Souris

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs rénales, elles reçoivent un traitement par gavage quotidien et sont suivies par échographie puis IRM sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur annonce des bénéfices en termes de compréhension des mécanismes du cancer et de pistes thérapeutiques, formulés au conditionnel. Il affirme que les expériences in vitro ou in silico ne conviennent pas car "trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu" et que la souris est le seul mammifère où les gènes visés ont été mutés.

Objectifs

Les cancers du rein représentent environ 2% des tumeurs malignes chez l’être humain. Au cours des dernières décennies, l’incidence de ce cancer a progressivement augmenté. Le cancer du rein touche davantage les hommes que les femmes, il est diagnostiqué principalement entre 60 et 70 ans mais peut survenir à tout âge. Les facteurs de risque principaux sont le tabagisme et l’obésité. Le potentiel métastatique de ces cancers est important. La survie médiane à ce stade n’est que de treize mois, le défi thérapeutique est donc immense. Au cours des dix dernières années, il a été clairement établi que ces cancers sont associés à des anomalies génétiques spécifiques tant dans les formes sporadiques que dans les formes héréditaires. Actuellement, il n'existe pas modèle préclinique pour analyser correctement le developpement d'un cancer du rein. Un modèle préclinique efficace permettrait de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant au développement de cellules cancéreuses. Identification potentielle de nouveaux traitements. Identification potentielle de biomarqueurs.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume tumoral. Celui ci sera effectué́ par un technicien expérimenté́ et le plus petit volume possible sera administré aux souris. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché́, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Les tumeurs rénales seront surveillées en imagerie à intervalles réguliers (echographie une fois par mois puis une seule IRM en fin de procédure).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage. Nous serons particulièrement attentif aux fausses routes (point limite établi). La réalisation des suivis en imagerie se fera sous anesthesie générale. Nous serons particulièrement attentifs au stress induit par l'anesthésie (point limite établi).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur le cancer du rein, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points-limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul mammifère pour lequel les protéines PIK3CA, VHL et SDHA ont été mutéee. Souris âgées d'au moins 4 semaines car il est nécessaire que leur développement soit terminé.

550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de fixation d'une pièce métallique sur le crâne, une restriction hydrique et, pour une partie, une perfusion intracardiaque terminale, afin d'enregistrer l'activité de neurones pendant des tâches olfactives. Les souris sont maintenues assoiffées, la totalité de leur eau quotidienne servant de récompense pour les faire travailler dans le dispositif, où elles doivent aussi éviter des bouffées d'air ou d'eau salée. Le porteur affirme que la souris est le seul mammifère au système olfactif proche de l'humain et qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut répondre à ses questions.

Objectifs

Les odeurs ont une capacité unique à nous transporter dans des moments reculés de notre passé, notamment ceux associés à des émotions fortes. Elles jouent également un rôle très important dans les choix que nous faisons au jour le jour, notamment lorsqu’il s’agit de notre alimentation. Mais qu'est-ce qui, dans le système olfactif, confère aux odeurs ces propriétés particulières ? Dans cette étude, nous étudierons les voies anatomiques et les mécanismes physiologiques par lesquels les odeurs laissent une empreinte émotionnelle si forte dans nos mémoires.

Bénéfices attendus

Cette recherche peut fournir des indications importantes sur les mécanismes neuronaux qui attachent une valence hédonique à un objet. Dans de nombreux troubles neurodégénératifs, à mesure que la maladie progresse (en particulier dans le cas de la dégénérescence du lobe frontal), les patients souffrent car ils sont moins connectés au monde qui les entoure. La valeur qu'ils attribuent à différents éléments peut être déformée, ce qui peut entraîner des changements radicaux dans leur personnalité, inquiétants pour eux et leurs proches. Si cette recherche permet de découvrir l'ensemble des connexions qui attribuent une valeur émotionnelle aux odeurs, elle peut donner un aperçu de la physiopathologie de ces troubles. Outre les maladies neurodégénératives, des études récentes ont également montré que les enfants atteints de troubles du spectre autistique (TSA) n'adaptent pas leur comportement de reniflage lorsqu'on leur présente des substances odorantes aversives ou appétissantes, alors que les enfants au développement normal le font. Cela suggère une déconnexion entre l'intégration des informations sensorielles et les processus de mémoire émotionnelle dans les TSA, et ce travail pourrait permettre de comprendre comment les odeurs se voient attribuer une signification émotionnelle qui conduit à un comportement adaptatif.

Procédures

Dans cette étude, toutes les souris (550) subiront une intervention chirurgicale. Certaines souris (490) seront fixées à la tête et soumises à une restriction hydrique, et d'autres seront perfusées par voie intracardiaque à la fin de l'étude (460).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les souris seront placées dans un appareil comportemental dans lequel elles devront utiliser leur odorat pour trouver une récompense hydrique et éviter les petites bouffées d'air ou d'eau salée. Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir les souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. Pour les motiver à effectuer des tâches dans l'appareil, la totalité de l'apport en eau quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux.

Devenir

Sur les 490 souris soumises à une restriction hydrique, 90 seront mis à mort et 400 seront gardé en vie. Sur les 550 (y compris les 490 de la restriction hydrique) animaux qui subissent une intervention chirurgicale, 90 (le même 90 que la restriction hydrique) seront mis à mort et 460 seront gardés en vie. Ces 460 pourront être mises à mort et utilisé pour contrôles histologiques en fin d’expérimentation.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront une tâche comportementale : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 550 souris sur 5 ans. Les techniques d’enregistrement (électrodes très fines et lentilles à gradients d'indices) que nous prévoyons d’utiliser permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés car un grand volume de données pourra être collecté sur plusieurs jours au sein d’un même animal. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début de leur entraînement, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L'accoutumance à l'expérimentateur et aux conditions expérimentales permettra également aux animaux d'accomplir les tâches comportementales avec un minimum de stress.

Choix des espèces

Ce projet vise à comprendre les mécanismes neuronaux qui explique comment la valence hédonique d'une odeur affecte son encodage dans le cortex olfactif, et comment cette information est acheminée pour guider les comportements adaptatifs. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que la souris est en train d’apprendre et d'exprimer leur préférences olfactifs : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. La souris est la seule espèce de mammifère qui possède un système olfactif très similaire à celui des humains dans lequel nous pouvons entraîner les animaux à s'approcher et à éviter différentes odeurs tout en enregistrant et en manipulant l'activité dans des groupes de neurones génétiquement et anatomiquement circonscrits. La boîte à outils pour ces manipulations chez la souris est bien plus développée que pour tout autre organisme modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Par précaution par rapport à ce dernier point, nous utiliserons uniquement des animaux dont le poids est compris entre 20 et 45g.

468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris génétiquement modifiées deviennent progressivement aveugles, et reçoivent dans l'œil une injection de vecteurs viraux sous anesthésie, suivie de tests visuels répétés. Le porteur reconnaît que l'injection, geste délicat, peut provoquer des lésions irréversibles, tout en espérant restaurer en partie la vision pour tester une thérapie génique contre le syndrome de Bardet-Biedl. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut reproduire un organe aussi complexe chez un animal aussi jeune.

Objectifs

Le principal objectif de ce projet est de déterminer si, dans le cadre d'une maladie rare telle que le syndrome de Bardet Biedl (BBS), il est possible de développer un traitement basé sur de la thérapie génique pour ralentir l'atteinte de la rétine qui est observée chez les animaux modèles de cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous espérons restaurer au moins partiellement l'atteinte de la rétine qui est habituellement observé chez les 3 modèles murins Bbs étudiés. Le projet que nous proposons devrait servir à valider le schéma experimental proposé. Nous pourrons alors envisager de l'appliquer à d'autres modèles murins. Ce projet pourrait être considéré comme une étude préclinique pour la mise en oeuvre d'un traitement de la dégenerescence rétinienne des patients BBS par thérapie génique.

Procédures

L'injection dans l'oeil des souris se déroule sous anesthésie générale et dure au maximum 1 minute par animaux et sera réalisé une seule fois à 14 jours sur toutes les souris, tous génotypes confondus. Pour mise en évidence un potentiel effet bénefique de cette injection, nous comptons soumettre toutes les souris à 3 tests fonctionnels différents. L'ERG (Electrorétinogramme) permet d'enregistrer le signal électrique généré par les cellules de la rétine suite à un stimulation lumineuse. Il sera réalisé sur des animaux sous anesthésie générale et dure au maximum 20 minutes. L'OCT (tomographie en cohérence optique) est basé sur le principe de l'échographie et permet de visualiser et mesurer l'épaisseur des différentes couches de la rétine. Il est également réalisé sur des animaux sous anesthésie générale et l'acquisition des photos ne dépasse pas 10 minutes. L'optomoteur permet de tester si les souris voient correctement en déterminant si elles sont capables de suivre le décor tournant qui les entoure. Il est réalisé sur des animaux vigiles et dure entre 30 minutes et 1 heure. Ce trio de tests sera répété 2, 3 ou 4 fois afin de suivre d'évolution de l'effet en fonction du temps.

Impact sur les animaux

Les 3 lignées de modèles murins Bbs que nous allons étudier deviennent progressivement aveugles dès 10 semaines. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui naissent en étant plus petits que des souris génétiquement modifiées. L'injection dans l'oeil que nous allons réaliser est un geste délicat qui s'il est mal executé peut mener à des lesions irréversibles et ainsi rendre les animaux aveugles. De la même manière, l'ERG et l'OCT sont des tests nécessitant une anesthésie durant lesquels les yeux des animaux doivent être hydratés fréquemment pour limiter les risques de cataracte résiduelle. Par contre, l'effet attendu suite à l'injection devrait être bénéfique pour les animaux car nous nous attendons à ce que les souris Bbs traitées aient une vision restaurée par rapport à leurs congénères non traités et nous espérons que cette restauration soit maintenue dans le temps.

Devenir

Dans un premier temps, les animaux utilisés dans les croisements pour la génération des cohortes d'animaux explorées seront gardés en vie. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiées.

Remplacement

Le recours à n’importe quel autre modèle alternatif (cellulaire, informatique…) ne permettrait pas l’étude d'un organe aussi précocément (14 jours de vie) avec une telle diversité et complexité cellulaire comme chez la souris. Dans notre cas, l’utilisation d’un modèle murin permet d’avoir un modèle proche de la maladie humaine et de pouvoir effectuer les tests in vivo tels que l'électrorétinogramme (ERG), la tomographie par cohérence optique (OCT) et l'optomoteur qui mesurent les capacités visuelles des souris et aident à déceler une potentielle atteinte rétinienne.

Réduction

Les effectifs pour chaque analyse ont été déterminés d’après la littérature en prenant en compte la variabilité interindividuelle, la vulnérabilité des modèles murins étudiés. Ils correspondent aux nombres minimaux de souris à inclure pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et exploitables entre les différents groupes étudiés. Nous nous sommes également basés sur d’autres études publiées sur d'autres modèles murins Bbs (Bbs1, Bbs4 …) pour confirmer ces effectifs.

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupes sociaux pour éviter l'appartition de comportements anormaux ou de stéréotypie. Un milieu enrichi en coton de nidification, tubes cartonnés et morceaux de bois sera mis à leur disposition pour les occuper et réduire leur stress, ils pourront ainsi occuper l'espace de leur cage, ronger et les femelles pourront contruire le nid qui accueillera et réchauffera leurs nouveaux-nés. Ils auront accès à l’eau et la nourriture « ad libitum ». Nous nous assurerons du bien-être des animaux en contrôlant le pelage, l’aspect général des souris, leurs comportements individuels et vis-à-vis de leurs congénères. Une observation quotidienne et une pesée hebdomadaire permettront de détecter les souris présentant des signes de souffrance, douleur, détresse. Nous avons établi, en annexe, des points limites à rechercher afin de soutraire les animaux à la souffrance

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle murin de syndrome de Bardet-Biedl (BBS) permet d’avoir un modèle proche de la maladie humaine et de pouvoir effectuer les tests fonctionnels nécessaires à l’étude tels que tomographie par cohérence optique (OCT) et l’électrorétinogramme (ERG) qui mesurent les capacités visuelles des souris et permet de déceler la dégénérescence rétinienne. Ces tests sont des tests applicables à l’homme ce qui les rendent pertinents dans le cadre de ce projet qui étudient des modèles murins de maladies génétiques rares humaines. On ne peut pas substituer notre étude "in vivo" par des études "in vitro" puisqu'il est impossible d'obtenir un système intégré et une diversité cellulaire similaire à la rétine, à un stade aussi précoce. Pour ce projet, nous effectuerons l'injection dans les yeux des souris à 14 jours : âge à partir duquel elles ouvrent les yeux puis nous poursuivrons nos expériences jusqu'à l'âge de 8 mois.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe sous la peau de cellules de glioblastome, puis neuf séances de chimiothérapie et de radiothérapie sur trois semaines, avec des anesthésies répétées. Le porteur teste une molécule censée bloquer la multiplication des cellules tumorales, dans une étude qu'il qualifie de preuve de concept avant un éventuel modèle de greffe dans le cerveau. Il affirme que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est pas possible pour ce cancer lié au statut hormonal.

Objectifs

Les gliomes constituent l'un des groupes de tumeurs cérébrales les plus fréquents chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome (GBM) dont la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle protecteur des hormones féminines (œstrogènes). Des études sur des modèles murins indiquent que les œstrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur les modalités de réponses des cellules tumorales aux œstrogènes. Ceci apparait donc comme un axe de recherche pertinent. Dans une étude préliminaire pluridisciplinaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de GBM et identifié qu'un récepteur était justement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons pu montrer pour la première fois que l'activation de ce récepteur parune molécule (G1) bloque la multiplication des cellules tumorales. La combinaison du G1 avec le traitement de radio et chiomiothérapie actuellement prescrit des GBM conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, l'utilisation de cette molécule (G1) pourrait constituer une stratégie thérapeutique nouvelle, ce que nous voulons démontrer via une étude préliminaire "in vivo".

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet initial constitueront une base pour proposer l'utilisation d'une molécule (G1) pour le traitement des GBM. Cette étape est indispensable pour soutenir la valorisation clinique de nos travaux. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature scientifique) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences de survie entre les hommes et les femmes atteints de GBM. En cas de résultats probants, cela permettrait de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant l'utilisation de médicaments interagissant avec des récepteurs des œstrogènes dans le cas du traitement de certaines tumeurs résistantes au traitement standard.

Procédures

injection sous-cutanée de cellules tumorales (procédure 1) : 1 seule itération durée 5 min - administration des traitements (procédure 2 ) : schéma de traitement étalé sur 3 semaines pour l'administration des traitements -(chimiothérapie et radiothérapie) : 3 jours de traitement x 3 semaines = 9 itérations pour chaque groupe. La durée des traitements est de 3 min maximum (quelques secondes pour l'administration par voie intra-veineuse et quelques minutes pour la radiothérapie).

Impact sur les animaux

La nuisance associée à ces procédures est surtout à liée à la fréquence des anesthésies et des traitements (3 par semaine sur 3 semaines soit 9 au total).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures 1, 2 et 3. Tous les animaux seront ensuite mis à mort à l'issue de la procédure 4.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris males ou femelles ...) En l'occurence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

Dans le cadre de notre étude, 2 lignées tumorales sont utilisées: une exprimant normalement le récepteur aux oestrogènes GPER (wt) et l'autre non (GPER-KO) sur un modèle de greffe de cellules tumorales sous-cutanée. Cette étude préliminaire fait office de preuve de concept et permet de valider/invalider l'efficicacité des traitements testés sur un modèle de première ligne (injection de cellules tumorales en sous-cutanée) en utilisant un effectif d'animaux assez réduit (8 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus à partir de cette étude pilote, une étude avec un nombre plus grand d'animaux sera envisagée sur un modèle de greffe intra-cérébrale plus proche de la pathologie clinique.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique), puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois par semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale 3 fois par semaine). Une vigilance accrue sera également exercée pendant le temps d'admiministration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'évolution de la tumeur). Un suivi quotidien garantissant le bien-être des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau boisson et croquettes ad libitium, enrichissement sous forme de feuilles de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Lorsqu'un point limite sera atteint, l'animal sera mis en mort.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins, (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées athymiques sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris Nude (mâles ou femelles) seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit des injections induisant une encéphalomyélite, modèle de sclérose en plaques, dont le porteur décrit les signes attendus, une faiblesse pouvant aller jusqu'à la paralysie des membres. Les souris sont suivies par un score clinique pendant 28 jours puis tuées pour prélever cerveau, moelle épinière et organes. Le porteur affirme que ce modèle est la seule alternative adaptée à l'étude des mécanismes immunitaires de la maladie.

Objectifs

Notre projet a pour objectif général de caractériser la composante immunitaire de l’inflammation chronique. Celle-ci est liée à des pathologies aussi diverses que les cancers, les maladies cardio-vasculaires et les maladies autoimmunes, notamment la sclérose en plaques (SEP), maladie autoimmune du système nerveux central (SNC), touchant plus de 100.000 personnes en France et 3 millions dans le monde. Il a en effet été montré que chez des patients atteints de SEP, les lymphocytes T régulateurs (Treg) perdent leur fonction suppressive. De plus, dans un environnement inflammatoire, l’identité même des Tregs est modifiée, menant à des modifications épigénétiques et phénotypiques, et aboutissant à une perte de leur capacité régulatrice. La compréhension de ces phénomènes pourrait pourtant permettre de mieux comprendre le déficit fonctionnel des Treg au cours de la SEP, et de définir des cibles thérapeutiques et donc de nouveaux traitements de cette pathologie. Les modèles animaux de SEP permettent, contrairement à ce qui est possible chez les patients, d’étudier l’inflammation locale. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications d’identité des Tregs au cours de l’inflammation chronique dans un modèle de SEP, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris.

Bénéfices attendus

La SEP est une maladie extrêmement invalidante, réduisant l’espérance de vie, induisant un coût social important et touchant plus de 3 millions de patients dans le monde. Les traitements actuels permettent dans certains cas de ralentir la progression de cette pathologie, mais l’arsenal thérapeutique n’est encore pas assez développé, et bon nombre de patents ne répondent pas, ou plus, aux traitements. Cette pathologie a pour origine un dysfonctionnement du système immunitaire dont les mécanismes ne sont pas encore bien identifiés. Les recherches portant sur la compréhension de ces mécanismes immunologiques sont indispensables à l’élaboration de nouveaux traitements de la SEP. Le système immunitaire formant un système complexe dont la globalité n’est pas pleinement reproductible in vitro, les modèles animaux de cette maladie permettent de mieux comprendre les étapes cellulaires et moléculaires à l’origine de l’initiation, du développement et de l’entretien des atteints du SNC caractérisant la SEP et menant au handicap qui en résulte. Les bénéfices attendus de notre projet sont, à court terme, de comprendre les mécanismes immunitaires de l’inflammation chronique du SNC dans le modèle d‘EAE pour, à plus long terme, définir des cibles thérapeutiques qui constitueront la base de nouveau traitements de la SEP chez les patients.

Procédures

2 injections sous cutanées et 2 injections intra-péritonéales en 2 jours, sur animaux vigiles, d'une durée de moins d'une minute par injection. Un prélèvement de sang rétro-orbitaire sous anesthésie générale (1 à 2 minutes pour le prélèvement, environ 1h d'anesthésie) une semaine avant le début des injections et un prélèvement de sang intra-cardiaque (1 à 2 minutes de prélèvement) sous anesthésie générale terminale également en fin d'expérimentation. Les traitements seront réalisés quotidiennement par voie orale (moins de 2 minutes) ou intra-péritonéale (moins de 1 minute) dans un volume maximum de 0.2 ml et dilués dans de l’eau ou du PBS, au maximum pendant toute la durée de l’expérience, soit 28 jours. Le scoring (environ 2 minutes par souris) sera effectué par examen clinique des animaux : simple observation de la queue (flaccidité ou non), des pattes postérieures et antérieures (mobiles ou non). L’état général des animaux sera évalué à chaque scoring. Le scoring sera réalisé trois fois par semaine pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont les signes cliniques de l’EAE : perte de mobilité (faiblesse à paralysie des membres postérieurs et antérieurs) réversibles après 2 semaines en absence de traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer de nombreux prélèvements d'organes (cerveau, rate, moelle épinière, ganglions, moelle osseuse et sang) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.

Remplacement

Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la SEP. Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le declenchement de l’inflammation chronique du SNC. Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP.

Réduction

Cette étude utilisera un total de 1200 animaux. Le nombre de souris nécessaires dans chaque procédure est défini sur la base d'un calcul de puissance et des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Le nombre de souris défini pour chaque groupe devrait être suffisant pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Des analyses statistiques seront réalisées pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Sur les animaux seront prélevés sur chaque animal le sang, le cerveau, la moelle épinière la rate, les ganglions et la moelle osseuse afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies avec du coton et des igloos pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs, Le score clinique précis des souris et évalué 3 fois par semaine par les expérimentateurs. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adapté à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. Les scores cliniques de l’EAE seront évalués pendant 2 à 8 semaines après l'induction. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris génétiquement modifiées développent une alopécie et un retard de développement important, puis sont tuées par dislocation cervicale au vingt-deuxième jour pour prélever leur peau. Le porteur étudie une protéine qu'il dit potentiellement impliquée dans le psoriasis et les cancers de la peau, en s'appuyant aussi sur des cultures de cellules. Il affirme que la souris est le seul mammifère permettant le mutant conditionnel recherché.

Objectifs

Le projet s'intéresse à une protéine potentiellement impliquée dans les cancers de la peau et le psoriasis. L'objectif principal est donc de mieux comprendre les fonctions de cette protéine dans la prolifération, dans la différenciation cellulaire et dans le développement de la peau. L'étude sera effectuée sur l'épiderme d'une souris transgènique n'exprimant plus la protéine d'intérêt dans sa peau. Le modèle utilisé permet de réaliser efficacement des expérimentations complémentaires sans utilisation d'animaux mais avec des cellules de la peau en culture.

Bénéfices attendus

Savoir si la protéine est impliquée dans certaines maladies de la peau telle que le psoriasis ou le cancer de la peau. Comprendre le mécanisme d'action de cette protéine dans la prolifération et la différenciation de kératinocytes de l'épiderme et donc dans les autres cellules de l’organismes et donc de comprendre un mécanisme clef de l’épigénétique. On rappelle que l’épigénétique est la science qui étudie l’expression du génome par les cellules, une des clefs du vieillissement et des cancers, entre autres…

Procédures

Pas d'intervention sur ces animaux. Les souris avec un phénotype vont être mises à mort au 22éme jour et la peau sera par la suite prélevée.

Impact sur les animaux

Les souris avec un phénotype vont avoir de l'alopécie (problème d'émergence de poils) et un retard de développement important. Il n y’a pas de mortalité entre la naissance et le 22éme jour.

Devenir

Les animaux seront mises à mort par disolocation cervicale pour récupérer la peau.

Remplacement

Les souris nous permettrons de procéder à la délétion complète de la protéine d'intérêt (qui est exprimer par deux gènes) à un temps voulu et qui sera spécifique à l’épiderme. Le choix d'utiliser des souris se justifie par le fait que c’est un mammifère proche de l’Homme, qui est un très bon modèle pour les manipulations génétiques puisque nous partageons plus de 95% de nos gènes. De plus, la connaissance approfondie de cette espèce assure une bonne prise en charge de l’animal, de son environnement (enrichissement du milieu) et de sa potentielle douleur. De plus, nous avons besoin d’un mutant conditionnel pour les deux gènes considérés, la souris est la seule espèce mammifère où cela est possible. Les autres modèles eucaryotes (levure, C. elegans et drosophile n’offrent pas les mêmes possibilités d’étudier différenciation et prolifération). A partir de ses souris, nous pourrons ensuite étudier les processus moléculaires et biochimiques à l’aide de cultures primaires de kératinocytes.

Réduction

À partir des mêmes souris avec un phénotype, des prélèvements de peau seront prélevés pour effectuer différentes analyses. En plus, à partir de ses souris, nous pourrons ensuite étudier les processus moléculaires et biochimiques à l’aide de cultures primaires de kératinocytes. Nous travaillerons aussi sur animaux mâles et femelles afin de diminuer le nombre d’animaux dans l’élevage nécessaire.

Raffinement

Les souris seront observées selon une fréquence adaptée à la survenue des symptômes. Un enrichissement adapté à l'état de la souris sera mis en place (en particulier, des matériaux pour un nid volumineux seront fournis), l'alimentation aussi sera adaptée pour faciliter la lactation de la mère allaitante (mettre des croquettes mouillées ou de l'hydrogel). De la buprénorphine sera administrée en attente du point limite si besoin.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser des souris se justifie par le fait que c’est un mammifère proche de l’Homme, qui est un très bon modèle pour les manipulations génétiques puisque nous partageons plus de 95% de nos gènes. De plus, la connaissance approfondie de cette espèce assure une bonne prise en charge de l’animal, de son environnement (enrichissement du milieu) et de sa potentielle douleur. De plus, nous avons besoin d’un mutant conditionnel pour les deux gènes considérés, la souris est la seule espèce mammifère où cela est possible. Les autres modèles eucaryotes (levure, C. elegans et drosophile) n’offrent pas les mêmes possibilités d’études. L'étude sera effectuée sur des souriceaux qui ont 22 jours, car le phénotype commence à apparaitre à partir de 18éme jour. On constate de l'alopécie qui est présente sur la souris et un retard de développement et quelques échantillons pris à ce stade ont été déjà envoyés à des collaborateurs. Donc, la suite de l'étude doit être effectuée au 22éme jour.