Souris

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris hémophile reçoit une injection de thérapie génique, des prélèvements sanguins rétro-orbitaux toutes les quatre semaines, puis un test de temps de saignement où l'extrémité de la queue est sectionnée sur trois millimètres. Le porteur indique que les animaux, encore sous anesthésie et ayant perdu du sang, sont tués par dislocation cervicale sans réveil. Il affirme que les tests in vitro ne reproduisent pas l'ensemble du processus de coagulation.

Objectifs

L'hémophilie A est une maladie hémorragique rare affectant principalement les hommes (1 naissance de garçons sur 5000 environ). Il s'agit d'une maladie génétique et le gène affecté est celui du facteur VIII, une protéine clé de la cascade de la coagulation. Si la maladie n'est pas traitée, l'espérance de vie est en moyenne de 15 ans. Le traitement standard de l'hémophilie A repose sur l'injection intraveineuse régulière (2-3 fois/semaine) de facteur VIII soit recombinant, soit purifié à partir de plasma. Ce traitement est lourd et coûteux. Récemment un anticorps thérapeutique qui peut se substituer au facteur VIII a été développé. Cet anticorps (Emicizumab) a montré une très bonne efficacité chez les patients hémophiles A sévères et est désormais approuvé par les autorités de santé. Il est administrable par voie sous-cutanée 1-2 fois/mois. L’Emicizumab ne normalise pas la coagulation mais transforme une hémophilie sévère en hémophilie mineure. De ce fait, un traitement par Emicizumab n’est pas toujours suffisant et doit parfois être utilisé en combinaison avec d’autres agents procoagulants. L’effet de telles associations est encore très mal connu et lors des essais cliniques sur l’Emicizumab, il y a eu malheureusement des accidents pro-thrombotiques et des cas de décès de patients dus à un emballement du système de coagulation. De plus, son utilisation est coûteuse et de ce fait 70% des patients dans le monde n'ont pas accès à ce type de thérapie. L'objectif de ce projet est de répondre à ces 2 limites, le risque de thrombose par utilisation d'un anticorps thérapeutique mimant le FVIII et le coût élevé d'un traitement par injection d'un anticorps purifié de façon régulière. Pour répondre à cet objectif, le but de notre projet est de tester in vivo un nouvel anticorps thérapeutique développé par une biotech, qui comme l’Emicizumab a montré in vitro qu’il corrigeait l’hémophilie. Cet anticorps a montré dans des tests in vitro que contrairement à l'Emicizumab il évitait les thromboses. Il sera exprimé in vivo par l’utilisation d’un vecteur viral qui permettra en une injection une expression sur plusieurs années de la thérapie. Il s'agira de déterminer si cette nouvelle thérapie est efficace pour corriger les saignements anormaux observés chez un organisme vivant hémophile.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à plusieurs attentes actuelles concernant les traitements des patients hémophiles : 1) Eviter les effets secondaires des nouveaux traitements notamment les risques de thromboses chez certains patients. 2) Utiliser un système thérapeutique, la thérapie génique, éliminant les injections intraveineuses répétées qui sont douloureuses pour les patients. 3) Réduire le coût des traitements et rendre plus accessible les traitements au 70% de la population mondiale hémophile qui n'a toujours pas accès à une thérapie. L'espérance de vie d'un patient hémophile sévère sans thérapie est de 15 ans.

Procédures

Les souris sont injectées vigiles au niveau de la veine latérale de leur queue avec 200 µl d'un solution d'AAV. Elles sont observées pendant 12 semaines avec un prélèvement rétro-orbitalde sanguin toutes les 4 semaines. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Au terme des 12 semaines de suivi, un test de temps de saignement sera réalisé afin de vérifier l'efficacité fonctionnelle de l'anticorps exprimé. Le test de temps de saignement sera réalisé sur les souris sous anesthésie (l’extrémité de la queue de la souris est sectionnée sur 3 mm à l'aide d'un scalpel stérile). Les animaux sont gardés en vie au maximum 35 minutes lors du test de coupure de l’extrémité de leur queue (5 minutes pour l'anesthésie, suivie de 30 minutes pour le test de saignement).

Impact sur les animaux

Pendant les 12 semaines maximums de suivi de l'expérience, les souris hémophiles à la suite de l'injection de la thérapie génique risquent principalement de développer des hémorragies. Pendant le temps de saignement, l'animal sera sous anesthésie par un mélange Xylazine (10 mg/kg) –Kétamine (100 mg/kg). Si pendant cette période, l’animal présente des signes de réveil, une nouvelle dose d’anesthésiant sera administrée (demi-dose par rapport à la dose initiale).

Devenir

Tous les animaux sont encore sous anesthésie à la fin de la procédure où ils subissent un test de saignement qui dure 30 minutes. Ils auront alors perdu pour certain un volume de sang important. Il est plus éthique de ne pas réveiller les souris utilisées dans la procédure de ce projet et de les euthanasier par dislocation cervicale.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, autant des molécules procoagulantes que leurs inhibiteurs mais aussi des phospholipides membranaires, des cellules sanguines, les vaisseaux sanguins et les tissus. Actuellement les tests disponibles in vitro, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Par conséquent, afin de tester l’efficacité anti-hémorragique du Bi8 via thérapie génique, il est crucial de pouvoir tester son effet dans un modèle animal d'hémophilie A.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à l’ensemble de l’étude a été défini pour chaque procédure de façon à avoir une réponse statiquement analysable sur tous les paramètres mesurés. Les mêmes souris permettront de mesurer différents paramètres : taux d’expression de l'anticorps thérapeutique, efficacité du traitement à restaurer la coagulation, effet du traitement sur le bien-être et sur la survie de l’animal, sur le bilan de cellules sanguines. Nous prévoyons d’utiliser 50 souris déficientes en FVIII pour ce projet.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec des groupes sociaux stables sans isolement, un accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu : morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid, en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront suivis individuellement et ils seront obligatoirement euthanasiés aux points limites définis dans la procédure. L’anesthésie générale sera induite dès la sortie du groupe afin d’éviter tout stress. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin d'hémophilie A (souris déficientes en facteur VIII) est bien caractérisé et a été utilisé dans la littérature scientifique comme un modèle préclinique valide d’hémophilie, reproduisant la pathologie humaine et permettant ainsi les tests de nouvelles thérapies anti-hémorragiques notamment la thérapie génique. Les souris seront injectées entre 6-12 semaines lorsqu'elles auront atteint un poids de 18-25 gr. La durée de suivi des expériences de thérapie génique (6-12 semaines) est alors compatible avec une fin de procédure à un âge compris entre 12 et 24 semaines. A ce stade, leur poids est tout à fait compatible avec la réalisation des expériences de saignement pour tester l'efficacité de la thérapie.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une irradiation sublétale sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse, d'autres des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pendant quatre mois, pour étudier le rôle du microenvironnement médullaire dans la leucémie aiguë lymphoblastique B. Le porteur décrit un développement leucémique spontané pouvant entraîner une paralysie de l'arrière-train et des tumeurs ganglionnaires, et toutes les souris sont mises à mort. Il affirme que la coopération des cellules et le rôle du stroma ne peuvent être reproduits in vitro de façon satisfaisante.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de type B (LAL-B), équivalents pathologiques des lymphocytes B (LB) en développement, sont la cause principale de cancer chez l’enfant, et bien que moins fréquentes, concernent un nombre de cas similaires chez l’adulte. Malgré l’amélioration des traitements de chimiothérapie, le pronostic reste mauvais dès le diagnostic chez l’adulte, et à la rechute chez l’enfant. De nombreuses études montrent que des cellules du microenvironnement de la moelle osseuse sont impliquées dans les mécanismes de résistance aux traitements mais leur identité précise et les mécanismes de protection mis en jeu restent mal connus. Pour ce type d’étude, puisqu’il est actuellement impossible d'obtenir des conclusions fiables in vitro nous ne pouvons pas nous passer des expérimentations conduites sur des animaux pouvant simuler les principales propriétés biologiques des leucémies humaines. Nos études précédentes nous ont permis de montrer que les cellules du microenvironnement qui soutiennent le développement des LB présentes de fortes similitudes entre l’homme et la souris. Peu de données sont par contre disponibles concernant l’influence de ce microenvironnement sur l’acquisition de mutations lors du développement pathologique des LB et sur son rôle de soutien de la leucémogénèse. Dans la présente demande d’autorisation, nous étudierons l’impact d'un facteur - produit par le microenvironnement et impliqué dans la prolifération des LB normaux – sur le développement leucémique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus auront un impact sur la santé humaine. En effet, la littérature montre clairement l'influence du microenvironnement sur le développement des LAL-B mais ces données restent parcellaires et peu de cibles thérapeutiques ont été identifiées. Nos travaux s'appuie sur la découverte par notre équipe d'une protéine produite dans la moelle osseuse sur la prolifération d'un sous type de LAL-B. L'utilisation du modèle de souris humanisé de développement leucémique nous permettra de comprendre les mécanismes de régulation et l'identification à moyen terme de facteurs représentant des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Trois types d'intervention seront effectuées sur les animaux. Pour le suivi du développement leucémique, des prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro orbital ou de la veine faciale afin d’espacer au maximum les prélèvements à un même site et permettre ainsi une parfaite cicatrisation. Ces prélèvements seront espacés de 2-3 semaines sur un maximum de 4 mois et seront effectués sur 248 animaux. Des transplantations de cellules de moelle osseuse seront aussi effectuées sur 108 souris. Le protocole implique tout d'abord une irradiation sublétale sur animaux vigiles suivie le lendemain d'une injection intra veineuse des cellules de moelle au niveau du sinus rétro orbital sous anesthésie gazeuse. Ce geste ne sera effectué qu'une fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

Notre projet implique des souris génétiquement modifiées (expression d'une protéine de fusion identifiée dans des LAL-B humaines) pour lesquelles on observe un développement leucémique spontané. Les symptomes les plus couramment observés sont une paralysie du train arrière ou des tumeurs ganglionnaires visibles. Le développement leucémique peut aussi s'accompagner d'une diminution du taux d'hématocrite. La cinétique de développement leucémique dans ce modèle étant connue, nous effectuerons des prélèvements sanguins de suivi avant l'apparition de ces symptômes pour limiter tant que possible l'inconfort de l'animal. Ces sympômes seront considérés comme points limites et seront de plus complétés par une grille de score tenant compte des éventuels changement de poids corporel, de l'apparence physique, de signes cliniques objectifs, de comportement non provoqué et des réponses comportementales aux stimuli.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures

Remplacement

La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques). Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro. Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, du contexte cytokinique, sont cruciaux et ne peuvent actuellement pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux: lorsque possible et utile, un calcul d’effectif pour chaque groupe a été réalisé sur le site BiostaTGV (voir partie 3.4.10, justification du nombre d’animaux). Réduction du stress: présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton), maintien des animaux en groupes de 4-5 afin d’éviter l’isolement et les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris dans la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation.

Raffinement

la détection précoce et encore asymptomatique du développement leucémique se fera à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis quotidiennement. Ainsi, l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score de douleur spécifique de ces modèles de pathologies hématologiques. Afin de réduire le stress et d’améliorer le cadre de vie des animaux, nous optimiserons les conditions de leur hébergement, par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et/ou coton), et par le maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin de respecter leur instinct grégaire.

Choix des espèces

Le modèle souris est celui utilisé majoritairement par la communauté scientifique pour mimer les altérations génétiques à l’origine des leucémies chez l’homme. Ainsi, dans le modèle de souris que nous utiliserons, il a été démontré que les lymphocytes B qui se développent en cellules leucémiques acquièrent les même mutations que chez l’homme. Par ailleurs, nous avons montré que les cellules qui supportent le développement des lymphocytes B sont similaires entre l’homme et la souris. Ces résultats montrent la relevance du modèle souris pour l’étude de la biologie des LAL-B humaines. Les études proposées nécessiteront l’utilisation d’animaux avant l’apparition de symptômes, c’est à dire entre 4 et 8 semaines et dans la tranche d’âge ou apparaissent les symptômes c’est-à-dire entre 13 et 34 semaines. Nous pourrons également utiliser des cellules issues de ces animaux pour tester des thérapeutiques innovantes en accord avec leurs altérations génétiques. Ces cellules seront issues d'animaux pré-leucémiques (avant 8 semaines) ou leucémiques (après 13 semaines).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rendu obèse par un régime riche en lipides, puis soumis à des mises à jeun, des tests de tolérance au glucose et des prélèvements de sang à la queue, pour évaluer l'effet d'un prébiotique et de vitamines B sur les améliorations métaboliques liées à la perte de poids. Les organes sont ensuite prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que l'étude du microbiote et des variations de poids "ne peut être réalisée in vitro" et "nécessite" le recours à la souris.

Objectifs

L'incidence de l'obésité sévère et des complications métaboliques associées est en constante augmentation, constituant un problème de santé publique majeur au niveau mondial. L'obésité est un facteur de risque de développement de complications cardiométaboliques comme le diabète de type 2. Par ailleurs, l'altération de la composition et de la fonctionnalité des bactéries peuplant notre intestin, appelé microbiote intestinal, semble également être un élément clé dans ce contexte. On note notamment une diminution du nombre d'espèces bactériennes ainsi que des modifications fonctionnelles du microbiote intestinal en situation pathologique telle que le diabète de type 2 ou l'obésité sévère. Parmi les nombreux paramètres physiologiques modulés par le microbiote intestinal, on trouve la production de certaines vitamines. Ainsi, l'altération de la production bactérienne des vitamines B pourrait avoir un impact sur le statut vitaminique, inflammatoire et métabolique de l'hôte. Des résultats préliminaires ont montré que chez des patients atteints d'obésité, les taux circulant de certaines vitamines et leur production bactérienne étaient diminués suggérant un déficit en vitamines dans ce contexte. Enfin, on sait que la perte de poids dans ce contexte, présente un grand nombre de bénéfices pour l'hôte: amélioration de la réponse au glucose, diminution de l'inflammation; Notre hypothèse est donc qu'en situation de perte de poids suite à une obésité sévère, une supplémentation en vitamines associée à une modulation des bactéries du microbiote intestinal par un apport en fibres, potentialiserait les bénéfices déjà connus de la perte de poids. Suite à une obésité induite par l'administration d'un régime enrichi en lipides, nous échangerons le régime par un régime standard moins riche en lipides. En parallèle, les animaux seront supplémentés en vitamines et fibres avant et/ou pendant la perte de poids.

Bénéfices attendus

A la vue des expériences préliminaires et de la littérature, la double supplémentation en FOS et biotine devrait permettre de limiter la prise de poids, notamment de masse grasse et de limiter aussi l'altération du métabolisme gludicidique induits par le régime HFD. De même il est attendu que lors de la perte de poids induite par un changement de régime, cette double supplémentation permette de potentialiser les effets métaboliques de la perte de poids. Par ailleurs, ces résultats permettront une translation chez l'Homme plus aisée et la mise en place d'études adéquates pour améliorer la prise en charge de l'obésité sévère chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des mesures de la composition corporelle permettant de déterminer leur pourcentage de masse maigre et de masse grasse toutes les deux semaines. Pour cela les animaux vigiles sont placés dans un tube s'adaptant à leur taille le temps de la mesure. Cette mesure est non invasive, silencieuse et rapide (2 minutes) ce qui permet de limiter le stress subit par les animaux. Les animaux seront également soumis à des tests de tolérance au glucose pour lesquels une mise à jeun de 6h est nécessaire suivie d'une ingestion de glucose par les animaux et de mesures de leur glycémie aux temps 0, 15, 30, 60 et 90 min post-ingestion à l'aide d'un appareil mesurant le taux sanguin de glucose à partir d'une goutte de sang prélevée à la queue. En parallèle aux temps 0, 15, 30 et 60 min, 30μl de sang sont prélevés à la queue à l’aide d’un tube adapté pour effectuer un dosage sérique d’insuline. Tout au long de cette procédure, tout sera fait pour limiter le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utlisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire.

Devenir

La collecte des organes chez les souris préalablement traitées avec le FOS et la biotine dans le contexte de la perte de poids induite en échangeant le régime hyperlipidique par un régime standard chow nous permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les paramètres métaboliques mesurés au cours du suivi. Pour cela, la collection d'organes après l'euthanasie des animaux est nécessaire.

Remplacement

L’étude de l’écosystème microbien digestif et son impact sur les maladies métaboliques, ne peuvent être réalisés in vitro. En effet, la majorité des bactéries digestives ne survivent en dehors de leur hôte, en l’occurrence la souris, ce qui nécessite le recours au modèle murin. Par ailleurs, les variations pondérales entrainent des modifications au niveau d’un grand nombre d’organes et nécessite donc d’être étudiée in vivo. De plus, les grandes fonctions systémiques (immunité, inflammation) participent de manière très importante au développement des désordres métaboliques, qui ne saurait donc être évaluée en l’absence de ces systèmes. La souris est l’espèce choisie dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisables ; de plus, la présence de notre établissement utilisateur sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, le design expérimental présenté correspond au nombre minimal de groupes et de souris nécessaires afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statistiquement fiables. Le calcul de puissance indique que 10 souris par groupe « traitement » est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables compte tenu de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés (poids, tolérance au glucose).

Raffinement

Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisables ; de plus, la présence de notre établissement utilisateur sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation. Nous souhaitons observer les effets sur l’état métabolique des animaux à l’âge adulte ; les animaux seront donc âgés de 8 semaines au début du traitement et de la mise sous régime. Une semaine d’habituation sera observée après la réception des animaux afin de limiter leur stress.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur mammaire greffée, reçoit des injections répétées de luciférine et des séances d'imagerie sous anesthésie pendant deux semaines et demie, pour étudier le rôle de la MMP11 des adipocytes dans la croissance tumorale. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au CO2 pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme que l'animal est "nécessaire" pour reproduire la croissance tumorale du cancer du sein sur "l'organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet, nous allons étudier le rôle de la métalloprotéase matricielle-11 (MMP11) sécrétée par les adipocytes dans la croissance tumorale par imagerie en bioluminescence. Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade précoce du développement tumoral. Pour montrer cela, nous avons implanté des cellules cancéreuses mammaires en localisation orthotopique dans la glande mammaire des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 dans le tissu adipeux. Puis, nous avons mesurer le volume des tumeurs mammaires dans ces souris à l'aide d'un pied à coulisse durant 2 semaines et demi. Etant donné que la MMP11 agit à un stade précoce du développement tumoral, nous souhaitons analyser précisément ce qui se passe au stade précoce grâce à une méthode d'imagerie sensible qui détecte les tumeurs à un stade infra clinique. Cette méthode nous permet donc de quantifier précisément les tumeurs de petite taille, de visualiser et de suivre en temps réel et de manière non invasive les cellules cancéreuses bioluminescentes afin de compléter les données obtenues avec le pied à coulisse. Nous pouvons ainsi visualiser de manière beaucoup plus précoce et fonctionnelle, la cinétique de développement des tumeurs à partir des cellules cancéreuses, ainsi que la dissémination locale des cellules tumorales. Nous n'attendons pas de dissémination à distance des tumeurs formées (métastases) car notre expérience se limite au stade précoce du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Cette procédure permettra d'avoir une vision beaucoup plus précoce et fonctionnelle des tumeurs obtenues à partir des cellules mammaires cancéreuses, en présence et en absence de la MMP11, dans la quatrième glande mammaire inguinale des souris et ainsi de mettre en évidence la contribution des adipocytes dans la progression des tumeurs mammaires.

Procédures

Lors de ce projet, les souris seront soumises à un total de 3 interventions réalisées par le manipulateur : 1. L'acquisition d'images bioluminescentes par l'imageur nécessite d'endormir les souris grâce à un mélange d'isoflurane et d'oxygène dans une boîte à induction en plexiglas puis de maintenir cette anesthésie durant toute la période d'imagerie (30 minutes maximum). 2. Afin d'imager les souris, pour une souris de 20-25g, 100µL de luciférine est injecté par voie intrapéritonéale afin d'injecter environ 3.3mg de luciférine par souris pour une dose de 150mg/kg. 3. Pour finir, au bout de 2 semaines et demi, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale par une personne habilitée ou par inhalation de CO2, afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées de luciférine, nous n'attendons pas d'effets indésirables de la luciférine mais du fait de la répétition des injections, par précaution, nous surveillerons les animaux. Notre protocole d'observation des tumeurs est établi sur une courte durée (2 semaines et demi) ce qui permet d'observer les premières étapes de la cancérogénèse, ainsi les tumeurs seront de petite taille durant tout le protocole, et nous ne devrions pas observer d'effets indésirables (nécroses, métastases etc), mais les tumeurs seront tout de même surveillées tout au long du projet.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie pour un suivi de la croissance tumorale durant 2 semaines et demi, puis les souris seront sacrifiées afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires. Aucun animal sera donc maintenu en vie au terme de ce projet.

Remplacement

L'utilisation des animaux est nécessaire pour mimer le plus fidèlement possible la croissance tumorale observée chez les femmes atteintes d'un cancer du sein, notamment du fait de la présence de glandes mammaires différenciées et fonctionnelles présentant du tissu adipeux, mais également du fait que la progression tumorale implique tout l'organisme et que les souris présentent un système immunitaire fonctionnel qu'il est impossible de récapituler in vitro. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de croissance tumorale est semblable à celui de la femme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude.

Réduction

Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade très précoce du développement tumoral. Ces résultats solides permettent la mise en place d'une expérience complémentaire sur un nombre limité de souris qui viendront compléter et confirmer les données obtenues. Cela signifie également que les modèles de souris génétiquement modifiées sont déjà disponibles. Les paramètres mesurés nécessitant l'utilisation de tests statistiques sont la taille des tumeurs et le poids de l'animal. Ces paramètres seront mesurés 2 jours par semaine pendant 2 semaines et demi après l'injection des cellules cancéreuses, et les analyses statistiques se feront de manière indépendante pour chacun de ces jours. Vu que nous travaillons seulement avec des groupes de 5 souris, nous utilisons un test non paramétrique (Mann-Whitney) de comparaison entre deux groupes (souris mutantes et souris contrôles appariées) avec le logiciel PRISM qui s'appliquent aux petits échantillons.

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages leur assurant un bien-être avec de la sciure de bois comme litière. Celle-ci est remplacée de manière hebdomadaire pour une hygiène optimale. Le stress est diminué au maximum en hébergeant les souris dans des cages transparentes permettant la visualisation des autres souris et en les habituant à la vue de l'opérateur expérimental qualifié pour les procédures liées à l'expérimentation animale. La taille de l'aiguille permettant l'injection de la luciférine sera adaptée au poids de l'animal afin de réduire le risque de lésion induite par l'aiguille. L'occurence de blessure éventuelle et le risque d'infection au niveau de la zone d'administration de la luciférine seront pris en considération. Pendant l'imagerie, les souris sont anesthésiées afin d'éviter tout stress. De plus, les souris seront placées sur un support chauffant afin d’éviter toute déperdition de chaleur causée par l’anesthésie. Elles seront ensuite suivies dans les heures suivant l'injection. Des visites quotidiennes seront effectuées afin de vérifier le niveau d'inconfort et les signes de douleur des animaux dans la cage (diminution des comportements d'exploration, diminution de la prise de boisson et/ou de nourriture, perte de poids, posture voutée, etc...). Autrement, nous n'attendons pas de signes cliniques péjoratifs lors de la procédure expérimentale, mais nous surveillerons tout de même : la réaction des souris suite à des injections répétées de luciférine, l'aspect des tumeurs, la difficulté des souris à se déplacer à cause d'une gêne occasionnée par la taille et la localisation des tumeurs. En cas de souffrance visible ou de douleur apparente des animaux, un avis vétérinaire sera sollicité pour décider de la continuité ou de l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été retenu car c'est le seul pour lequel il est possible de manipuler le niveau d’expression de la MMP11 en employant des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 de manière tissu-spécifique. Ces modèles permettent de répondre directement à notre objectif. A notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle animal plus simple permettant de répondre à la problématique inhérente à ce projet. Les souris utilisées pour ce projet seront âgées de 8 semaines au moment de l’expérimentation de manière à étudier la progression tumorale mammaire dans un organe différencié et fonctionnel.

2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.

Impact sur les animaux

Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.

Remplacement

En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hors animaux reproducteurs et de maintien de la lignée. Porteuses d'une mutation reproduisant l'ataxie de Friedreich, les homozygotes développent une ataxie vers trois mois et sont suivies par des tests comportementaux réguliers et des électromyogrammes, avant l'injection d'un vecteur de thérapie génique et une mise à mort à neuf mois pour analyses. Le porteur qualifie ces tests de comportement d'"indolores et sans stress" pour l'animal. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer cette approche et qu'une validation in vivo est "indispensable".

Objectifs

L’ataxie de Freidreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est dû a une perte de frataxine, une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Une approche de thérapie génique permettant de restaurer les taux physiologiques de frataxine est en cours de développement. Un nouveau modèle murin avec une mutation ponctuelle dans la frataxine a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation ponctuelle identifiée chez certains patients. Ce modèle est en cours de caractérisation, mais nous savons que ce modèle développe un phénotype neurologique progressif entre 3 et 9 mois, similaire à la maladie humaine. Ce modèle murin nous permettra donc de comprendre les états précoces de la maladie, et de développer une approche préclinique de thérapie génique. Le projet a 2 axes : 1) caractériser le phénotype neurologique du modèle au cours du temps, notamment au cours des trois premiers mois et 2) appliquer et optimiser un protocole de thérapie génique avec un vecteur permettant d’exprimer la frataxine à des niveaux proches de l’endogène.

Bénéfices attendus

Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de valider ce nouveau modèle qui présente des faibles taux de frataxine de façon ubiquitaire et une mutation retrouvée chez l’Homme. Ce modèle pourra être utiliser pour continuer à comprendre la pathophysiologie de la maladie afin de développer des nouvelles approches thérapeutiques. Le deuxième bénéfice sera de continuer à développer au niveau préclinique une approche de thérapie génique.

Procédures

A partir de la naissance les animaux seront observés 2x /semaine (pour surveiller leur poids et taille). Des tests de comportement indolores et sans stress pour l’animal, effectués par le même expérimentateur, nous permettront d’identifier avec précision les défauts locomoteurs et de suivre l’évolution du phénotype. Les tests seront utilisés en conformité avec la littérature et les procédures établies au laboratoire. Ces tests seront effectués tous les 15 jours jusqu’à 12 semaines, et ensuite 1 fois par mois jusqu’à l’âge de 9 mois. Des mesures d’électrophysiologie par électromyogramme (EMG) seront effectués afin de mesurer la réponse proprioceptive des animaux et de corréler ses résultats aux données comportementales à 2 et 3 mois, puis 1 fois tous les 2 mois. A 9 mois, les souris seront mises à mort et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques et histopathologiques. (Procédure 1) Une deuxième cohorte de souris sera générée pour le prélèvement de tissus pour une caractérisation biochimique et histopathologique, à différents temps (naissance, 7 jours, 3 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois), ce qui correspond à différentes phases clés dans la progression de la maladie. Le point de 9 mois sera obtenu à partir de la cohorte de la procédure 1. (Procédure 2) Enfin deux autres cohortes seront générées pour évaluer une approche de thérapie génique, d’abord en pré-symptomatique puis en postsymptomatique. Après injection intraveineuse du vecteur médicament (vecteur exprimant la frataxine) soit avant symptômes (Procédures 3) ou après l’apparition des symptômes (Procédure 4), des tests de comportements ainsi que des mesures d’électrophysiologie seront effectués comme en procédure 1 pour évaluer l’effet thérapeutique. A 9 mois, les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus pour des analyses.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage sont maintenues à l’état hétérozygote, portant un seul allèle muté et un allèle sauvage. Elles n'ont pas de phénotype dommageable et ne nécessitent donc pas de surveillance particulière. Seuls les animaux homozygotes pour la mutation du gène de la frataxine issues des croisements entre deux souris hétérozygotes ont une réduction de la taille globale et développent des symptômes d’ataxie vers le 3ème mois, aspect qui nécessite d’être affiné. De la nourriture gélifiée sera proposée aux animaux dès l’apparition des signes de la maladie, détectés par les tests de comportement que nous effectuerons.

Devenir

Pour des analyses biochimiques et histologiques une mise à mort est nécessaire en fin de procédure en respectant les points limites et la progression de la maladie.

Remplacement

Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle est le premier modèle qui reproduit génétiquement une mutation ponctuelle retrouvée chez l’homme.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 720 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant en compte du nombre minimum nécessaire pour pouvoir appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires de nos collaborateurs nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Si aucun phénotype moléculaire/histologique n'est observé à 6 semaines, les cohortes prévues pour les points plus précoces ne seront pas générés. En l’absence de différence entre les mâles et les femelles, les données seront combinées afin de diminuer de moitié l’effectif.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et leur poids et taille seront mesurés 2x / semaine. Dès les premiers signes cliniques (défauts à la locomotion ou perte de poids), de la nourriture gélifiée sera mise à leur disposition dans la cage. Des points limites prédictifs sont déjà établies et validés par la communauté scientifique avec un « scoring » adapté aux modèles d’ataxie.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer la pertinence d’une approche de thérapie génique pour le traitement de l'Ataxie de Friedreich, notamment de la composante neurologique de la maladie. Il est alors nécessaire d’utiliser un modèle animal pour comprendre et proposer des approches thérapeutiques de la pathologie. La frataxine humaine sauvage est capable de compenser l’absence de frataxine murine endogène dans des modèles cellulaires et murins. Malgré l’existence de modèles cellulaires, une étude chez l’animal est indispensable pour déterminer la pertinence de cette approche de thérapie génique et afin d’établir une preuve de concept et l’innocuité de cette stratégie. Cette étape préliminaire est cruciale avant de pouvoir considérer une application chez l’Homme. Les études aux stades post-nataux débuteront à la naissance et se termineront à 9 mois au plus tard, et avant d’atteindre les points limites fixés dans cette étude. Nos collaborateurs ont déjà établi que les animaux avaient un phénotype à 3 mois, mais n’ont pas testé les stades avant.