modélisable in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées (1088) dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques par des tests non paramétriques Kruskal-Wallis, Mann et Whitney et Spearman.

Raffinement

L’étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaise induits par le traitement. Enfin nous avons anticipé l’étude de tous les organes pertinents (3) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d’informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Adulte de 9 semaines pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes.

2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis l'implantation d'une micro-LED sur le crâne, avant des tests moteurs et des injections de L-dopa destinées à reproduire les mouvements anormaux des patients parkinsoniens. Le porteur indique que le modèle provoque hypoactivité, perte de poids et mouvements involontaires, qu'il décrit comme non douloureux. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit la physiopathologie cérébrale et sa traduction comportementale.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester le potentiel thérapeutique d'une méthode peu invasive de stimulation du cerveau dans la maladie de Parkinson. Le traitement symptomatique de la maladie de Parkinson repose sur la substitution de la dopamine manquante par la L-Dopa. Cependant, après plusieurs années sous L-Dopa, les patients développent des complications motrices : les dyskinésies (mouvements anormaux involontaires). Une alternative thérapeutique non médicamenteuse peut alors être proposée à certains patients: la stimulation cérébrale profonde à haute fréquence du noyau subthalamique (HFS-STN), un des noyaux des ganglions de la base. Il s’agit d’un traitement neurochirurgical symptomatique très efficace, mais qui présente l’inconvénient majeur d’être invasif et de ne profiter qu’à une minorité des patients du fait de critères d’éligibilité stricts (environ 10%). Certains types de neurones dans le cortex moteur sont activés par la HFS-STN, et la stimulation directe de ces neurones par la lumière (grâce à une fibre optique implantée dans le cerveau) dans des souris transgéniques parkinsoniennes permet de reproduire partiellement les effets bénéfiques de la HFS-STN sur les symptômes moteurs dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie thérapeutique moins invasive que la stimulation cérébrale profonde, donc pouvant potentiellement bénéficier à plus de patients. Dans cette étude, nous optimiserons cette voie thérapeutique chez des souris modèle de la maladie de Parkinson sur deux axes : 1) en mettant au point une méthode d'activation neurones moins invasive : illuminer à travers le crâne à la place d'insérer une fibre optique dans le cerveau 2) en comparant les effets de la stimulation sur de nouvelles localisations pour sélectionner celle qui induit les meilleurs effets bénéfiques sur les symptômes parkinsoniens.

Bénéfices attendus

Cette étude s'insère dans un projet plus large de mise au point de techniques alternatives à la stimulation cérébrale profonde dans la maladie de Parkinson. En effet cette technique est très invasive et ne peut donc bénéficier qu'à environ 10% des patients. Certains types de neurones du cortex moteur, activés par la stimulation cérébrale profonde, constituent des cibles thérapeutiques plus superficielles donc moins invasives. La stimulation par la lumière de ces neurones améliore les symptômes moteurs dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris, mais nécessite l'insertion d'une fibre optique dans le cerveau. Cette étude permettra de tester et mettre au point une méthode moins invasive de stimulation par la lumière des neurones du cortex : à travers le crâne intact.

Procédures

Les souris du lot de mise au point subiront 1 chirurgies d'injection cérébrale sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour la mise au point technique et dans le groupe contrôle non parkinsonien n'auront que peu d'effets indésirables : en effet, les lignées transgéniques utilisées n'ont pas de phénotype dommageable, et toutes les mesures sont prises pour prendre en charge la douleur péri-opératoire. Pour les souris modèles de la maladie de Parkinson, nous nous attendons à diminution de l'activité et une perte de poids durant les deux premières semaines, pendant lesquelles elles bénéficieront d'un suivi renforcé pour minimiser au maximum les nuisances. Après stabilisation, ces souris présenteront également des modifications à long terme du comportement moteur (légère hypoactivité, asymétrie de l'usage des membres). Ces modifications sont inhérentes au modèle parkinsonien, et nécessaires pour tester les effets bénéfiques de la stimulation, et ne causent pas de douleur. Après induction des dyskinésies (mouvements anormaux involontaires), les souris présenteront temporairement après chaque injection des mouvements involontaires (rotations, posture tournée d'un côté, tics des pattes et tics faciaux). Là aussi ces nuisances sont non douloureuses et nécessaires pour pouvoir tester les effets bénéfiques de la stimulation dans les conditions les plus proches de celles vécues par les patients parkinsoniens.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées et du modèle parkinsonien.

Remplacement

Pour étudier le bénéfice des stimulations proposées sur les symptômes moteurs de la maladie de parkinson, il est nécessaire d'utiliser des animaux produisant un comportement moteur (et modèles de cette maladie). Aucune méthode de simulation informatique ne permet de récapituler la complexité de la physio-pathologie cérébrale, et encore moins sa traduction comportementale. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.

Réduction

Trois conditions sont testées sur les mêmes animaux (Parkinson, et 2 états dyskinétiques) pour réduire le nombre total d'animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: une anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, un suivi post-opératoire quotidien et adapté tout au long de l'utilisation des animaux, et renforcé dans le cas des modèles de la maladie de Parkinson (maintien au chaud, nourriture appétante et hypercalorique, surveillance et maintien de l'hydratation, analgésique selon nécessité), pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation (en général 2 semaines). Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher).

Choix des espèces

Il est nécéssaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différement chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à cette étude. adulte : il est nécessaire d'étudier l'effet de la stimulation cérébrale sur un animal dont le cerveau est complètement développé

216 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections dans l'abdomen puis développent un cancer de la prostate avant d'être disséquées pour étude de la prostate. Le porteur présente l'étude comme un projet pilote destiné surtout à mettre au point le protocole expérimental. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses.

Objectifs

Afin de mieux comprendre l’évolution des cancers de la prostate (CaP), ce projet pilote ,utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées, vise à déterminer le protocole expérimental pour identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses présentant des mutations et une cinétique similaires que celles trouvées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

ce projet pilote déterminera le protocole expérimental permettant d'identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses.

Procédures

Les souris subiront au maximum 9 injections intra-péritonéales espacées de 1 à 10 mois, soit 1 injection quotidienne en intra-péritonéales pendant 5 jours de tamoxifène dans un premier temps, et 1 injection quotidienne d'EdU pendant 4 jours au temps de cinétique choisi. Aucune autre intervention n'est prévue.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques injectées développeront des cellules tumorales qui évolueront en cancer de la prostate (CaP). De plus, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (pas de zone rouge autour de la zone ou de présence de pus).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure 1 et 2 afin d'être disséqués pour l'étude de la prostate.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du CaP, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 2 lignées de souris différentes soit 216 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et des études pilotes pour identifier le protocole efficace ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé, est inactif après stimulation, ou si les points d'injections présentent des signes d'infection ou d'inflammation il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines à plus d'un an afin de faire une cinétique en fonction de l'âge.

16 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux puis des injections quotidiennes d'immunosuppresseurs pouvant s'étaler sur seize semaines, avec des prélèvements de sang répétés, l'immunosuppression pouvant provoquer des infections opportunistes et une perte de poids. Ce criblage sert à préparer une thérapie génique destinée à des enfants atteints d'une maladie osseuse rare. Le porteur décrit la souris comme une "espèce inférieure" servant à trier vecteurs et traitements avant des essais sur primates, qu'il présente comme le "modèle de prédilection".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large qui inclut un projet déjà en cours dans le même établissement utilisateur. L’objectif du programme est de développer des traitements pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2. L’objectif de ce projet est d’identifier un traitement immunosuppresseur pouvant être utilisé en combinaison avec un traitement de thérapie génique pour différents types de dysplasies squelettiques. Les traitements de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteurs viraux peuvent induire des réponses immunitaires pouvant réduire l’efficacité du traitement (diminution du niveau d’expression du gène d’intérêt ou élimination des cellules transduites) et empêcher la ré-administration efficace de ce dernier (réponse mémoire dirigée contre le vecteur viral). Il est donc nécessaire d’inhiber de façon transitoire les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la fois d’identifier la ou les constructions de vecteurs viraux les moins immunogènes, et la stratégie d’immunosuppression la plus efficace entrainant le moins de complications. Ces résultats, combinés à ceux d’un autre projet en cours permettront d’identifier, chez la souris, la combinaison vecteur viral / immunosuppression la plus efficace et la moins toxique. Ces étapes de pré-sélection chez la souris permettront de diminuer le nombre de sujets dans les futures études sur animaux supérieurs (type primates) aux caractéristiques plus proches de celles de l’Homme. Le bénéfice final du projet est de développer des traitements (combinaison thérapie génique / Immunosuppression) pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et de multiples injections d’immunosuppresseurs par voie intrapéritonéale. Ces dernières se feront sur une durée maximum de 16 semaines (injections IP quotidiennes sur un maximum de 21 jours consécutifs ou injections hebdomadaires sur un maximum de 16 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements répétés de sang (toutes les semaines, ou toutes les deux semaines sur une durée maximale de 16 semaines) dans la mesure du possible (effectués sur des animaux d’un mois minimum). Ces prélèvements s’effectueront sous anesthésie au niveau de la veine mandibullaire en alternant chaque côté. Des prélèvements de sang terminaux seront également effectués sous anesthésie sur tous les animaux par la voie rétro-orbitale.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection de vecteurs viraux (résultats obtenus dans le cadre d’un précédent projet). Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. En cas d’infection, les souris pourraient être sujettes à des pertes de poids ou des signes d’inactivité.

Devenir

Toutes les souris utilisées au sein de ce projet seront mises à mort par dislocation cervicale, asphyxie au CO2 ou injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique (de type Euthasol 140 mg/kg ou Euthoxin 500 mg/kg). La mise à mort est nécessaire afin de récupérer un ensemble d’organes (rate, foie, moelle osseuse, plaques de croissance…) pour évaluer à la fois la biodistribution des vecteurs viraux testés, mais aussi l’effet du traitement (vecteur viral et immunosuppresseur) sur la réponse immunitaire cellulaire.

Remplacement

Globalement, la construction des vecteurs viraux et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur capacité à transduire efficacement des cellules modèle (HEK293). Si la transduction n’est pas efficace, le vecteur ne sera pas sélectionné pour les études in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier des traitements immunosuppresseurs d’intérêt, d’autant plus sachant que la patientèle sera constituée en totalité d’enfants. Il est très difficile de valider une stratégie d’immunosuppression par des tests in vitro sachant que cela nécessite la présence d’un système immunitaire complet et fonctionnel. Certains immunosuppresseurs seront tout de même évalués à l’aide des tests in vitro mentionnés précédemment afin de confirmer qu’ils n’impactent pas la capacité des vecteurs à transduire efficacement les cellules modèles.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 8 animaux par groupe sera suffisant pour comparer de manière significative les niveaux d’anticorps et les réponses cellulaire induites. En effet, l’utilisation d’outils statistiques (calcul de puissance de test et de taille d’échantillons, https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#) permet de définir un nombre minimal d’animaux de 8 par groupe, en considérant un seuil de significativité (p

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage et par sexe dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage sera soumise à un enrichissement du milieu de type tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. L’hébergement des animaux en zone SPF (Specific Pathogen Free) dans des cages ventilées, l’utilisation de hottes de change, ou de hotte à flux laminaire pour les expérimentations, et l’apport d’aliments irradiés, permettront de réduire ces risques au minimum. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima deux fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée (observation et pesée quotidienne) et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire

Choix des espèces

Afin d’identifier une combinaison vecteur / immunosuppression applicable en clinique chez l’homme, il est important de la valider au préalable au sein d’un modèle animal. En effet le système immunitaire fonctionne au travers de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire fidèlement en dehors d’un organisme vivant. Les primates non humains représentent le modèle de prédilection de par son anatomie proche de celle de l’Homme. Il est cependant impossible de cribler autant de paramètres différents (vecteur, dose, immunosuppresseur, dose, fréquence) chez cette espèce. Nous allons avoir besoin d’une espèce inférieure, i.e. la souris, pour cribler les vecteurs mais aussi les traitements immunosuppresseurs pertinents. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles (1 à 22 jours). Les études qui consistent à évaluer la cinétique de la réponse immunitaire (Procédure n°1), cribler les différents traitements immunosuppresseurs (Procédure n°2) et évaluer l’efficacité d’une seconde injection de vecteur viral (Procédure 3) seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 5 à 8 semaines. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles avec des traitements allant de la naissance jusqu’à un âge de 4 mois maximum (procédures n°4 et 5).

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe d'un million de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, puis est tuée par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque entre 3 et 28 jours plus tard, pour étudier l'influence des fibres nerveuses sur le cancer du sein. Le porteur indique que les cellules mises en co-culture avec des neurones peuvent donner des tumeurs plus volumineuses voire des métastases. Sur le remplacement, il décrit un test de co-culture in vitro déjà mis au point mais affirme qu'il ne reproduit pas la complexité de l'organe, d'où le recours aux souris.

Objectifs

Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Dans ce cancer l'environnement autour des cellules cancéreuses joue un rôle crucial. Récemment, un nouvel élémentde cet environnement tumoral a été identifié : les prolongements des neurones (axones) du système nerveux périphérique. S’il est maintenant clairement établi que certaines cellules de l'environnement tumoral influencent la progressiondu cancer, le rôle des cellules nerveuses et notamment des fibres nerveuses infiltrant les tumeurs reste mal compris. Nous proposons donc d’étudier l’influence du système nerveux dans le développement des cancers du sein. Ainsi, le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle de l’innervation au sein des tumeurs mammaires et de caractériser les interactions entre les projections nerveuses et les cellules tumorales. Nos données in vitro ont montré que les cellules cancéreuses de cancer du sein de souris co-cultivées avec des neurones étaient capables de proliférer plus rapidement que les cellules cancéreuses cultivées seules. Nous souhaitons donc à travers ce projet valider ce résultat chez la souris. Dans un premier temps, nous étudierons le développement tumoral d’une implantation dans la glande mammaire de cellules cancéreuses de souris ayant été au préalable en co-culture pendant 6 jours avec des neurones. Nous utiliserons comme contrôle des cellules tumorales ayant été en culture seules 6 jours avant implantation. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite). Pour finir, dans une deuxième et dernière procédure, nous souhaitons vérifier que le caractère pro-tumoral des cellules cancéreuses est bien dû à la présence des neurones. Pour cela, nous induirons une mort des neurones en traitant nos cellules avec une drogue en co-culture avant l’implantation dans la glande mammaire. Nous utiliserons comme contrôle des cellules cancéreuses ayant été en culture seules 6 jours avant implantation et traitées avec la drogue induisant la mort neuronale. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite).

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va donc identifier de nouvelles interactions entre les neurones et les cellules cancéreuses applicables dans la lutte contre les cancers. A ce jour, les thérapies couramment utilisées en clinique ciblent principalement les cellules tumorales (chimiothérapie) et, plus récemment, le microenvironnement tumoral en visant les vaisseaux sanguins de la tumeur. L’identification des mécanismes à l’origine du dialogue entre les neurones et les cellules cancéreuses sera une avancée majeure pour le traitement des cancers et pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de lutter contre le développement de la tumeur primaire mais aussi des métastases.

Procédures

Les souris reçoivent une injection de 1 000 000 de cellules tumorales implantées avec une seringue à insuline (29 G) au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 2-3 minutes, temps nécessaire à l’injection des cellules dans la glande mammaire).

Impact sur les animaux

La lignée de cellules cancéreuses utilisée est issue d’un carcinome mammaire spontané apparu chez la souris femelle, et est décrite comme peu agressive et non métastatique. En effet, ces cellules ne sont pas capables de sortir du site d’injection primaire et le volume tumoral moyen à 28 jours n’excède pas 1cm3. Aucune métastase n’est donc détectée dans les poumons, le foie et les ganglions lymphatiques 7 semaines après implantation. Dans nos procédures, nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale. Cependant, nos données in vitro montrent que la co-culture de ces cellules avec des neurones sympathiques augmente les capacités oncogéniques des cellules tumorales. Il est donc possible que les cellules cancéreuses ayant été en co-culture soient plus agressives et donnent donc des tumeurs plus volumineuses ainsi que des métastases. Dans nos procédures, nous utiliserons une fiche de score adaptée et nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale.

Devenir

Dans l’ensemble des procédures, les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. En effet, nous procéderons à une euthanasie par dislocation cervicale dans un premier temps car nous souhaitons effectuer des tests de prolifération et d’invasion in vitro ainsi que des coupes fines du tissu avec des marqueurs spécifiques afin de visualiser la tumeur ou les métastases possibles sur le foie et les poumons. Ces expérimentations sont toutes compatibles avec une euthanasie par dislocation cervicale. Dans un deuxième temps, nous souhaitons réaliser une description plus précise des phénomènes observés lors de notre étude, nous devons donc travailler sur des tissus dont la structure morphologique et l’organisation cellulaire sont parfaitement conservées. Pour cela, une perfusion intracardiaque sous anesthésiant est préconisée suivie d’une exsanguination induisant la mort de l’animal. La technique de perfusion intracardiaque est détaillée dans chacune des procédures. Pour les animaux ayant ateint un point limite, l'euthanasie se fera par dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons mis au point un essai in vitro de co-culture de cellules cancéreuses et de neurones qui permet de récapituler le mieux possible les interactions entre neurones et cellules cancéreuses. Nous avons observé que la croissance des fibres nerveuses déclenche une augmentation de l'invasion et de la prolifération des cellules cancéreuses. Même si nous avons exploité au maximum les données in vitro, nos co-cultures ne récapitulent pas la complexité́ de l’organe. En effet, une tumeur se développe par l’interaction des cellules cancéreuses avec leur environnement tumoral très complexe constitué de cellules immunitaires, de vaisseaux sanguins, de fibroblastes ect… La culture in vitro des cellules tumorales avec uniquement un seul constituant du microenvironnement tumoral (ici, les neurones) ne reproduit donc en aucun cas un développement tumoral physiologique d’où notre recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi afin d’obtenir une taille d’effet d’intérêt avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la taille moyenne des tumeurs 28 jours après implantation des cellules tumorales.

Raffinement

Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme ,4/cages, avec une alternation jour/nuit de 12h, eau et nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (maisonnette en carton, carrés de coton). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation suite à la livraison des souris sera de 5 jours, à la fin de laquelle les souris recevront les cellules tumorales. L’injection des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Le suivi sera effectué 3 fois par semaine et évalué via la grille de score associés à des critères de mal-être . Un score cumulé limite entrainera la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des fibres nerveuses dans le développement tumoral du cancer du sein. Dans cette optique, nous souhaitons utiliser le modèle d’implantation de cellules tumorales dans la glande mammaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Ce modèle est un outil puissant et couramment utilisé dans l’étude des cancers du sein. Les implantations de cellules tumorales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge auquel la glande mammaire est mature/formée. Dans les nos 2 procédures les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 3, 7, 14 et 28 jours après implantation des tumeurs. En effet, afin d’étudier le comportement des cellules tumorales co-cultivées avec les neurones, il est nécessaire de regarder à différents temps du développement tumoral. Ainsi nous pourrons mieux comprendre comment les cellules tumorales deviennent plus agressives lorsqu’elles sont en contact avec les neurones et déceler des mécanismes qui s’opèrent au début du développement.

16 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare avec atteinte rénale, reçoivent des injections de vecteurs lentiviraux, des prélèvements de sang et d'urine et une biopsie d'oreille, puis sont toutes tuées pour analyse des organes, pour une preuve de concept thérapeutique. Le porteur annonce un bénéfice "certain à long terme" pour les patients, formulé au conditionnel, face à ce nombre très élevé d'animaux mobilisés d'emblée. Il affirme le recours au modèle animal "inévitable" malgré des tests menés in vitro et une recherche bibliographique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie osseuse avec troubles renaux associés. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie notamment les problèmes rénaux associés.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice certains à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections de vecteurs lentiviraux (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes) et d'urine (30 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 3 prélèvements dans sa vie. Les prélèvements d'urine se font sur animal non anesthésié et un maximum de 6 prélèvements sera fait Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour savoir s'ils sont porteur de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente les signes cliniques caractéristiques de la maladie. En effet, ces animaux sont de plus petite taille et présentent un poids inférieur par rapport aux souris non malades de même âge. Cependant les chercheurs ayant générés ce modèle ne rapportent aucun problème pour ces animaux à se mouvoir ou à s’alimenter. Les souris ont également une altération de la fonction rénale et une ostéoporose associée à une destruction partielle des os des pattes chez la souris malade. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la production du traitement et l’optimisation se fait et continue à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés sur cellules. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle animal de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus. Ce nombre est basé sur nos expériences passées avec différents modèles animaux de maladies osseuses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et en effet, les auteurs du papier original démontrent bien que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.