Souris

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

1 100 rongeurs, soit 500 souris, 500 rats et 100 cochons d'Inde, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des expérimentateurs aux gestes d'administration de substances et de prélèvement sanguin, lors de séances de deux à trois heures répétées selon l'habileté de chaque stagiaire. Le porteur reconnaît que des gestes mal maîtrisés par des personnes novices peuvent produire une contention prolongée, du stress et des gestes plus douloureux. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer l'animal pour cette formation et qu'un même animal sert à apprendre plusieurs gestes avant d'être tué.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de former les expérimentateurs aux gestes techniques pour l’administration de composés et le prélèvement sanguin chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de former les nouveaux arrivants dans notre société et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie.

Procédures

Les animaux subiront des administrations d’eau de boisson pour les administrations per os et de liquide physiologique pour toutes les autres voies d’administration. Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur tous les animaux en fonction des gestes techniques à apprendre. La durée de cette formation donc des gestes techniques appliqués sur les animaux dépendra de l’habilité de chaque collaborateur. Il semble cohérent de prévoir des séances d’entraînement de 2 à 3 heures environ par jour où tous les gestes à apprendre peuvent être combinés.

Impact sur les animaux

Ce projet est réalisé pour valider ou former de nouveaux collaborateurs aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins. Ces personnes pouvant être novices, il est possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…). Cependant, dans un premier temps, les gestes à apprendre seront réalisés avec un formateur afin de limiter tout stress à l’animal.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Aucune méthode substitutive ne permet actuellement de remplacer l’animal pour réaliser la formation de la réalisation des gestes techniques d’administration ou de prélèvement sanguins en reproduisant toutes les réactions physiologiques de l’animal lors des contentions, des administrations, des prélèvements et lors des anesthésies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de réduire le stress de l’animal ainsi que la douleur. En effet, la personne sera formée par un autre collaborateur expert dans tous les gestes à apprendre afin de lui enseigner les bonnes techniques de contention, les bons gestes techniques afin de réduire au maximum le stress chez l’animal. De plus, le formateur adaptera la formation en fonction de chaque collaborateur (besoin de plus de temps si besoin pour apprendre la contention, le rapport à l’animal…). Sachant qu’un même animal pourra être utilisé pour apprendre différents gestes techniques, ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin de maintenir la température corporelle des animaux et d’éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études in vivo. Cependant nous utilisons également des cobayes et une formation à la contention et à la réalisation des gestes techniques peut être nécessaire selon chaque expérimentateur (trice). Nos projets d’études utilisant des animaux adultes, il sera préférable d’apprendre les gestes techniques sur des animaux adultes (de 6 à 8 semaines minimum).

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées d'une semaine à vingt-quatre mois, elles subissent des prélèvements de sang deux fois par mois et des injections intrapéritonéales, pour étudier le vieillissement des vaisseaux sanguins. Le porteur présente les manipulations lors des prises de sang et des injections comme les seuls effets indésirables. Les rubriques réduction et raffinement reprennent mot pour mot le texte de la rubrique remplacement, sans mesure propre à chacune, avant mise à mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons 1/ caractériser l’endothélium vasculaire vieillissant 2/ explorer le rôle de médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système d’hémostase (thrombose, coagulation et fibrinolyse). Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation du vieillissement vasculaire Dans cet axe, une étude pilote sera menée pour la mise au point des immunomarquages de sénescence et de caractérisation. Pour ce faire, un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites jeune (1 semaine à 1mois) et un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites âgées (12 ou 24 mois) seront utilisées (n=10).

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’apporter de la connaissance sur le vieillissement vasculaire ainsi que l’impact de la physiologie plaquettaire et de l’endothélium, inconnu à ce jour et peu réalisable sur les humains à la vue de la diversité du système vasculaire. En effet, il est irréalisable d’obtenir sur le même individu des biopsies endothéliales (veines, artères et capillaires), à cause des méthodes invasives et des conséquences délétères (hémorragies). Par ailleurs, le second axe permettra de déterminer un composé diminuant ou stoppant le vieillissement vasculaire. Ces travaux serviront à l’ensemble de la population en général et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets. éral et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animeaux vigiles, 2 fois par mois. La durée de la prise de sang est de maximum 2minutes Les injections en intraperitoneale durent maximum 1minute.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.

Devenir

Au cour de l'étude, les souris feront l'objet d'un suivi quotidien et de prise de sang bi mensuel. Al fin de l'etude, tous les animaux seront mis à mort afin de faire une etude des tissus murins.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 1 semaine à 24 mois. Les souriceaux a une semaine de vie presentent un arbre vasculaire incomplet au niveau des retines et permet d'avoir un temps de reference "jeune". Les vaisseaux sanguins cerebrales sont matures chez les souriceaux de 1 semaine. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (1 semaine à 1mois) et souris vieillissante de 3 à 24mois. Ces dernieres ont un stade de developpement complet.

2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.

Objectifs

Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.

Procédures

4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes

Impact sur les animaux

Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.

Devenir

Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.

Remplacement

Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.

Réduction

2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.

Raffinement

Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.

Choix des espèces

La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.

3 045 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une protéine contre l'anorexie liée aux chimiothérapies ou au stress. Selon les groupes, elles subissent une microcoupure hebdomadaire de la queue, jusqu'à six injections intraveineuses, une contention de deux heures par jour pendant deux fois quinze jours, un jeûne de 48 heures ou l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et qualifie le stress lié à la contention et au jeûne de transitoire. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. Cette protéine agit comme un stimulateur lipogénique et un stimulateur de l'appétit efficace chez la souris. De plus, il a été montré que son injection chez la souris entraine une inhibition du processus autophagique. Une étude bio-informatique à montrer l’existence de plusieurs isoformes exprimées de façon différentielle dans l’organisme de la souris. Cette protéine apparaît comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’anorexie du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la présence de cette protéine (en fonction de son mode d’administration) peut empêcher : (i) l’anorexie (perte ou la forte diminution de l'appétit) associée aux traitements avec des agents chimiothérapeutiques ; (ii) ou l’anorexie associée à un stress psychologique/physique important.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l’anorexie induite par les chimiothérapies ou par un stress mental trop important dans l'espèce humaine. Ceci pourrait avoir des retombées thérapeutiques dans ces cas par la suite.

Procédures

Sur tous les animaux, une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue sur animal vigile au début de l’expérience sera réalisée pour analyse sur le sang (durée: quelques secondes), puis une fois par semaine pendant 46 jours. Pour certains animaux, au maximum 6 injections i.v. par souris (20 secondes) ou une injection intravasculaire hydrodynamique par souris (6-8 secondes). Pour d'autres animaux : 1 contention de 2h par jour pendant deux fois 15 jours dans un cylindre acrylique permettant la respiration. Pour d'autres animaux: Une période de jeûne de 48h et 1 injection intranpéritonéale (20 secondes). Pour une des procédures, les souris subiront une chirurgie légère par implantation de pompe osmotique sous anesthésie générale avec analgésie (durée 15 minutes).

Impact sur les animaux

L’ effet indésirable principal prévu pour les animaux est la perte de poids. Les animaux seront transitoirement stressés lors des périodes de contentions de 2 heures ou les périodes de jeûne.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour la perte ou la récupération de poids.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie et analgésie des animaux pour toutes les procédures expérimentales (locale ou générale selon les cas), utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Du fait du but des recherches prévues, les animaux seront au stade adulte, étant des bons modèles pour les maladies à étudier. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie de quinze minutes pour implanter des cellules cancéreuses dans le foie, puis un suivi de dix semaines pendant lequel se développe une atteinte cardiaque, avant euthanasie. Le porteur indique une douleur post-opératoire et un possible œdème abdominal lié à la maladie cardiaque induite. Il juge le recours à un "organisme entier" vivant "indispensable" pour étudier l'effet d'une tumeur du foie sur les valves du cœur, et met à mort toutes les souris pour analyser leur cœur.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous nous intéresserons aux tumeurs neuroendocrines du foie qui constituent une famille de cancers caractérisée par la production d’hormones dont la sérotonine. L'exposition des valves du cœur à la sérotonine est à l'origine d'une maladie cardiaque dite cardiopathie carcinoïde. Il s'agit d'une maladie rare associée à une mortalité élevée chez l'Homme. La sérotonine produite par la tumeur va entrainer des modifications majeures de la structure des valves du cœur. A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux efficace pour traiter cette maladie cardiaque. Les connaissances sur la maladie demeurent limitées. L’objectif de ce projet est de créer un modèle de souris reproduisant la maladie telle qu’elle se manifeste chez l’Homme. Ainsi, nous souhaiterions obtenir un modèle de tumeur du foie produisant de la sérotonine et entrainant des changements de la structure des valves cardiaques chez la souris. Un tel modèle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de la maladie

Bénéfices attendus

La création d’un tel modèle reproduisant précisément la cardiopathie carcinoïde telle qu'elle se manifeste chez l'Homme, permettra d’évaluer l’effet de l’administration de divers traitement médicamenteux chez la souris avant de les introduire chez l’Homme. Il n'existe en effet à ce jour aucun traitement médicamenteux de la maladie. Un tel modèle permettra par ailleurs une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie.

Procédures

Les souris subiront une unique intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes au niveau du foie pour implanter des cellules cancéreuses sous anesthésie générale. Après un suivi de 10 semaines, les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’atteinte cardiaque apparue dans l’intervalle.

Impact sur les animaux

Stress lié à l'intervention chirurgicale, au déplacement des cages vers la salle d'intervention. Douleur post-opératoire. L'apparition d'une atteinte cardiaque carcinoïde pourrait s'accompagner d'oedèmes. Il s'agit d'une accumulation d'eau au niveau de l'abdomen de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin de prévenir la souffrance liée à la propagation du cancer, et de pouvoir analyser le coeur des souris. Cette analyse permettra de chercher des signes en faveur de l'apparition de la maladie cardiaque carcinoïde.

Remplacement

L'utilisation d'un animal pour ce projet est indispensable car il est nécessaire de recourir à un organisme entier vivant. En effet, nous souhaitons étudier l’effet sur les valves du cœur d’une tumeur du foie. Le recours à un organisme vivant entier est indispensable pour pouvoir étudier un tel effet. Nous étudions parallèlement des échantillons de valves obtenues chez des patients malades ayant une cardiopathie carcinoïde, opérés. Cette approche permet seulement d'observer les anomalies de la valve mais ne permet pas d'évaluer l'efficacité de traitements médicamenteux.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique

Raffinement

Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'intervention. Les animaux seront observés quotidiennement. En plus du suivi quotidien visuel, un suivi clinique sera mis en place. Ainsi une grille de suivi sera utilisée mentionnant précisément les points limites à surveiller. Les points limites seront donc évalués à l'aide d'une grille de score au moins une fois par semaine. Les animaux sont hébergés sans isolement, avec enrichissement dans chaque cage. La douleur post-opératoire sera systématiquement prise en charge par l'administration d'un traitement antalgique au début de l'intervention. En cas de d'apparition de signe de douleur lors du suivi, un traitement antalgique sera immédiatement administré. Une surveillance quotidienne des points de suture sera réalisée. En cas d'atteinte des points limites, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Nous disposons de lignées de cellules cancéreuses de souris et les protocoles pour modifier ces cellules sont simples et reproductibles. Pour toutes ces raisons, la souris est le modèle expérimental le plus adapté. Les rares études épidémiologiques chez l'Homme indiquent une prévalence accrue des atteintes cardiaques chez l'adulte jeune. Les enfants et les sujets âgés sont moins atteints par la maladie. Nous utiliserons par conséquent des souris âgées de 8 à 12 semaines en début de procédure pour se rapprocher au maximum de la condition de la maladie chez l’Homme.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour une formation à l'imagerie du petit animal. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis sert de support aux ateliers d'imagerie par TEP scan, tomodensitométrie, IRM, échographie et imagerie optique que manipulent les participants. Le porteur affirme que les techniques d'imagerie ne causent aucune souffrance et présente la greffe de tumeur comme le seul acte affectant la santé des animaux. Les 50 souris sont mises à mort à l'issue des ateliers.

Objectifs

Dans le domaine de l'exploration non-invasive, de nombreuses modalités d'imagerie ont vu le jour afin de se rapprocher au mieux de ce qui est fait et utilisé chez l'Homme. C'est dans ce contexte, qu'une formation à l'imagerie du petit animal a été créée en 2009. Depuis 6 éditions, elle accueille des participants de tous horizons et permet de s'approprier les modalités d'imagerie de façon théorique (cours) et en conditions réelles d'utilisation par l'intermédiaire de TP/ateliers. Dans le cadre de la session 2022 de l’école et plus particulièrement dans le cadre des 4 ateliers proposés aux participants de l'école par notre unité, 6 modalités d'imagerie seront présentées. Les ateliers proposés aux participants sont : 1/ Imagerie nucléaire (Tomographie par émission de positons (TEP)-FDG et Tomodensitométrie (TDM)); 2/ IRM; 3/ Echographie et 4/ Imagerie optique (bioluminescence et fluorescence). Pour l'ensemble de ces ateliers, nous utiliserons 50 souris SCID beige femelles de 8 à 10 semaines. 10 souris pour la procédure d’imagerie multimodale (TEP/CT, IRM, Echographie, Imagerie optique) réalisée quelques jours avant l’école d’imagerie. 40 souris pour les ateliers de l’école réalisés en présence des participants : - Tomodensitométrie (10 souris) - IRM (10 souris) - Echographie (10 souris) - Imagerie optique (bioluminescence et fluorescence) (10 souris)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ces ateliers sont multiples, il s'agit tout d'abord de présenter les modalités, toutes disponibles dans notre structure, mais surtout de discuter de leurs spécificités respectives, avantages, inconvénients, coût financier, conditions de mise en œuvre et de démontrer l'intérêt de la multimodalité pour combiner les avantages et spécificités de chacune. Nous nous attacherons également à mettre en lumière les développements mis en œuvre par notre unité pour permettre le maintien du statut sanitaire des animaux par l'utilisation de cellule de confinement pour l'imagerie nucléaire et l'IRM ce qui permet d'ouvrir notre service à des animaux provenant de différentes zootechnies de statut sanitaire SPF tout en permettant que les animaux imagés puissent réintégrer ces zootechnies et poursuivre leur exploration selon d'autres procédures expérimentales alors qu'en règle générale, sans confinement, l'imagerie reste souvent terminale (les lots d'imagerie suivis par imagerie sont dédiés à l'imagerie puisqu'ils perdent leur statut sanitaire en quittant leur zone d'hébergement initiale).

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par voie sous cutanée (l'induction des tumeurs sera réalisée en moins de 7 minutes, induction de l'anesthésie comprise). Ces tumeurs étant parfaitement accessibles, nous serons vigilants à intervenir au moindre signe de douleur ou si la taille de la tumeur devait impliquer le sacrifice des animaux. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie non invasive n'entrainant aucune douleur pour les animaux. Nous leur éviterons tout stress en les anesthésiant dès le début des sessions d'expérimentation. Durée des anesthésies selon la procédure d’imagerie en question (il y en a 5 au total) : TEP FDG : durée d'anesthésie 45 minutes maximum, TDM : durée d’anesthésie 20 minutes maximum, IRM : durée d'anesthésie 90minutes maximum, échographie : durée d'anesthésie 40 minutes maximum, Bioluminescence / fluorescence : durée d'anesthésie 60 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux. L’induction de tumeurs aux animaux affecte en revanche la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que cela n'entraine aucune douleur, aucune limitation de leur mobilité. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement sacrifiés. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que la taille des tumeurs n’atteigne pas 10% du poids des animaux.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection sous cutanée de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en oeuvre.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale ainsi que le nombre d’animaux. Ceci sera répété à plusieurs reprises aux participants pendant les cours et pendant les ateliers.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour avoir au moins 2 à 3 souris par session d’ateliers afin de permettre aux participants qui le souhaitent de manipuler les souris en limitant leur stress (nous éviterons la manipulation multiple d’un même animal sur 2 heures d’atelier). Les souris qui n’auraient pas développé de tumeur après induction (procédure expérimentale n°1) pourront néanmoins être utilisées dans le cadre des ateliers ce qui évite de prévoir des animaux supplémentaires. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de volume supérieur ou égal à 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les animaux sont anesthésiés pour chaque procédure et une attention particulière est apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie. Le recours aux animaux dans le processus de formation est essentiel. L'objectif de la formation est en particulier d'informer les participants quant aux différentes modalités d'imagerie disponibles (dans notre structure et/ou ailleurs) et pouvant remplacer des procédures expérimentales nécessitant la mise en œuvre de nombre plus importants d'animaux (biopsies, biodistribution ex vivo etc.). Il est indispensable de mettre en images au cours des ateliers les potentialités de ces différentes techniques au travers d’exemples concrets et en permettant aux participants de faire eux-mêmes ces observations après avoir reçu des informations théoriques lors des sessions de formations précédents les ateliers. De plus, les modalités d’imagerie présentées par notre structure dans le cadre de l'école sont non invasives et n’entrainent pas de souffrance physique importante.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans les pathologies comme le cancer. C'est également un animal facile à manipuler et adapté aux modalités d'imagerie présentes dans notre structure. C’est dans ce contexte que seront utilisées des SCID Beige femelles de 8 à 10 semaines. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8 à 11 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ce stade est également optimal pour le développement de tumeurs (l'induction tumorale sera effectuée à 8 semaines).