Souris

Une pompe glissée sous la peau sous anesthésie générale, sept jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, puis des tests de mémoire : 636 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer deux modes d'administration de la FENM, un dérivé de la mémantine. Certaines appartiennent à une lignée transgénique qui développe des lésions de type Alzheimer, d'autres reçoivent un peptide amyloïde pour en provoquer une forme aiguë, une injection absente de la description des procédures. Le porteur évoque des labyrinthes sans les nommer et un test d'évitement passif qui impose des "stimulus désagréables", et ne laisse dans les cages que des copeaux de carton, parce qu'un enrichissement trop important "interagit avec l'étude de la mémoire". Après les tests, toutes sont tuées par une dose létale d'Exagon et leur cerveau est prélevé.

Objectifs

Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. C’est le cas de la mémantine, un antagoniste non-compétitif du récepteur au NMDA malheureusement aujourd'hui déremboursé en France, comme tous les médicaments disponibles contre la MA. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules similaires(antagonistes du RNMDA) mais plus actives et sans effets secondaires. La piste suivie par le laboratoire s'articule autour des dérivés directs de la Mémantine et notamment la Fluoroéthylnormémantine (FENM) qui s'est avéré être un neuroprotecteur plus efficace à dose égale que la Mémantine. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques d'un traitement au long cours, notamment selon la voie d'administration et le mode d'injection. Dans la MA en effet, certains médicaments existent selon deux modes d'administrations, comme la rivastigmine (Exelon® gélule ou solution buvable vs Exelon® dispositif transdermique), mais ce n'est pas le cas de la Mémantine (Ebixa® comprimé ou solution buvable). Ce projet a donc pour but de comparer deux modes d'administrations de la FENM, par injection direct (Bolus) ou diffusion passive (Pompe). Pour cela, trois types de modèles seront étudiés dans ce projet, un modèle contrôle non pathologique afin de confirmer que les modes d'injections n'impactent pas la santé de l'animal, un modèle aigu de la maladie d'Alzheimer et un modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer

Bénéfices attendus

Les données préliminaires obtenue au laboratoire suggèrent en effet que la FENM serait un neuroprotecteur puissant, validé pour l’instant dans un modèle pharmacologique aigue de la MA chez la souris. La molécule présenterait une efficacité supérieure à celle de sa molécule parente, la mémantine notamment sur les aspects anti-inflammatoires et une absence d’effet amnésiant direct aux doses élevées. Le but de ce projet est de consolider ces résultats dans un modèle transgénique murin de la MA, un modèle qui se rapproche des caractéristiques histopathologiques et cliniques de la MA avec une évolution progressive de la pathologie, dans le but in fine de passr à un développement clinique de la FENM.

Procédures

Les animaux auront une procédure chirurgicale permettant la pose de Pompe Alzet sous cutanée qui permet de faire diffuser le médicament dans le système sanguin. Cette procédure rapide (15 min) se fera sous anesthésie générale. Les animaux auront également des injections intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours afin d'administer le médicament sous forme de "bollus". Afin d'évaluer le statut mnésique des animaux, des tests comportementaux type "labyrinthe" seront effectués.

Impact sur les animaux

Les animaux auront une chirurgie permettant l'innoculation par diffusionn de la FENM à l'aide d'une pompe Alzet. Les animaux auront également une injection intra-péritonéale durant 7 jours. Certains tests comportementaux comme le tetst d'évitement passif engendreront des stimulus désagréables pour l'animal.

Devenir

Après la serie de tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés et le materiel biologique (cerveau) sera récuperé pour procéder à des analyses port-mortem.

Remplacement

Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement minimal du milieu, car un enrichissement trop important interagit avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront donc seulement accès à des copeaux de cartons afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée. Pour éviter toute souffrance aux animaux, après analyses des tâches comportementales, ils recevront une dose léthale d’Exagon au moment du sacrifice. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci sera isolé du reste du groupe ou présentera des lésions cutanées signe d’un stress. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Les composés seront testés dans une large gamme de dose de 0,03 à 1 mg/kg/jour. Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie et 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris.

Privées d'une partie de leur système immunitaire pour ne pas rejeter la greffe, 135 souris nude femelles reçoivent dans le cerveau des cellules de glioblastome humain, une tumeur cérébrale agressive. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après six mois de suivi au plus, ou dès qu'un point limite est atteint, pour prélever leur cerveau. Lors de la greffe, sous anesthésie générale, une partie de leur crâne est remplacée par une lamelle de verre de 5 mm, puis elles passent en imagerie sous anesthésie une à deux fois par semaine, seules en cage pour éviter qu'elles rongent la fenêtre. Les nanoparticules et la radiothérapie testées sont appliquées aux cellules. Le porteur écrit pourtant que cette procédure "ne menace pas leur intégrité physique".

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nanoparticules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique de deux nanoparticules innovante (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine. L’objectif du projet étant d'optimiser les modalités de traitement dans le traitement de tumeurs cérébrales. Nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

-Procédure 1: Sous anesthésie générale, greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne (un lame de verre de 5 mm de diametre vient remplacer une partie du crane) : réalisée une fois au début de l'étude (durée de 30 min) - Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale sous anesthésie générale par des techniques d’imageries : réalisée 1 à 2 fois par semaine (durée 10 min) sur maximum 6 mois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire, de plus nous utilisons des analgésiques pour limiter la souffrance des animaux et le traitement NPs + la radiothérapie n’est pas réalisée sur la souris mais effectuée sur cellules. Nous mettons en place des soins post-opératoire rigoureux. L’hébergement en cage individuelle après la chirurgie et durant tout le suivi par microscopie pour éviter que les animaux ne rongent la fenêtre crânienne ; ceci pouvant conduire à un stress des animaux par limitation des interactions sociales directes pour limiter cet effet indésirable nous accolerons les cages transparentes les unes aux autres ce qui permettra une communication visuelle entre les animaux. Suivi par imagerie classée légère : utilisation d'analgésiques pour limiter le stress de l’animal qui doit être maintenu immobile pour ne pas altérer la qualité des images.

Devenir

Procédure 1: Greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne : animaux gardé en vie. En effet, cette procédure ne menace pas leur intégrité physique et constitue le point de départ de notre étude. Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale par imagerie : animaux mis a mort à la fin de la période maximal de suivi soit 6 mois ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélévé pour analyse macroscopique et histologique (mise en évidence des cellules tumorales en surface ou en profondeur).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque l’implantation de tumeurs cérébrales, la croissance ou la régression tumorale post-traitement dépend de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Les différents travaux déjà mener in vitro (sur cellules) et le désire d’évoluer vers la clinique implique une étude préclinique in vivo (sur un modèle animal) du protocole, ainsi que de disposer de tumeurs intracérébrales issues de cellules tumorales humaines pour se rapprocher au mieux de l’histologie tumorale retrouvée en clinique.

Réduction

L’utilisation du modèle de fenêtre intracrânienne permet le suivi sur plusieurs semaines sur un même animal de l’efficacité du traitement permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance, la migration et la régression tumorale. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d’une part lors de la procédure chirurgicale (analgésie avec réitération, opération sur tapis chauffant pour le maintien de la température corporelle, protection de la déshydratation oculaire par du gel ophtalmique, injection d’anti-inflammatoire pour éviter l’œdème cérébral, surveillance au réveil (vérification de l’alimentation et de l’hydratation)) ; Et d’autre part les jours suivant la chirurgie et jusqu’au sacrifice de l’animal (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier absorbant et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris nude (dépourvue d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 7 à 9 semaines au moment de la chirurgie sont utilisées, à un stade où leur poids est suffisant compatible avec l'intervention

Toute souris qui perd 20 % de son poids initial est mise à mort, et le médicament testé "peut également provoquer une perte de poids importante", indique le porteur. 1 280 souris sevrées vers quatre semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer, entre autres, la fonte de leur masse grasse. Nourries d'un régime riche en graisses ou en sucres, ou issues de lignées prédisposées à l'obésité ou au diabète, elles reçoivent des injections dans le ventre, sous une contention répétée trois fois par semaine que le porteur dit source d'un "stress modéré", et une prise de sang tous les trois mois. Le but est de vérifier qu'un médicament qui fait disparaître une "protéine d'intérêt" freine la prise de poids, sans que le porteur nomme la protéine ni le médicament.

Objectifs

En 2020, 8,5 millions de personnes souffrent d’obésité, dont 1 million de personnes en obésité massive soit 17% de la population nationale. De plus, l’obésité, chez les plus jeunes, montre des chiffres inquiétants, puisque l’on observe la plus forte progression des cas d’obésité chez les 18-24 ans. En effet, cette tranche d’âge est passée de 5,4% en 2012 à 9,2% en 2020. Chez les enfants, les observations sont elles aussi alarmantes puisque 34% des enfants de 2-7 ans et 21% des adolescents de 8-17 ans sont en situation de surpoids ou d’obésité. La situation actuelle est inquiétante pour l’avenir car cette augmentation de l’obésité chez les plus jeunes va conduire à une augmentation des pathologies liées à l’obésité telles que les maladies cardio-vasculaires, le diabète et les cancers. L’obésité reste aujourd’hui un problème de santé public important. La finalité du projet et son bien-fondé visent à comprendre le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt dans l’obésité et ses pathologies associées, afin de proposer une nouvelle thérapie pour leur prise en charge. Ce projet repose sur des observations que le laboratoire a obtenu sur cellules ainsi que sur des publications internationales. L’essence même de la question posée implique l’utilisation d’un organisme vivant tel que la souris, afin d’illustrer au plus proche de l’homme sa compléxité métabolique, sans solutions alternatives satisfaisantes.

Bénéfices attendus

Ce projet, à court terme, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents au développement de l’obésité et des syndromes métaboliques associés. En étudiant, plus particulièrement le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt tout au long de la prise de poids. L’utilisation de souris non modifiées génétiquement mâles et femelles, permettra de modéliser au plus proche de l’humain le métabolisme lors d’un régime riche en lipides ou en sucres. Ces souris seront traitées avec un médicament permettant la disparition de cette protéine. Ceci nous permettra de voir si l’élimination de cette protéine induit une diminution de la prise de poids de nos souris et in fine de prévenir/traiter l’obésité et ses syndrômes métaboliques associés chez le rongeur. De plus, les souris prédisposées génétiquement à une prise de poids accélérée (obésité) ou à un développement de diabète de type 2 permettront de valider l’impact de la dégradation de notre protéine d’intérêt sur un syndrome métabolique établi génétiquement. A la fin du projet, l’objectif est de transférer une nouvelle thérapie vers la clinique afin de mieux répondre aux problématiques de santé publique que constituent que l’obésité et les pathologies associées comme le diabète de type 2.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune procédure chirurgicale au cours de notre projet. On sera toutefois ammené à effectuer un prélévement sanguin tous les 3 mois afin de tester leur glycémie (80uL total de sang prélevé, 1min par souris contention comprise). Les animaux seront soumis à des injections de médicaments dans le bas du ventre (5secondes par souris, contention comprise). Pour pouvoir effectuer ces injections les animaux seront contentionnés de façon adéquat par le personnel.

Impact sur les animaux

Lors du traitement des animaux par un personnel qualifié, l’injection intra-péritonéale à répétition peut entrainer l’apparition occasionnelle d’hématomes sous-cutanés. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal. Lors de ces injections, il y aura une contention de l’animal (trois fois par semaine) ce qui peut conduire à un stress modéré pour les animaux. La drogue injectée peut également provoquer une perte de poids importante chez les animaux qu’il faudra surveiller attentivement grâce à des pesées tri-hebdomadaires.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Cela afin d’étudier au niveau moléculaire et anatomiques (diminution de la masse graisseuse, etc ) les effets de notre traitement.

Remplacement

Dans le laboratoire, nous avons déjà réalisé in vitro, sur des cellules pré-adipocytaire, les expériences permettant de montrer la nécessité de notre protéine d’intérêt dans la différenciation adipocytaire et son impact sur le métabolisme. Cependant les cellules pré-adipocytaires ne permettent pas d’appréhender la complexité métabolique d’un organisme entier, c’est pourquoi, il est important de réaliser ces procédures expérimentales sur l’animal. Notre objectif in fine, étant de présenter en clinique une nouvelle thérapie contre l’obésité et ses pathologies associées tel que le diabète, l’utilisation des animaux et notamment les souris est indispensable au déroulement de notre projet.

Réduction

Nos resultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales sur animal vivant. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en prenant en compte les tests statistiques. Sur cette base, nous avons estimé à 1280 animaux, le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble de notre projet

Raffinement

L’hébergement se fera à raison de 5 animaux par cage, sur un fonds de litière et enrichissement en briques de peuplier ou carrés de cellulose pour favoriser la confection de nids. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les membres du personnel et à heures fixes afin de limiter le stress. Ils seront pesés trois fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Une perte de masse corporelle constituera un indicateur de toxicité et sera considérée comme un point limite conduisant à l’euthanasie de l’animal lorsqu’elle sera égale ou supérieure à 20% du poids initial. Les injections IP seront réalisées par du personnel formé en préviliégiant le coté droit de l’animal . Une attention particulière sera portée aux points suivants afin de limiter la souffrance et la détresse des animaux : - Une absence d’hydratation ou de prise de nourriture afin d’anticiper une perte de poids excédant 20 % du poids initial - Une gêne dans la locomotion - D’autres signes de douleur tels que l’isolement des autres animaux, les yeux fermés ou creux, le dos voûté - Un saignement ou autre perte de liquide physiologique - Un changement du rythme respiratoire - Tout autre comportement anormal de l’animal tel que la prostration ou la vocalise lors de la préhension

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un système génétique et métabolique proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquements modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci sur un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 4 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeunes souris afin de suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabéte) mais aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des symdromes métaboliques associées à l’obésité.

Huit heures par jour pendant seize semaines, 160 souris sont placées en hypoxie intermittente, une privation d'oxygène répétée censée reproduire l'apnée du sommeil. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois séries d'injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline ou de dexaméthasone, des gouttes de sang prélevées à la queue et trois ECG et échographies cardiaques sous anesthésie générale. Le porteur décrit des effets "sans conséquence majeure", une ventilation et un hématocrite en hausse, alors que le projet doit établir si ce stress hypoxique dérègle le système sympathique et le métabolisme du foie. Toutes sont tuées au bout des seize semaines pour prélever leurs organes, que d'autres chercheurs du laboratoire pourront se partager.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -L’hypoxie intermittente (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système sympathique ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ?

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans la pathologie de l'AOS commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'HI avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au SAOS.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagon devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose à 10% (2mg/kg). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augementer légèrement la fréquence cardiaque.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système sympathique .

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal graçe a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice teminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

1890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de dystrophies musculaires, elles reçoivent des injections répétées et des gavages plusieurs fois par semaine, ainsi que des vecteurs de thérapie génique, avant une évaluation de la force musculaire sous anesthésie terminale. Le porteur soutient que les traitements, "tous de nature bénéfique", ne justifient pas de points limites, tout en décrivant des modèles sévères au phénotype avancé. Il affirme que l'effet ne peut être obtenu que dans un organisme "entier" et qualifie ces expériences d'"absolument indispensables".

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches de thérapie génique médiées par des vecteurs viraux pour les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Ces maladies sont caractérisées par des cycles de dégénérescence/régénération du muscle entrainant une perte des fibres musculaires au profit de tissu fibrotique ou adipeux. Ce processus dégénératif provient de défauts génétiques et conduit à des conséquences délétères sur la fonction motrice, la qualité et la durée de vie des patients. Il peut impacter les capacités de réversion du phénotype myopathologique. En raison de la progressivité du processus dégénératif, le diagnostic et le traitement se réalisent alors que la dégénération est engagée déjà depuis des années chez les patients. Il semble que ceci soit à l’origine de la faible efficacité des approches de thérapie génique observée dans les essais cliniques dans les dystrophies musculaires où la restauration fonctionnelle dépasse rarement 15%. De plus, les essais cliniques soulignent la possibilité d’apparition d’effets adverses liés aux doses utilisées. Il apparait donc nécessaire d’adjoindre au transfert de gène des traitements agissant sur le mécanisme physiopathologique dystrophique afin d’obtenir un effet thérapeutique probant et une meilleure sécurité. Le but est d’évaluer l’effet de traitements thérapeutiques agissant sur les différentes composantes du processus dystrophique en combinaison avec un produit de thérapie génique pour évaluer leur synergie sur les modèles murins des pathologies incluses dans le projet à un stade précoce et avancé de la maladie. Les résultats obtenus devraient permettre une meilleure efficacité de la thérapie génique et une réduction des possibilités de toxicité par une diminution des doses à administrer chez les patients. Les animaux utilisés sont des souris modèles et leurs contrôles normaux. Le nombre nécessaire est de 1890 animaux. Les traitements associés peuvent être de petites molécules qui seront administrées soit par gavage, soit par administration intrapéritonéale, sur une durée variable. Ils peuvent également être réalisés par transfert de gène. Dans ce cas, ils seront co-administrés avec le traitement de thérapie génique. Un suivi de biomarqueurs sériques permettra de suivre l’effet au cours du temps. L’évaluation de l’effet thérapeutique sera réalisée par des études de la fonction du muscle, et après sacrifice par des études moléculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de combinaisons associant soit une petite molécule, soit une modulation génique, à un traitement de thérapie génique d’intérêt pour un groupe de maladie humaine sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour. La combinaison de traitement permettra d’augmenter la correction chez les patients et d’améliorer la sécurité de produits de thérapie génique par la réduction des doses requises.

Procédures

Toutes les molécules pharmacologiques seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Elles seront administrées soit par voie orale, soit par injection intra péritonéale (durée injection moins de 1 minute), sur animaux vigiles. L’administration par voie orale se fait par gavage à l’aide d’une canule souple en plastique à bout arrondi afin de ne pas blesser l’animal (durée : entre 30 secondes et 1 minute). Les traitements adjoints administrés par AAV et le traitement de thérapie génique se font par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux vigile avec injection dans la veine caudale (durée : moins de 1 minute en injection rapide et entre 3 à 10 minutes pour les injections lentes), soit sur animaux anesthésiés au sinus (durée : moins de 1 minute). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée. (Durée de l’intervention : moins de 10 minutes entre l’anesthésie et le réveil de l’animal. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont soumis à une évaluation fonctionnelle sur muscle semi-isolé sur animaux analgésiés et anesthésiés. L’analgésique est injecté 30 minutes avant l’anesthésie qui est une anesthésie par voie intra-péritonéale profonde sans réveil de l’animal. L’évaluation fonctionnelle dure en moyenne 30-45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûres intrapéritonéales d’un volume maximum de 100µl pour l’administration de molécules (5 fois par semaine sur animaux vigiles) ou d’anesthésique une seule fois en fin de protocole. Pour réduire les nuisances, les animaux seront traités 30 minutes avant la procédure avec un analgésique. - Gavage pour administration de molécules (maximum 200µl, 5 fois par semaine) - Intraveineuse caudale ou au sinus pour injection AAV (soit en bolus de 100µl/20g, soit en IV lente 500µl/20g, une fois au cours du protocole) * Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance). En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils sont porteurs d’une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères (SGCA et SGCG) au stade avancé de la pathologie. Cependant, même dans ce cas, les nuisances possibles n’ont pas d’impact sur la survie et ne sont pas de nature à nécessiter la mise en place de points limites. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Afin de valider l’effet thérapeutique in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. De plus, afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro et justifie notre recours à des animaux.

Réduction

Un effort de réduction a été réalisé en amont de ce projet. En effet, les molécules pharmacologiques utilisées dans ce projet ont toutes déjà démontré leur efficacité sur la souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne. Nous savons donc qu’elles ont un effet bénéfique, reste à savoir maintenant si, combinées à la thérapie génique, elles pourront augmenter la correction et permettre une réduction des doses de vecteurs. La dose administrée a déjà été validée chez la souris. Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 1890 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes. Tous les modèles sont sur le même fond génétique., nous pouvons donc utiliser les mêmes souris contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les différentes conditions seront testées en premier lieu sur les modèles les plus sévères. Pour les conditions ne montrant pas d’effet positif, les traitements ne seront pas testés sur les modèles les moins sévères, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet inclus la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Le souci de raffinement est une préoccupation permanente tout au long de la vie des animaux et pendant les différentes étapes des protocoles expérimentaux. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris reçoivent un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux sont sacrifiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures de sacrifice appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet sont des souris modèles de la pathologie étudiée. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage jusqu’à un stade tardif de la pathologie (variable selon les modèles mais entre 6 mois et 1 an) afin de refléter au mieux la maladie humaine puisqu’il s’agit de pathologies progressives. Les signes cliniques peuvent apparaitre dès l’enfance, mais également à l’âge adulte pour certaines dystrophies. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer la fonction musculaire et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères. Des animaux plus âgés (entre 6 mois et 12 mois) seront également utilisés, afin d’évaluer l’effet thérapeutique sur des animaux où le phénotype dystrophique est installé, ce qui permettra d’évaluer la réversion du phénotype au stade tardif. En effet, il est indispensable de savoir si le traitement est efficace lorsque la maladie est installée afin de pouvoir proposer un traitement à des patients qui sont à un stade avancé de la maladie.

20 souris Hairless vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie de 6 mm est pratiquée sur chaque flanc puis traitée avec deux formulations en gel tous les deux jours jusqu'à cicatrisation, les animaux étant maintenus isolés en cage individuelle. Le porteur reconnaît une douleur possible durant les 24 heures suivant l'induction des plaies et un stress lié à la privation d'interactions sociales. Il affirme que ni culture cellulaire ni explant cutané ne reproduisent la complexité de la cicatrisation, qui ne peut être appréhendée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 formulations sous forme de gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris Hairless Skh-1.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel des ces formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur les flancs gauche et droit de chacune des 20 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie gazeuse et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.

Impact sur les animaux

L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des 24 heures suivant celle-ci. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci. Pour ces raisons, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront mises à mort. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre connaissance du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, angiogénèse, réépithélialisation…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par le Département Statistiques de notre client qui développe un nouveau programme informatique dans lequel sont compilées les données d’études in vitro et in vivo réalisées sur plusieurs années avec des composés de nature proche. Ce programme informatique modélise ainsi la transposition des résultats d’études in vitro aux études in vivo dans le but premier de réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation, l’objectif final étant de développer une alternative à l’expérimentation animale. Selon le test de puissance statistique effectué, en prenant en compte les mêmes conditions expérimentales, il est ainsi nécessaire d’utiliser au moins 3,6 animaux avec 2 plaies cutanées par animal donc 4 animaux (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des morceaux de papier absorbants seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau proche de celle de l’Homme permettant une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.