Souris

Ce projet utilise des souris pour confirmer des résultats déjà obtenus sur des larves de poisson zèbre, et valider ainsi un protocole que l'équipe présente comme un futur substitut à la souris. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Nourries d'un régime riche en graisses, elles reçoivent par gavage, neuf fois en neuf semaines, un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, la dioxine TCDD, le bisphénol A, le DEHP et le carbendazime, puis subissent une prise de sang derrière l'œil, en contention ferme, juste avant leur mise à mort. Le porteur écrit qu'il est "indispensable d'utiliser des souris" pour valider ce protocole censé les remplacer.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous avons mis en place une stratégie en deux temps : d’abord un criblage de l’impact sur le foie de l’exposition chronique à des mélanges de PE dans notre modèle de larve de poisson-zèbre obèse suivi de la confirmation de ces effets dans un modèle murin pertinent. L’objectif de ce projet est donc la réalisation de la 2éme phase de confirmation des effets observés chez la larve de poisson zèbre d’un mélange de PE sur le developpement de la pathologie NAFLD chez la souris

Bénéfices attendus

Le caractère novateur de ce projet repose sur le choix du modèle pour répondre aux enjeux de la recherche sur les PE notamment dans des populations dites à risque. En effet, la larve de poisson-zèbre a de nombreux avantages : faible coût financier, mise en place rapide des processus physiopathologiques sur organisme entier, sensibilité aux agents chimiques (meilleure prédiction de l’hépatotoxicité que des modèles in vitro humain), criblage moyen/haut débit. De plus, la taille et la transparence des larves seront mises à profit pour identifier des perturbations précoces mitochondriales ou membranaires. Enfin, l’emploi de ce modèle, en accord avec la règle des 3R, peut être une alternative ou un prérequis à l’emploi des modèles in vivo de mammifères classiquement utilisés. Cette étude de faisabilité a pour but de proposer un nouveau modèle in vivo visant à mieux caractériser les effets des PE en mélange sur la progression des NAFLD et ainsi de répondre aux préoccupations concernant leurs potentiels effets cocktails. Pour cela, 4 PE ont été choisis car la population y est couramment exposée et pour garantir les chances de démontrer un effet cocktail. En effet, chacune des molécules (TCDD, BPA, DEHP et carbendazime) est reconnue pour son implication dans les NAFLD. En outre, ces molécules sont issues de familles différentes (polluants organiques persistants, plastifiants et pesticides) impliquant l’activation de mécanismes variés (activation de différents récepteurs nucléaires, stress oxydant…), ce qui pourrait ainsi potentialiser leurs effets lors de mélange. Enfin, le choix du modèle s’est porté sur la larve de poisson-zèbre, dont la sensibilité aux PE a été démontrée et pour lequel nous avons déjà mis en place un modèle développant une stéatose rapidement, et qui nous a permis de mettre en évidence qu’un mélange d’agents hépatotoxiques à faibles doses favorise la transition vers la NASH. Le premier volet de ce projet sur le modèle de larve de poisson-zèbre a été réalisé et a fait l’objet d’une saisine spécifique. Les résultats ont permis de déterminer la composition d’un mélange de ces 4 PE (TCDD, CBZ, BPA et DEHP) pour lequel on a observé une avancée de la stéatose vers la stéatohépatite pour des concentrations où chaque PE en exposition unique n’avait que peu ou pas d’effet, ce qui indique un effet cocktail de ces molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage pour maitriser l'exposition aux perturbateurs endocrniens à raison d'un traitement par semaine 9 fois (entre la 3eme semaine de régime riche en graisse et la 12eme semaine). Ils seront aussi soumis à un prelevement de sanguin par voie retro-orbitale juste avant le sacrifice.

Impact sur les animaux

Le gavage induit un inconfort des animaux, reste que la NAFLD est une pathologie indolore. Le prelevement en retroorbital necessite l'inconfort d'une contention ferme, la legère douleur qui pourrait etre associée à l'introduction de la pipette est soulagée par l'anesthesis locale.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort afin de recolter les organes pour permettre l'etude scientifique.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissu adipeux et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constitue le foie. De plus, l’altération des systèmes de communications hormonaux est le mécanisme d’action définissant l’action des perturbateurs endocriniens. Seuls les modèles in vivo présentent toutes ces interactions. Le développement d’un nouveau modèle animal pour étudier la stéatohépatite qui peut être mis en œuvre sur des temps plus court et plus éthique a été proposé par l’équipe. Il utilise les larves de poisson zèbre et a montré des premiers résultats très encourageants qui doivent être confirmés sur le modèle murin de référence pour les études de toxicologie pour valider la pertinence de ce modèle de poisson zèbre et permettre la substitution de l’utilisation des souris par ces larves de poissons.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Enfin le projet vise à confirmer chez la souris la validite de résultats obtenus dans un autre modele

Raffinement

Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux, une attention journalière à l’état des animaux sera mise en œuvre, et un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les souris seront traitées dans une pièce isolée de leurs congénères sur un temps court ne permettant pas le développement de douleur. Enfin, l’utilisation de points limites adaptés et de critères d’arrêt des souffrances ont ete déterminés et seront mis en oeuvre .

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’utilisation du modèle de poisson-zèbre pour étudier l’impact de cocktail de perturbateurs endocriniens sur la transition de la stéatose en un état pathologique, la stéatohépatite et à valider le caractère prédictif du modèle de poisson-zèbre en le comparant à un modèle murin classiquement utilisé pour l’étude des NAFLD. Il est donc indispensable d’utiliser des souris pour remplir les objectifs du projet. Adulte, pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes. Animaux âgées de 8 à 12 semaines, d’environ 20g

Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (

Sept prélèvements vaginaux au coton-tige par femelle, l'auto-administration de cocaïne, puis des rechutes provoquées par des signaux associés à la drogue, par une nouvelle injection ou par un stress : 5 184 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse de leur cerveau. Le projet teste si la progestérone protège de la rechute et quel rôle y jouent certains neurones de l'insula. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour que ces neurones puissent être ciblés. Le RNT décrit le frottis vaginal jusqu'à sa durée, dix secondes au plus, et ne précise ni la nature des chirurgies pratiquées sous anesthésie générale, ni le matériel implanté qui oblige à isoler certaines souris.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les PR sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones PR de l’insula est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne

Bénéfices attendus

Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.

Procédures

Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi par un prélèvement vaginal quotidien commençant une semaine avant le test de rechute et cela pendant 5 jours, ainsi qu’un prélèvement avant chaque test de rechute amenant à un total de 7 prélèvements par souris. Les échantillons seront collectés à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Un coton-tige par souris sera inséré dans l'orifice vaginal avec une pénétration peu profonde, tourné à 360 degrés et retiré. Un prélèvement ne dure au maximum 10 secondes par animal. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.

Impact sur les animaux

La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivitée des animaux qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme. L'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire (A. Garrard, dans Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), 2014). Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.

Raffinement

La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.

Choix des espèces

Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de tumeur cérébrale humaine leur sont implantées dans le cerveau, puis des nanoparticules sont injectées avant irradiation, certaines souris dites satellites étant tuées de façon précoce pour l'analyse des tissus. Le porteur classe l'étude en gravité modérée du fait des anesthésies et des transports répétés vers le site d'imagerie. Il affirme que le remplacement par des méthodes alternatives n'est "clairement pas possible", le développement d'une tumeur cérébrale relevant selon lui de phénomènes trop complexes.

Objectifs

ll s'agit de valider le bénéfice d'une thérapie photodynamique activée par des rayons X sur un modèle de tumeurs cérébrales orthotopiques implantées chez la souris. L'utilisation de souris satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) permettra de caractériser par histologie les effets du traitement X-PDT régulièrement après l'adminitration du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet mené en recherche préclinique permettra d'estimer si cette approche expérimentale est applicable par la suite chez l'Homme. Il permettra à long terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ce type de tumeurs cérébrales très aggressives (glioblastome) en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Xénogreffe intracérébrale : implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral (35 souris au total pour une durée d'1h environ par animal, répété une seule fois en début d'étude) Procédure 2 : Administration intra-veineuse des nanoparticules sur souris vigiles 1h avant les irradiations : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie, la technique étant parfaitement maitrisée par les membres du laboratoire (durée 1min, 19 souris concernées avec 2 réitérations)

Impact sur les animaux

Anesthésie chimique ainsi que transport sur site d'imagerie répétés d'où passage de la saisine en classe modérée.

Devenir

Procédure 1 "xénogreffe intracérébrale" (implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral) : tous les animaux sont gardés en vie (implantation tumorale étant l'étape clé indispensable du projet) Procédure 2 "administration des traitements" : tous les animaux sont gardés en vie (pour permettre par la suite d'évaluer l'efficacité des traitements) Procédure 3 "suivi par imagerie" : tous les animaux sont gardés en vie sauf si un animal a atteint un des points limites décrit précédemment, il sera dans ce cas mis à mort à l'issue de la procédure. En outre, les animaux satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) pour lesquels le temps cinétique prévu est atteint (Jn+4, Jn+11, Jn+18) seront mis à mort à l'issue de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogénèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. L’évolution de l’intensité de bioluminescence sera un indicateur d’efficacité des traitements. De plus, chaque groupe sera caractérisé par une courbe de survie. Les survies moyennes seront comparées par test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc si la différence entre tous les groupes est significative.

Réduction

Nos données nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des cellules U251 -Luc implantées en stéréotaxie (procédure chirurgicale permettant d'implanter les cellules tumorales directement dans une région bien précise du cerveau), en traitant par la voie X-PDT. Néanmoins, il est cependant nécessaire de compléter les effectifs pour avoir une meilleure fiabilité statistique mais les premiers données seront également exploitées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude. L'estimation de l'efficacité de la thérapie par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scientifique

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. De plus, une analgésie sera administrée lors des procédures invasives (chirurgie d'induction tumorale)

Choix des espèces

Souris : pour nos expérimentations, nous travaillerons sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez des rongeurs immunodéprimés. Ces modèles sont très pertinents dès lors qu'il s'agit d'évaluer de nouveaux agent diagnostiques ou thérapeutiques Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées d'une molécule pendant la gestation et après la naissance, et leurs 420 souriceaux subissent des tests respiratoires, un enregistrement de vocalisations après séparation maternelle et un test de préférence pour l'odeur maternelle, avant que tous soient tués pour prélever les cerveaux. Le porteur décrit ces tests sur les nouveau-nés comme non invasifs et peu stressants. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est nécessaire, la complexité d'un organisme ne pouvant être créée artificiellement.

Objectifs

La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Nous proposons de tester cette molécule par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et après la naissance (période prénatale et périnatale) et d’étudier ses effets sur le cerveau des souris. L’objectif de ce travail est donc de tester l’effet de cette molécule sur le nombre de neurones et les capacités comportementales des souris présentant des caractéristiques de la trisomie 21. Des tests comportementaux seront réalisés dans les 8 premiers jours de vie des souriceaux et des analyses seront réalisées sur les cerveaux afin de déterminer si le traitement est protecteur vis-à-vis des désordres neurodéveloppementaux de la trisomie 21. De plus, dans un but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons utiliser les souriceaux de ce projet pour réaliser des tests respiratoires car une forte comorbidité avec le syndrome d’apnée obstructive du sommeil est observée dans la pathologie. 40 femelles seront nécessaires pour le traitement qui sera administré durant la gestation et jusqu’à 11 jours après la naissance. Quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux. Les différentes expérimentations pourront être effectuées sur les mêmes groupes de souriceaux dans la mesure où celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses et avec un stress minimal pour l’animal.

Bénéfices attendus

Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles de comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 et d’ainsi pouvoir proposer des traitements plus spécifiques. Il permettrait également d’identifier si la molécule a un effet protecteur sur le développement du cerveau dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21. Les tests respiratoires permettront d’investiguer sur les capacités respiratoires des souriceaux et de déterminer s’ils présentent un risque précoce d’obstruction comme cela a déjà été montré dans ce modèle chez des souris adultes.

Procédures

40 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou de la molécule. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 11 jours après la naissance des souriceaux. Les 420 souriceaux issus des femelles gestantes seront utilisés pour : - Un test respiratoire dans les 12 heures suivant la naissance. Les souriceaux sont placés dans une boite étanche thermostatée pendant 15 minutes afin de mesurer des paramètres respiratoires. - L’enregistrement des vocalisations ultrasoniques le 7ème jour après la naissance pour étudier la communication vocale et les interactions sociales. Les souriceaux sont placés seuls dans une enceinte thermostatée et les ultrasons émis en réponse à la séparation maternelle sont enregistrés pendant 3 minutes. - Un test de préférence maternelle le 8ème jour pour étudier les capacités des souriceaux à identifier l’odeur maternelle, la mémoire et la préférence de cette odeur. Les souriceaux sont placés seuls dans une arène proposant 3 zones avec des odeurs différentes dont l’odeur maternelle. Le temps passé dans ces 3 zones est mesuré pendant 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les administrations aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille. Les tests qui seront réalisés chez les souriceaux sont faits de façon non-invasive. Ils durent au maximum 15 minutes et induisent peu de stress et aucune douleur à l’animal.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones et la mort neuronale. Parallèlement à cette étude au niveau neurologique qui nous permettra de montrer l’efficacité du traitement, nous analyserons des marqueurs de la fonction hépatique et de la fonction rénale sur de biopsies de tous les animaux, y compris les femelles traitées, afin de confirmer la sécurité du traitement.

Remplacement

Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types cellulaires. De plus, la réalisation de tests comportementaux et l’étude des fonctions respiratoires n’est possible que sur un animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et le résultat des valeurs. De plus, l’exploration des fonctions respiratoires réalisée en même temps que ce projet permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera amélioré par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté : une cabane ainsi que du gel enrichi en nutriments. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’administration du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Les injections seront stoppées en cas d'interruption de la gestation ou l'animal sera euthanasié si son état de santé est dégradé. Les injections journalières seront réalisées par administration sous-cutanée selon les bonnes pratiques vétérinaires. Lors de la manipulation des souriceaux, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre chaque cage de femelles gestantes. La technologie utilisée pour réaliser les tests des fonctions respiratoires et comportementaux chez les souriceaux est conçue de façon non invasive, dans des enceintes thermostatées, d’une durée n’excédant pas 15 minutes afin de réduire au maximum le stress des animaux tout en permettant les mesures.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des tests comportementaux et respiratoires sur un modèle de souris établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 11 jours après la naissance des souriceaux afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les tests comportementaux et des fonctions respiratoires seront réalisés sur des souriceaux jusqu’à 11 jours après la naissance afin d’étudier précocement l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène puis six séances d'électrostimulation du mollet sous anesthésie générale sur sept jours, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'adaptation du muscle à l'exercice. Le porteur qualifie les nuisances de modérées du fait du cumul d'injections, d'électrostimulations et d'anesthésies. Il affirme que le modèle animal est "indispensable", l'électrostimulation étant selon lui impossible à reproduire in vitro et l'analyse ne pouvant se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

Le maintien de la quantité et de la qualité du tissu musculaire strié squelettique est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à s’adapter soit à une augmentation de l’activité musculaire (exercice physique) soit à une diminution de l’activité musculaire (immobilisation, alitement prolongé). Les cellules souches musculaires (les cellules satellites) ont une contribution importante à cette capacité d’adaptation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires, processus conduisant à une accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Cette accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires dépend des propriétés énérgétiques des cellules souches et de la fibre musculaire. Ainsi, des données obtenues sur des cultures cellulaires montrent qu’une protéine X régulant les processus énergétiques des cellules favorise l’accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Il a également été démontré qu’un protocole d’exercice consistant à électrostimuler les muscles du mollet de souris saines se traduit par une augmentation du nombre de noyaux au sein des fibres musculaires. Nous avons donc pour objectif d’utiliser ce protocole d’exercice par électrostimulation afin d’étudier le rôle de la protéine X dans l’accumulation de noyaux générée par l’exercice. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules souches musculaires dans le maintien du bon fonctionnement du muscle strié squelettique et l’influence d’une protéine dont la fonction est de réguler les processus énergétiques cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant les processus énergétiques des cellules souches dans le fonctionnement du tissu musculaire.

Procédures

Chaque animal recevra une injection par jour de tamoxifène ou d’huile en intra péritonéale pendant 4 jours. Chaque animal sera ensuite soumis à 6 séances d’exercice d’électrostimulation du mollet réparties sur une période de 7 jours (i.e., 3 séances consécutives, 1 jour de repos, 3 séances consécutives). Chaque séance d’exercice d’électrostimulation sera réalisée sous anesthésie générale et durera un maximum de 20 minutes. Afin d’évaluer la progression du cycle cellulaire des cellules souches musculaires, les animaux seront supplémentés à l’aide d’un analogue de la thymidine (0,5 mg/ml repris dans une solution glucosée à 1%) administré dans l’eau de biberon 24h avant la première séance et jusqu’à la fin de la procédure expérimentale (soit pendant 8 jours consécutifs).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). L’injection de tamoxifène dans les animaux adultes n’induit pas en soi de phénotype dommageable comme montré dans des études précédentes. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables de l’administration d’EdU dans l’eau de biberon. Il a été démontré que le protocole d’exercice par électrostimulation n’induit aucune altération de la fonction et de la structure musculaire ainsi qu’aucun changement de mobilité, d’activité et de comportement des animaux. Aussi, il a été démontré que les anesthésies répétées à l’isoflurane liées au protocole d’électrostimulation n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux. Les animaux ne présentent aucun signe de prostration ou d’amaigrissement et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater normalement dès leur réveil. Enfin, aucun animal n’a dû être mis à mort du fait de la procédure d’exercice par électrostimulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’électrostimulation et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis. La taille de l’échantillon (12 animaux par condition) a été déterminée en prévoyant, à l’aide de tests statistiques adaptés, une augmentation de 15% du nombre de noyaux par fibre à l’issue du protocole d’électrostimulation chez les animaux contrôles

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale profonde lors de l’exercice d’électrostimulation. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d’invalider la protéine X soit dans la fibre musculaire, soit dans la cellule souche afin d’évaluer les impacts fonctionnels, tissulaires et cellulaires sous-jacents. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues dépourvues de microbiote, elles sont inoculées par voie orale avec des souches d'Escherichia coli dont une pathogène, puis tuées 72 heures après pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la souche pathogène peut provoquer faiblesse, diarrhée et déshydratation, les souris atteignant le point limite étant mises à mort par anticipation. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale capable de simuler un organisme constitué de plusieurs organes, comprendre ces mécanismes étant selon lui "indispensable" pour la santé publique.

Objectifs

Les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) sont des bactéries responsables d’infections humaines. Les symptômes vont de la diarrhée bénigne à la colite hémorragique et au syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3 à 5 % et plus d’1/3 des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Compendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La shigatoxine est une protéine formée de 2 sous-unités codées par les gène stxA et B. Ces 2 gènes font partie du génome d’un bactériophage (virus infectant les bactéries), qui infecte spécifiquement E. coli. Le génome du bactériophage peut s’intégrer au chromosome des bactéries infectées. On parle alors de prophage. Le plus étudié des prophages des STEC est le prophage 933W. Expérimentalement, chez la souris, une souche d’E. coli dont le chromosome porte le prophage 933W est pathogène. Á l’inverse, les STEC chez lesquelles le prophage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Les gènes stxA et B sont précédés d’une séquence d’ADN qui contrôle leur expression. Cette séquence est reconnue par la machinerie cellulaire de la souris ou de l’Homme, ce qui amène à faire l’hypothèse que l’infection se déroule ainsi : libération des prophages dans l’intestin sous l’action d’un facteur environnemental qui stresse les bactéries porteuses ; les particules virales libérées traversent la muqueuse intestinale et pénètrent dans les cellules cibles de l’organisme (ex : cellules rénales) ; la séquence d’ADN qui contrôle l’expression des gènes stxA et B est reconnue par la machinerie cellulaire ; ces gènes sont alors exprimés et la shigatoxine est produite. L’objectif du projet est de tester cette hypothèse en comparant des souris inoculées avec l’une des souches d’E. coli suivantes : C600:933W (prophage et sa séquence d’ADN contrôlant les gènes stxA et B, souche pathogène), C600:933W delta-pr1 (prophage sans la séquence de contrôle, souche non pathogène), C600 (pas de prophage, souche non pathogène).

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans l’expression des gènes stxA et stxB in vivo. L’utilisation de souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote intestinal, permettra de s’affranchir de facteurs confondants (transmission possible du prophage à d’autres souches d’E. coli présentes naturellement dans le microbiote intestinal), et de facteurs pouvant affaiblir le pouvoir pathogène de la bactérie modèle étudiée (effet « barrière » possible du microbiote intestinal). Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certaines de leurs manifestations cliniques. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5 %) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique de ces bactéries pathogènes, en particulier lors d’infection par les denrées alimentaires. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant.

Procédures

En début de procédure, les animaux sont soumis à un jeûne hydrique de 4 heures, suivie d'une unique inoculation par voie orale. Puis deux prélèvements de fèces à 24 h d’intervalle après l’inoculation sont réalisés. La procédure s’arrêtera 72 h après l’inoculation. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique ayant une action puissante sur les douleurs viscérales. Une heure plus tard, ils seront profondément anesthésiés à l’isoflurane (dose létale). La paroi abdominale sera incisée, une ponction de la veine cave (située dans l’abdomen) sera faite pour prélever du sang, puis une perfusion intra-cardiaque sera faite pour éliminer le sang restant dans le système circulatoire afin de pouvoir prélever des tissus sans trace de sang, condition nécessaire pour des analyses histochimiques de bonne qualité. L'ensemble de cette procédure durera entre 5 et 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant la souche C600 ou la souche C600:933W delta-pr1 sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation orale avec 150 µL de culture bactérienne. D’une part, ces souches ne sont pas pathogènes. D’autre part, l’inoculation sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les nuisances attendues dans le groupe recevant la souche pathogène C600:933W sont l’expression d’un syndrome infectieux : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures et des points limites seront mis en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition du syndrome infectieux. Fréquence de surveillance accrue aux premiers signes cliniques, et mise à mort anticipée si les symptômes atteignent le point limite indiqué dans la procédure expérimentale. Les souris sont mises à mort au plus tard 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme. Pendant toute la durée de l’expérience, les souris seront maintenues en groupes sociaux de 3 individus, dans un environnement enrichi ; de l’eau stérile, des croquettes de nourriture stérile de formulation standard et de l’aliment gélifié stérile de formulation standard seront mis à leur disposition à volonté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus dans lesquels seront pratiquées des analyses destinées à étudier l’effet de la production de shigatoxine par la souche d’Escherichia coli introduite dans le tube digestif des souris.Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience de nos partenaires argentins dans le domaine étudié permet de considérer que 6 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 6 souris par groupe dans les deux groupes témoins. Dans le groupe inoculé avec la souche pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si la mise à mort est très anticipée par rapport à la date prévue pour mettre à mort toutes les souris, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 6 souris supplémentaires dans ce groupe, qui seront utilisées si nécessaire. Le protocole comportera donc 3 groupes de 6 souris, plus 6 souris supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 24 animaux.

Raffinement

Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 3 individus par cage, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement disposé les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard (gel diet) seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue induites par un syndrome infectieux (possible dans le groupe inoculé avec la souche pathogène C600:933W). De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté par voir sous-cutanée aux souris si elles montrent des signes de déshydratation (1 ml par injection, 3 fois par jour). Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite les premiers signes d’un syndrome infectieux et décider d’une mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. L’inoculation orale des souris avec les souches bactériennes sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Préalablement à la mise à mort des souris, au cours de laquelle une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque seront réalisées, un analgésique sera administré par voie parentérale (flunixine ; 2,5 mg/kg ; puissante action analgésique sur les douleurs viscérales).

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris (semaine suivant le sevrage). Chez l’Homme, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants.

59 840 animaux non-humains, en majorité des souris et des rats mais aussi des cochons d'Inde, des hamsters dorés et des gerbilles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent sur 28 jours maximum des administrations répétées de composés candidats médicaments à doses élevées, avec des prélèvements de sang, pour détecter précocement une toxicité. Le porteur indique que la recherche de doses toxiques ou maximales tolérées peut provoquer inconfort, stress, dommages réversibles voire irréversibles et douleur. Il reconnaît que des tests in vitro remplacent déjà des animaux mais affirme qu'il n'existe pas de test couvrant l'ensemble des systèmes biologiques, et cale le nombre d'animaux sur les normes ICH et OCDE.

Objectifs

Le projet a pour objectif : • d’étudier les putatifs mécanismes de toxicité liée à l’administration de la molécule d’intérêt. La détection précoce de toxicité permet d’arrêter le développement d’une molécule avant des études de toxicologie règlementaires couteuses d’un point de vue éthique et économique. Ces effets toxiques pourront être reliés à la concentration circulante du candidat médicament administré grâce à des données de toxicocinétique générées en parallèle. • de déterminer dans le cas de toxicité des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en associant des méthodes d’analyses ex vivo de génomique, protéomique ou métabolomique

Bénéfices attendus

Le projet vise à détecter très tôt dans le développement de effets de toxicité d'un composés test ce qui obligatoirment impliquerait l'arrêt du développement d’une molécule avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet

Procédures

Les animaux subissent des adminsitrations uniques voire répétées sur 28 jours maximum de composé d'intérêt à des doses élévées afin d'identifier des effets secondaires susceptibles d'être observés chez l'homme. Pour les voies d'administration contraignantes, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou souffrance inutile. Des prélèvements de sang sur animaux vigiles ou anesthésié sont également effectués pour mesurer les concentrations du composés d'intérêt dans le sang ou les tissus pour évaluer l'exposition des animaux au composé ou suivre un biomarqueur qui réflète l'évolution de lésions. Le maximum d'administrations quotidienne est de 4 et ceux pendant 28 jours maximum. La durée de ces administrations vont de quelques secondes pour une voie orale à moins d'une heure pour les perfusions longue durée sur animal contraint et à plus d'une heure pour des animaux libre de leurs mouvements. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélevé sur une semaine qui doit être infèrieur à 10% du volume de sang total. La durée de ces prélèvements n'excèdent pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

La recherche de dose toxiques ou de doses maximales tolérées occasionne de l'inconfort, du stress, des dommages réversibles voire irréversibles et potentiellement de la douleur chez les animaux. Les administrations et les prélèvements répétées de sang sur animal vigile vont également générer du de l'inconfort et du stress sachant que si la voies d'adminsitration ou de prélèvements est jugées douloureuse ou dangereuse pour l'animal ou l'opérateur , l'animal est systématiquement anesthésié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d'étude

Remplacement

De nombreux test in vitro de toxicité remplacent déjà les animaux. Il s'agit de tests orientés sur un organes. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques

Réduction

Le nombre d'animaux est défini par les recommandations internationales comme les normes ICH, OCDE

Raffinement

L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention sont limitées (

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ex. ICH, CHMP, OECD, WHO, FDA, MHLW) et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux nouveau-nés pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dès l'âge de sept à dix jours une amputation d'orteil pour le génotypage, puis plusieurs séries d'injections et, pour une partie, un jeûne de vingt-quatre heures, dans un modèle génétique d'atrophie musculaire. Les souris sont mises à mort après les injections pour prélever les muscles et les organes. Le porteur affirme que l'analyse de la dégradation des protéines musculaires ne peut se faire sur cultures cellulaires et que le modèle souris est "essentiel".

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’ atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections intrapéritonéales d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Pour valider ces résultats, il est nécessaire d'effectuer une exploration fonctionnelle du flux de dégradation des protéines chez l'animal. Une accélération du flux de dégradation des protéines comme un blocage de ce flux sont délétères pour le fonctionnement du muscle, car conduisant respectivement à une dégradation accrue des protéines musculaires et à la persistance de composants cellulaires endommagés. Cette évaluation nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Cette évaluation sera effectuée sur les animaux en condition normale nourrie et aussi après induction du processus de dégradation des protéines par un jeûne de 24 heures. La durée de 24heures de jeûne est requise pour activer et détecter une augmentation de la dégradation des protéines dans le muscle d'animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Ces résultats permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la perte de masse musculaire, essentielle pour le développement de traitements efficaces et qui représentent un réel enjeu clinique. Ces expériences complémentaires permettront de finaliser la caractérisation des altérations musculaires générées par notre mutation, responsable de l’activation d’une signalisation d’atrophie dans le muscle. Ces résultats seront valorisés par une publication scientifique et sont essentiels pour comprendre et anticiper les conséquences de la modulation de cette signalisation sur la physiologie musculaire chez les patients. Cette caractérisation est par ailleurs nécessaire pour tester dans un second temps le bénéfice de la modulation des processus dérégulés sur la limitation de la perte et de la dysfonction musculaire. Ainsi en fonction des résultats obtenus, les données seront essentielles pour déterminer s’il est préférable de développer une approche pour limiter la dégradation des protéines par le processus autophagique dans les muscles de ce modèle ou s’il est préférable de mettre au point des stratégies permettant de restaurer le processus autophagique, afin de prévenir l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés responsables d’une altération de la fonction musculaire, comme c’est observé au cours du vieillissement musculaire.

Procédures

Tous les animaux subiront une phalengectomie entre l’âge de 7 jours et 10 jours, nécessaire à l’identification et au génotypage et justifié d'un point de vue scientifique pour les objectifs du projet. Tous les animaux recevront 4 injections intrapéritonéales consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, soit 1 semaine soit 4 semaines après ces injections, tous les animaux recevront 3 injections intraperitonéales, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux concernés par la procédure 2 seront soumis à un jeûne de 24 heures en parallèle des dernières injections.

Impact sur les animaux

Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Il ne présente pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Nos expériences seront réalisées au plus tard 4 semaines après l’induction de l’activation du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 2 jours après les injections de l'inhibiteur. Cette évaluation sera effectuée sur les animaux en condition normale nourrie et aussi après induction du processus de dégradation des protéines par un jeûne de 24 heures. La durée de 24heures de jeûne est requise pour activer et détecter une augmentation de la dégradation des protéines dans le muscle d'animaux contrôles.

Devenir

Les animaux seront mis à mort, les muscles et autres organes seront prélevés pour des analyses expérimentales.

Remplacement

L'analyse du flux de dégradation des protéines dans le muscle de notre modèle animal ne peut être effectuée sur des cultures de celllules. Le modèle murin est essentiel pour étudier fonctionnellement le muscle et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le reste de l’organisme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animal minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Les analyses en condition de jeûne (procédure 2) ne seront pas effectuées si les résultats obtenus en procédure 1 montrent des défauts autophagiques en condition basale nourri et sont suffisants pour conclure. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 8 animaux par groupe seront privilégiés. Des tests de comparaisons de moyennes (test-t) ou de rang (non-paramétrique) seront utilisés pour comparer deux groupes, des tests ANOVA ou Kruskall-Wallis (non-paramétrique) seront effectués pour les comparaisons multiples (groupes controles/mutants, traités colchicine ou non-traités, nourris/à jeun). Le personnel est formé à ces analyses. Nous souhaitons pouvoir étendre nos groupes à 12 animaux pour prévenir une potentielle hétérogénéité provenant de la réponse à la colchicine. Une adjonction progressive d'animaux supplémentaires sera envisagée jusque 12 animaux par groupes en s'appuyant sur une évaluation statistique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés une fois par semaine et ensuite quotidiennement lors des injections d’inhibiteur autophagique et la mise à jeun. Aliment et eau gélifiée seront mis à disposition sur le sol de la cage en cas de diminution de la mobilité observée. La durée du jeûne pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés grâce à la stratégie cre/lox. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation de notre signalisation d'intéret, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction de notre transgène par injection de tamoxifène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. Les injections d'inhibiteur de l'autophagie seront effectuées soit 1 semaine après les injections de tamoxifène (animaux de 11 semaines) soit 4 semaines après ajout de tamoxifène (animaux de 15 semaines). L'étude de ces deux stades 1 semaine et 4 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par nos résultats expérimentaux préalables suggérant une activation de l'autophagie au début de l'atrophie du muscle et ensuite un blocage qui conduirait à l'accumulation de mitochondries endommagées dans les fibres musculaires.