Souris
Effet d’une thérapie ciblée dans des modèles murins de sarcomes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes greffées de tumeurs humaines de sarcome, elles reçoivent deux injections par semaine d'anticorps ciblés et de chimiothérapie pendant tout le suivi tumoral, avec des nécroses de tumeur en surface et une cachexie possible menant à la mise à mort. Le porteur affirme que la diversité cellulaire des sarcomes ne se retrouve pas en culture mais seulement dans les greffes chez la souris. Il écarte d'autres modèles comme le poisson zèbre au motif que les schémas d'administration y sont moins standardisés.
Objectifs
Les sarcomes constituent une maladie rare qui touche environ 1000 personnes par an en France. Ils affectent majoritairement les sujets jeunes et présentent un profil métastatique et un taux de récurrence élevé, conduisant à un pronostic réservé . Actuellement les patients sont traités par amputation additionnée de chimiothérapie et/ou radiothérapie. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de sarcomes dans des modèles humains greffés chez la souris. Les expérimentateurs en charge des animaux sont expérimentés dans la mise en œuvre des modèles animaux présents dans les 3 différentes procédures.
Bénéfices attendus
L'hypothèse de ce travail est que la cible thérapeutique étudiée joue un rôle dans le développement des sarcomes. Ceci est basé sur l'évaluation de l'expression de la protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles murins. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces sarcomes avec la thérapie ciblée est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Injections sous-cutannées de lignées cellulaires (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL ou 200µL. Injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral) et/ou chimiothérapies (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral).
Impact sur les animaux
Dans les trois procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les individus concernés seront mis à mort.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe.
Remplacement
Les sarcomes nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires mais uniquement dans les greffes chez la souris.
Réduction
Procédure 1) Un nombre de 5 souris par condition, selon 3 différentes conditions de greffe, est suffisant pour évaluer la prise de greffe des différentes lignées cellulaires. Les souris seront greffées dans chaque flanc pour réduire le nombre d’individus nécessaires. Ces expérimentations seront réalisées sur les six lignées cellulaires. Procédure 2) Les lignées ne montrant pas de prise tumorale en procédure 1 ne seront pas utilisées en procédure 2 et 3 conduisant à une réduction. D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 10 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales combinés au fait que nous ne connaissons pas encore l'efficacité de prise de ces modèles, nous envisageons des lots de 45 souris par expérience de manière à pouvoir répartir au moins 10 souris par groupe de traitement (retrait des 5 tumeurs n’ayant pas pris et/ou de trop grosses tumeurs à l’inclusion). Procédure 3) Une fois l’efficacité anti-tumorale déterminée, nous nous intéresserons aux mécanismes d’action de notre thérapie dans les temps précoces du traitement. La procédure 2 sera donc répétée pour les lignées montrant une efficacité anti-tumorale mais avec une mise à mort plus précoce (environ 500mm3) des animaux pour réaliser des analyses biologiques. Des expériences in vitro seront menées sur les lignées pour déterminer leur sensibilité aux agents de chimio thérapie. Ces résultats conditionneront le maintien ou non des conditions de traitement avec ces agents dans les procédures 2 et 3, pouvant ainsi conduire à une réduction. Les traitements seuls ou associés ne montrant pas d’efficacité anti-tumorale dans la procédure 2 ne seront pas utilisés en procédure 3, conduisant également à une réduction. Des statistiques adaptées seront utilisées.
Raffinement
Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 à 3 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, cachexie, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 à 3 fois par semaine.
Choix des espèces
La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l'activité anti-tumorale de la thérapie ciblée étudiée. La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu humain pour éviter les rejets tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. La cible thérapeutique étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèce. On retrouve une forte homologie entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, les outils destinés à l'analyse des tissus post mortem n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi.
Étude des interactions entre un exercice physique pré- administration de l’immuno-chimiothérapie sur la croissance tumorale et le muscle squelettique dans un modèle pré- clinique de cancer colorectal chez la souris. EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, puis un gavage cinq jours sur sept et des injections d'immuno-chimiothérapie, tout en étant contraintes de courir sur un tapis, pour tester si l'exercice améliore l'effet des traitements. Le porteur reconnaît que le gavage répété est stressant et que des ulcérations ou une tumeur trop grosse conduisent à la mise à mort. Il affirme n'avoir aucune autre possibilité que d'utiliser un "organisme entier".
Objectifs
Nous savons que réaliser de l’activité physique (AP) diminue la mortalité induite par différents types de cancer chez l’Homme. Cela a été montre dans des études chez l’humain et chez l’animal. Cependant, nous ne comprenons pas vraiment comment l’exercice agit pour diminuer la croissance de la tumeur. Notre projet chez la souris est associé à notre projet chez l’homme ou nous souhaitons voir si un exercice physique juste avant la prise des traitements anti-cancéreux améliorerait l’efficacité de ces traitements. Chez l’homme, nous ne pouvons pas souvent récupérer les tumeurs chez des patients en stade avances car il y a trop de risques pour les patients. Nous avons donc besoin de développer d’autres modèles pour étudier les effets sur la tumeur elle-même. L’exercice physique pourrait modifier la réaction du système immunitaire ou le nombre de vaisseaux sanguins sur la tumeur (vascularisation) et ainsi rendre la tumeur plus sensible aux traitements. Secondairement, nous savons que le cancer ainsi que les traitements contre cette maladie peuvent engendrer des effets secondaires. En particulier, il existe une fonte musculaire et une altération de leur fonctionnement. Cela diminue la qualité de vie des patients et serait synonyme d’un moins bon pronostic. Ainsi faire réaliser des exercices physiques aux patients permettraient de maintenir leur masse musculaire et améliorer les effets des traitements. Notre projet vise donc à étudier les effets d’un exercice physique aigu pré- traitements sur 1) le développement de la tumeur dans un modèle de cancer chez la souris ; 2) la fonte musculaire induite dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Le développement de la recherche dans le domaine de l'exercice appliqué à l’oncologie a permis de constituer une base de données importante sur le rôle de l’exercice physique dans la prévention et la gestion des effets indésirables du cancer. Néanmoins, il est essentiel de comprendre comment l'exercice diminue la progression tumorale. Sur le plan scientifique, ce projet permettra donc d’apporter des nouvelles données scientifiques sur les interactions entre l’exercice physique et les traitements anticancéreux des patients ainsi que les mécanismes potentiels par lesquels l’exercice physique pré-administration de l’immunochimiothérapie pourrait potentialiser l’efficacité des traitements. Aujourd’hui pour des questions de réduction de technique invasive chez les patients, de moins en moins de biopsie de la tumeur sont réalisées ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle murin à visée scientifique pour comprendre l’interaction biologique et moléculaire entre un exercice physique réalisé juste avant l’injection des traitements et le microenvironnement tumoral. Ce modèle nous permet donc d’accéder aux tumeurs et d’évaluer l’effet de l’exercice sur la taille de tumeur, les mécanismes immunitaire et vasculaire sous-jacent ainsi que le muscle squelettique. Grâce à cette étude nous pourrons rapidement apporter de précieuses données sur les interactions entre exercice et cancer. Sur le plan clinique, les mécanismes mis en évidence au cours de cette étude permettront d’envisager des essais cliniques futurs grandes ampleurs étudiant plus spécifiquement les effets de ce type d’intervention combiné sur le développement tumoral et la cachexie musculaire associée au cancer, deux paramètres majeurs dans la survie des patients. Ces résultats permettront ensuite de concevoir des essais cliniques plus poussées afin de déterminer et affiner la prescription de la dose d’exercice (durée, intensité, modalités) à utiliser en combinaison à un traitement anti-cancéreux. Ces différentes études permettront d’améliorer la prise en charge des patients et l’efficacité de la thérapie.
Procédures
Les animaux utilises dans ce projet seront tout d’abord soumis à une seule injection sous la peau au niveau du flan gauche de cellules capables de former une tumeur. Après avoir attendu quelques jours pour que la tumeur se forme, les animaux commenceront leurs traitements bases sur une immuno et chimiothérapie. Certains des animaux ne seront pas injectes avec des cellules tumorales et ne développeront pas de tumeurs. Ceux-ci correspondront aux groupes Non-Tumoraux (NT). Pour cela, les animaux recevront une fois par semaine une injection au niveau du ventre pour atteindre les organes (intrapéritonéale) ainsi qu’un gavage (insertion d’une sonde dans l’œsophage) quatre jours sur cinq pour recevoir la totalité des traitements. Une partie des animaux eux ne recevront pas le traitement mais un placebo. Au moment du début des traitements, les animaux commenceront de réaliser de l’exercice physique. Le premier exercice sera réalisé avant même l’injection des tumeurs pour établir le niveau de d’endurance physique des animaux grâce a un test de vitesse maximal de course (VMC) qui permettra d’adapter les exercices suivants. Ces derniers seront réalisés juste avant les traitements anti-cancéreux quatre jours sur cinq et dureront 50 minutes à une vitesse correspondant a 60% de la VMC. Ensuite une partie des animaux, seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs après quatre jours de traitement et/ou d’exercice. L’autre partie des animaux poursuivra le protocole (traitement + exercice) jusqu’à 30 jours. A la fin du protocole, une partie des animaux sera utilise pour évaluer si l’exercice a modifie la vascularisation des tumeurs, c’est-à-dire savoir si l’exercice a permis que la tumeur soit plus perfusée et reçoive plus de traitement. Pour cela, les animaux recevront une molécule capable de visualiser les zones qui ont une diminution de leur taux d’oxygène (hypoxie) qui est une caractéristique des tumeurs agressives. Après cette injection, soient les animaux resteront au repos soient ils seront mis à l’exercice, puis mis à mort pour récupérer les tumeurs. Une autre partie des animaux, sera utilise pour voir si la croissance tumorale et les traitements ont un impact négatif sur les muscles et étudier les mécanismes mis en jeu. Pour cela, nous testerons la capacite des souris à réaliser une contraction musculaire. Puis, les animaux seront mis a mort et les muscles récupérés pour être étudiés.
Impact sur les animaux
Le modèle de tumeur sous la peau ne présente pas de métastases ni d’atteintes musculaires trop importantes. De plus, la localisation sous-cutanée de l’implantation de la tumeur permet de minimiser les douleurs associées à la croissance tumorale de par l’espace disponible et l’élasticité de la peau. La douleur ou gêne occasionnée lors de celle-ci sera néanmoins surveillée, en particulier si les animaux en évaluant une possible gêne à se mouvoir ou a se nourrir. Il est possible que les animaux présentent une plaie au niveau de la tumeur et dans ce cas les animaux touches seront mis à mort dans les plus brefs délais pour arrêter leur souffrance. De même si la croissance tumorale est trop importante et que la tumeur atteint une taille trop importante, les animaux seront sacrifiés. Les intensités d’exercice sont modérées et se rapprochent des intensités utilisées chez des patients atteints de pathologies chroniques. Elles sont donc connues pour induire des adaptations physiologiques bénéfiques sans effets négatifs chez l’homme comme chez la souris. Les différents traitements utilisés au cours de ce protocole ont déjà été validés au cours d’études précédentes et permettent une réduction du volume tumoral tout en minimisant la toxicité liée au traitement. Les traitements sont administrés par gavage ou injection dans le ventre. Les animaux seront donc exposés au stress induit par la contention et à la douleur de la manipulation. Ces gestes seront de très courte durée pour minimiser l’impact négatif sur les animaux. Ces procédures ont été choisies car utilisées dans le modèle tumoral utilise et déjà valide et n’ont pas été modifié pour ne pas changer l’efficacité des traitements. Le gavage 5 jours sur 7 est reconnu comme stressant. L’injection IP altère les tissus autour de la zone d’injection mais celle-ci n’ayant lieu qu’une fois par semaine, cela limitera les effets délétères de ce geste. La mesure de la force chez l’animal est réalisée sous anesthésie générale afin de ne pas induire de stress chez l’animal. Les contractions des muscles induites lors du test n’entraînent pas d’altérations de la fonction et de l’intégrité du muscle squelettique (i.e. crampe et/ou déchirement musculaire).
Devenir
Les animaux seront mis à mort après l’expérimentation car l’utilisation des muscles et de la tumeur sont nécessaires pour répondre aux questions émises dans le projet.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier les interactions complexes des traitements combinés immuno/chimiothérapie et de l’exercice physique au sein de la tumeur et le rôle joue par le système immunitaire. De plus le second objectif est d’évaluer l’altération des muscles induits par ces différentes interventions. Nous n’avons donc aucune autre possibilité que d’utiliser un organisme entier. Toutes les découvertes faites lors de ce projet feront ensuite l’objet d’approfondissement dans des modèles de cellules n’utilisant pas d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos expériences passées pour mettre en évidence des différences en utilisant le minimum d’animaux. Dès lors que nous obtiendrons des différences entre nos conditions, nous arrêterons les expérimentations chez l’animal afin de maintenir le nombre d’animaux utilises au strict minimum.
Raffinement
Nous veillerons à améliorer au mieux les conditions d’hébergement des animaux en leur donnant accès a des zones cachées pour s’isoler, des jeux et en favorisant les interactions entre les animaux. Si leur condition physique rend difficile leur accès a la nourriture ou à l’eau en hauteur, nous adapterons leur environnement en leur mettant a disposition eau et nourriture au sol. Pour être sûr que la croissance tumorale reste acceptable pour l’animal, nous surveilleront le développement de la tumeur et mettrons a mort les animaux si la tumeur devient trop grosse. Nous surveillerons aussi le poids des animaux pour veiller à ce qu’ils ne subissent pas une perte de poids trop importante et synonyme de leur souffrance. Dans le cas d’une trop forte perte de poids, les animaux concernes seront mis à mort. Le protocole d’exercice physique est d’intensité modérée (60% des capacités maximales). A la suite du test de vitesse maximale de course, la récupération des souris sera vérifiée par observation de leur capacite à bouger le jour de l’intervention et le suivant avec un intervalles de 2h entre deux observations. Les différentes procédures peuvent induire du stress et nous veillerons donc à adapter au mieux nos manipulations pour limiter les actes stressants. Par exemple, nous limiterons le nombre de fois où nous toucherons les animaux en réalisant au même moment la mesure de la taille de la tumeur et les injections des traitements anti-cancéreux ; ou lors du transfert des cages au tapis de course et inversement ou nous pouvons les transférer sans les toucher avec l’aide d’une petite boite. Normalement le modèle ne devrait pas induire de douleur particulière sauf lors de l’atteinte d’un point limite (ulcération ou taille tumorale trop importante) menant à la mise à mort des animaux. Cependant, dans le cas où il semble que les animaux souffrent, nous prendrons contact avec le vétérinaire réfèrent pour évaluer les possibilités d’utiliser des médicaments pour réduire la douleur.
Choix des espèces
Le modèle de cancer sous la peau et les traitements anti-cancéreux que nous utilisons ont été valides préalablement sur les souris. Ces animaux sont très souvent utilisés dans les études en cancérologie ou dans les études portant sur l’exercice physique. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats nouveaux sans avoir à répéter des expériences déjà réalisées avant (nous limitons donc le nombre d’animaux ainsi que les procédures subites par ces animaux). De plus, les outils techniques dont nous avons besoin pour répondre aux questions ont bien été valides chez l’animal augmentant la probabilité d’obtenir de nombreux résultats en utilisant un minimum d’animaux. L’âge des animaux a été déterminé par des études précédentes qui ont valide le modèle que nous utilisons. Nous savons qu’a cet âge, nous obtiendrons un développement de la tumeur suffisant pour répondre à notre question. A cet âge, les animaux ont une fonction musculaire bonne qui permet de diminuer le nombre d’animaux ne voulant pas courir (pourcentage augmentant avec l’âge). Ainsi, a ce stade nous pouvons répondre aux différents questionnements du projet.
Vaccination et tests d’antiviraux contre le Métapneumovirus humain
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le métapneumovirus humain par voie nasale, puis reçoivent des vaccins ou des antiviraux, l'infection provoquant une perte de poids importante et une prostration avant euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur écarte tout analgésique au motif qu'il modifierait la réponse immunitaire, et s'appuie sur un suivi clinique pour euthanasier les animaux atteints. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de valider une approche vaccinale contre ce virus.
Objectifs
Nos expérimentations reposent sur l’expertise acquise par l’équipe concernant des approches similaires mises au point pour lutter contre l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS). La stratégie de vaccin inerte contre le VRS a fait l’objet de 2 brevets et de financements. La stratégie de vaccin vivant atténué fait l’objet d’un financement ANR. Différents antiviraux ont montré un potentiel inhibiteur sur la réplication du VRS en culture cellulaire ainsi qu’in vivo chez la souris. Etant données les fortes homologies entre VRS et HMPV, des antiviraux actifs contre ces 2 virus ou spécifiques du HMPV sont en cours d’étude. Etant données les fortes homologies entre VRS et le métapneumovirus humain (HMPV), des antiviraux actifs contre ces 2 virus ou spécifiques du HMPV sont en cours d’étude. Les objectifs du projet sont de i/ caractériser les réponses immunitaires induites par ces différents vaccins (production d’anticorps protecteurs, inflammation), et ii/ valider l’efficacité de la vaccination contre les infections par le HMPV.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour aucun vaccin ni traitement pour lutter contre les infections par le Meétapneumovirus. Ces projets visent à identifier des vaccins permettant d'induire une réponse immunitaire efficace chez l'hôte et/ou des molécules antivirales actives in vivo. Ces données constituent un préalable afin d'envisager des tests pré-cliniques de potentiels vaccins ou antiviraux.
Procédures
Les animaux réceptionnés à l'animalerie seront marqués à l'oreille. Nos protocoles consistent à infecter les animaux par le HMPV et adiministrer des traitements (vaccins ou antiviraux). Les animaux seront infectés par administration de 50 µl de virus par voie intranasale. Dans le cadre des essais de vaccins, ceux-ci pourront être administrés par voie intranasale, ou sous-cutanée, ou intrapéritonéale. En cours de protocole (J0, J15, J30 et J34), un prélèvement de sang par ponction à la joue sera réalisé. Les protocles de vaccination pourront durer de 30 à 65 jours. Dans le cadre de l'administration d'antiviraux, ceux-ci pourront être administrés par voie intranasale, intrapéritonéale ou gavage, 2 administrations quotidiennes seront considérées en fonction de la demi-vie des composés. Les traitements seront réalisés sous anesthésie (kétamine (50mg/kg)/xylazine (10 mg/kg), ou isofluorane). La durée des protocoles visant à tester l'activité antivirale de composés sera comprise entre 5 et 8 jours. Une contention des animaux sera réalisée lors de l'anesthésie ainsi que lors des traitements. D'autre part, un suivi quotidien des animaux sera réalisé, nécessitant la pesée des animaux. En fin de protocole, une dislocation cervicale sur animaux anesthésiés sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’infection par le HMPV induit rarement la mort de l’animal mais peut induire une souffrance chez l’animal. La sévérité des symptômes peut varier en fonction de la souche virale et la dose de virus inoculée. Le principal signe clinique est une perte de poids importante, ainsi qu’une modification du pelage et du comportement (prostration)
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale, des prélèvements devant êtres réalisées sur les animaux en fin de protocole. En fin de protocole de vaccination sont prévus un prélèvement final de sang et lavage broncho alvéolaire après euthanasie. Lors de test d'antiviraux, des prélèvement d'organes (poumons, rate, foie, vessie, rein cerveau) seront effectués en fin de protocole afin de valider l'inocuité des molécules (analyse histopathologique).
Remplacement
Il n’existe pour l’instant aucun test in vitro pour valider l’efficacité et la qualité d’une approche vaccinale contre le HMPV. Il est également nécessaire de valider in vivo l’efficacité de traitements antiviraux préalablement testés in vitro sur cellules infectées, ces systèmes simplifiés ne permettant pas de déterminer leur potentielle efficacité et innocuité à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Nous utiliserons des virus luminescents permettant le suivi de l’infection chez un même individu sur plusieurs jours. Des doses de virus permettant de quantifier l’infection in vivo tout en limitant la sévérité des symptômes liés à l’infection seront administrées. Des pré-tests seront réalisés sur cellules afin d’évaluer l’efficacité et l’absence de toxicité des molécules antivirales, limitant le nombre de composés présentant un potentiel intérêt. L’analyse de nos résultats reposera sur des tests statistiques non paramétriques Mann-Withney. La puissance du test est fixée à 80% avec un risque fixé de 5%. Le nombre d’animaux estimé pour répondre à ces contraintes statistiques est de 10 animaux par groupe de traitement.
Raffinement
Les animaux seront eleves dans une animalerie ventilée à température et luminosité contrôlées, avec accès à volonté à eau et nourriture. Des morceaux de bois et une feuille de cellulose pour la nidification seront ajoutés pour enrichir le milieu. La vaccination par voie intranasale, sous-cutanée ou intra-péritonéale n’entraine à priori pas de souffrance visible des animaux. De même, l’administration de composés antiviraux par voie intranasale, intrapéritonéale ou gavage n’entraine pas de souffrance dans la mesure où des doses non toxiques de composés sont utilisées. Toutefois, pour toute manipulation pouvant entrainer un stress ou une souffrance de l’animal (administration intranasale, prélèvements), les animaux seront anesthésiés (injection intrapéritonéale de mélange kétamine (50 mg/kg) / xylazine (10 mg/kg) ou anesthésie gazeuse par isofluorane). Nos protocoles ne permettent pas l’utilisation d’analgésique qui peut induire une modification des réponses de l’hôte lors de l’infection. Certaines souris pouvant s’avérer sensibles aux traitements ainsi qu’à l’infection par HMPV, un suivi quotidien des souris sera donc réalisé. La sévérité des symptômes sera évaluée par analyse des signes cliniques en utilisant une grille de scores spécifique (poids, comportement, apparence poils). En cas d’apparition de signes cliniques significatifs, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris Balb/c est un bon modèle pour étudier la vaccination contre le HMPV, car ce virus peut se multiplier dans les poumons des souris. De plus, l’infection par le HMPV induit chez les animaux une pathologie similaire à celle observée chez l’homme et constitue un modèle d’étude privilégié pour l’étude de l’efficacité d’antiviraux. Enfin, les souris Balb/c permettent la détection de luminescence et par conséquent le suivi de l’infection avec des virus luminescents, sur animal vivant. Les animaux utilisés au cours de ces procédures seront adultes (8-10 semaines). Ce stade de développement est le plus utilisé dans la littérature, ce qui permettra de comparer nos résultats aux données publiées dans la littérature.
Mise en place d’un modèle de souris à auto anticorps anti tPA
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales et subissent deux tests de saignement passant par une section de l'extrémité de la queue, pour créer un modèle d'auto-anticorps dirigés contre une protéine de la coagulation. La mise à mort sert à récupérer la totalité du sang et les organes pour doser ces anticorps. Le porteur affirme que ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris et qu'aucun modèle fiable n'existe chez des espèces jugées moins sensibles.
Objectifs
La présence d’auto-anticorps dirigé contre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) a était historiquement décrit dans les lupus Erythematosus. Même si dans ces études il a était démontré que ces anticorps étaient dirigés contre le domaine catalytique, les techniques de l’époque n’ont pas permis de mettre en évidence un impact des anticorps sur les fonctions du tPA. D’autres études ont aussi montré la présence de ces autoanticorps dans le syndrome des antiphospholipides, une étude en particulier suggère que ces anticorps pourraient éventuellement inhiber l’activité du tPA et augmenterait ainsi le risque de thrombose. De façons plus intéressante, les travaux de Massimo Cugno et collaborateurs en 2010 ont montré que la thrombolyse de patients atteints d’infarctus du myocarde induit une réaction immunitaire qui amène à la production importante d’anticorps anti tPA. Les auteurs proposent ici que ces anticorps diminueraient les fonctions du tPA endogène à moyen terme. Dans ce contexte, au sein de notre laboratoire, nous avons développé un outil original permettant d’évaluer la quantité d’anticorps anti tPA circulant. Nous avons ainsi mis en évidence la présence de ces anticorps dans le plasma de 80 individus ayant donné leurs sangs à l’établissement français du sang. Ces résultats montrent des niveaux très hétérogènes et démontrent que certains individus présentent des taux très supérieurs. Nous avons aussi démontré un impact de ces auto anticorps sur certaines fonctions du tPA. Afin de mieux comprendre le rôle de ces auto anticorps nous avons aujourd’hui besoin de mettre en place un modèle chez la souris. Ce modèle reposerait sur l’immunisation active de souris c57b6 et de souris c57b6 tPA ko (souris tPA NULL).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la création d'un modèle original permettant de comprendre les fonctions de ces auto anticorps et de leur impact sur l’hémostase.
Procédures
- quatre injections intrapéritoneales (duree 5 min chacune) - deux tests de saignement (30 min chacun)
Impact sur les animaux
Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite des injections. Nous pouvons néanmoins nous attendre à du stresse lors de la manipulation de la contention, d’où l’importance de réaliser une habituation préalablement. Une réponse à l'immunisation est attendu avec une augmentation modérée de la température de l'animal. Par ailleurs dans nos expérimentations précédentes, les animaux ayant subi une section de l'extrémité de la queue n'ont pas présenté de signe de douleur ni de souffrance.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin d'évaluer la présence des auto anticorps dans le sang et dans les différents organes. Par ailleurs les études sur l'activité et la quantité de tPA circulant nécessite la totalité du sang de l'animal.
Remplacement
Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 56 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques c57b6 WT et c57b6 tPA Null. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris tPA WT et tPA Null utilisées dans cette étude seront commandées à l'age de 8 semaines, à la fin de l'expérimentation les animaux seront âgés donc de 16 semaines correspondant à un stade jeune adulte (4 mois). Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation.
Étude de la réponse immunitaire à l’infection, au cancer et aux immunothérapies dans les voies urinaires à l’aide de modèles de souris 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système urogénital
4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. La description des procédures reste très générale et le porteur reconnaît des douleurs d'infection et un risque d'obstruction urétérale par les tumeurs. Il justifie ce nombre élevé par la nécessité d'organes intacts et affirme n'avoir "aucune autre alternative pertinente".
Objectifs
Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.
Bénéfices attendus
Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.
Procédures
les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.
Impact sur les animaux
Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).
Réduction
Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.
Raffinement
Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).
Choix des espèces
Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles
Effet des indoles bactériens sur l’amélioration des lésions du foie au cours de la maladie alcoolique du foie en présence de xénobiotiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à une alcoolisation forcée par un régime liquide pendant dix-sept jours et gavées d'oméprazole ou de benzopyrène, un polluant, cinq jours sur sept, avant mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que certaines souris peuvent mourir d'un coma éthylique en quelques heures de façon imprévisible, et demande une dérogation à l'anesthésie locale pour limiter le stress des contentions. Il affirme que seul l'animal permet d'intégrer les interactions entre alcool, microbiote, intestin et foie.
Objectifs
La consommation d’alcool induit une maladie alcoolique du foie (MAF). Cependant tous les individus consommateurs ne développent pas de formes sévères de MAF. Il existe un risque de développer des lésions du foie dès une consommation équivalente à 5 verres de vin chez l’homme et 3 verres de vin (ou 2 bières à 6° d’alcool) chez la femme. Il a été démontré que les bactéries intestinales qui constituent le microbiote intestinal (MI) ont un rôle dans ce risque individuel, et que moduler ce MI permet de réduire voire d’empêcher les lésions du foie. Des études ont montré que la pectine, une fibre soluble que l’on retrouve dans les végétaux dont la pomme ou les agrumes a un effet protecteur sur les lésions de MAF. En effet, la pectine va favoriser la croissance de certaines bactéries intestinales et favoriser la production de produits bactériens, les indoles, qui vont être protecteurs et diminuer l’apparition des lésions du foie. Ces indoles exercent leurs effets bénéfiques par le biais d’un récepteur, le AhR (récepteur aux hydrocarbures aromatiques). Ce récepteur interagit également avec d’autres molécules, en particulier les médicaments et les polluants, permettant notamment de les éliminer de l’organisme. L’oméprazole est un médicament largement prescrit aux patients ayant une MAF pour traiter l’acidité gastrique. Le Benzoapyrène (BaP) est un hydrocarbure présent notamment dans notre alimentation. Comme les indoles, ces deux xénobiotiques auquels nous sommes couramment exposés interagissent avec le récepteur AhR. Dans ce contexte, notre projet vise donc à évaluer les effets croisés d’une stimulation physiologique bénéfique du AhR par la pectine, et donc les indoles issus du MI dans des situations où il existe une co-exposition de l’individu soit à l’oméprazole, soit à des polluants tels que le BaP. L’approche in vivo nous permettra d’évaluer les effets croisés des indoles et des médicaments/polluants en prenant en compte les interactions entre l’intestin, l’immunité digestive, le microbiote intestinal, et le foie.
Bénéfices attendus
Il n’existe pas de traitement pour prévenir et encore moins améliorer les lésions du foie au cours de la maladie alcoolique du foie. Il a été démontré que les bactéries du tube digestif appelées le microbiote intestinal (MI) joue un rôle dans la MAF. Ces bactéries agissent sur notre organisme en produisant des métabolites qui peuvent s’avérer bénéfiques. Nous avons montré que dans la MAF, l’ajout de pectine, une fibre alimentaire, au régime quotidien permet de favoriser la croissance de certaines bactéries qui produisent des métabolites, les indoles, protecteurs des lésions du foie. Ces indoles agissent par le biais de voies métaboliques également utilisées pour détoxifier l’organisme des polluants et des médicaments. Dans un contexte où un individu est traité avec ces indoles pour améliorer les lésions de MAF, il s’agit de voir si la co-exposition aux médicaments et aux polluants n’affecte pas le traitement. Cela permettra également de vérifier si le traitement n’impacte pas l’élimination des polluants/medicaments. L’absence d’effets croisés permettrai d’envisager la voie des indoles comme traitement dans la MAF.
Procédures
- Les souris de toutes les procédures sont alcoolisées avec un régime semi-liquide contenant l’alcool et +/- de la pectine. 168 souris pendant 17 jours - les souris reçoivent le traitement à l’oméprazole (médicament) ou le placebo par gavage 5 fois/semaine durant toute la phase d’alcoolisation : 48 souris pendant 11 jours (procédure 1). - Les souris recevront le benzoapyrène en gavage 3 fois/semaine : 72 souris pendant 4 semaines (procédures 2 et 3). - 24 souris recevront le benzoapyrène en injection intra-peritonéale 3 fois par semaine : 24 souris pendant 4 semaines -Un seul prélèvement de sang est effectué, le jour du sacrifice chez toutes les souris anesthesiées : 168 souris, 1 seul prélèvement.
Impact sur les animaux
- Nous soumettons les souris à une alcoolisation forcée avec des doses élevées d’alcool. La quantité d’alcool dans le régime peut engendrer une réaction forte chez la souris en peu de temps. Des souris peuvent décéder d’un coma éthylique en quelques heures sans pouvoir le prévoir, alors que certaines souris récupèrent très bien. - L’exposition au polluant ou la prise de l’oméprazole nécessite de gaver régulièrement les animaux. Ce geste répété induit un stress de l’animal dès la contention. Cependant, les canules de gavage et la compétence de l’assistant ingénieur formé à ce geste permettra de réduire au maximum le temps de la contention. - Une exposition au BaP via une injection intra-péritonéale est également prévue. La contention à chaque injection induit un stress chez l’animal en plus de l’injection intrapéritonéale.
Devenir
Mise à mort pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les complications qui vont être observées au cours de la maladie alcoolique du foie mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet vise en effet à étudier l’effet curatif des indoles bactériens produits par le microbiote intestinal dans un contexte d’exposition à des xénobiotiques, l’oméprazole un médicament diminuant la production d’acide gastrique et un hydrocarbure aromatique polycyclique, le benzoapyrène (BaP) présent dans notre alimentation quotidienne. Si nous réalisons un certain nombre d’expériences in vitro sur des lignées hépatocytaires et entérocytaires différenciées afin d’approcher les effets à l’échelle d’un organe spécifique. Nous devons également considérer l’effet sur les bactéries intestinales présentes dans le tube digestif, sur les cellules immunitaires de l’intestin et leur impact sur la barrière intestinale puis sur le foie. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours est donc l’animal permettant d’intégrer les interactions entre alcool, xénobiotiques/ bactéries du tube digestif / altération du tube digestif y compris au niveau immunitaire et lésions du foie.
Réduction
Notre critère de jugement principal est la modulation des transaminases. Pour mettre en évidence des différences de transaminases entre les groupes qui puissent etre validés statistiquement, nous allons avoir besoin de 12 souris par groupe.
Raffinement
Les souris seront par 2 pour avoir accès au régime en quantité suffisante. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique et la quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux si nécessaires. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Néanmoins, le gavage administré aux souris nécessitera leur manipulation très régulière. Cela sera réalisé par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole. Lors de l’injection intrapéritonéale du benzapyrène, nous demandons une dérogation à l’anesthesie locale à la lidocaïne afin de limiter le stress de 2 contentions successives et sachant que le diluant , de l’huile isio 4, n’a pas de toxicité avérée. Le jour du sacrifice, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. L’option du gavage pour le benzoapyrène plutot que l’ajout au régime a été choisi pour contrôler parfaitement la dose de xénobiotiques par poids de souris.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie de la maladie alcoolique du foie sont proches de ceux observés chez l’Homme bien que l’évolution des lésions du foie reste plus modérée que celles observées chez l’homme. Le modèle d’alcoolisation chez la souris est bien décrit dans la littérature, et c’est un modèle largement utilisé et validé par la communauté scientifique.
Tests de génotoxicité chez le mammifère
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1400
1 400 rats et 350 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dans le cadre de prestations réglementaires pour des laboratoires, ils reçoivent des substances dont l'innocuité est en cours d'étude, subissent des prélèvements sanguins répétés, puis sont mis à mort pour prélever moelle osseuse et côlon en vue de tests de génotoxicité. Le porteur déclare des impacts "néant" et présente ces tests comme un préalable prédictif d'une activité cancérogène avant des études plus longues. Le choix des rongeurs est renvoyé aux lignes directrices de l'OCDE.
Objectifs
Dans le cadre de ses activités de prestation, le laboratoire de toxicologie réalise des tests de toxicologie sous Bonnes Pratiques de Laboratoire pour le compte de laboratoires pharmaceutiques, chimiques… Ces études sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation.
Bénéfices attendus
Ces études sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation.
Procédures
Le prélèvement des hématies et réticulocytes circulants est réalisé avant tout traitement (taux basal) puis 28 et/ou 45 jours après le dernier traitement au niveau de la veine caudale ou au sinus retro-orbital après anesthésie à l’isoflurane. Jusque 100 μL de sang sont prélevés à chaque prélèvement
Impact sur les animaux
Néant
Devenir
Animaux mis à mort en fin de traitmeent pour le prélèvement des organes d'intérêt tets du micronoyau au niveau de la moelle ossseuse et du colon ou test des comètes. Animaux traités par un produit dont l'inocuité est en cours d'étude
Remplacement
Génération de données sur le produit à étudier avant d’entreprendre des études de toxicologie (plus longues et nécessitants plus d’animaux) obligatoires, les tests de génotoxicité étant des tests à court-terme prédictifs d’une activité cancérogène. Peuvent-être intégrés dans les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités d’enregistrement. Peuvent-être utilisés dans le cadre d’activité de recherche.
Réduction
Les tests peuvent être coiplés entre eux afin d'étudier plusieurs end-points à la fois (mutation géniques, chromosomiques et lésions primaires de l'ADN), sur les même animaux, et ce afin de réduite le nombre d'animaux utilisés
Raffinement
Les animaux montrant des signes de souffrances liéesà l'action du produit à étudier sont mis à mort.
Choix des espèces
Le Test du micronoyau et le test des comètes ont une ligne directrice OCDE (respectivement, 474 et 489) chez le rongeur. Le test de mutation au niveau du gène Pig-A n’a pas de ligne directrice finalisée de l'OCDE, mais un SPSF (standard project submisson form) est en cours. Le test du micronoyau au niveau du colon n'a pas de ligne directrice, mais il suit la publication de Vanhauwaert et al. 2001. 5-7 semaines selon les recommandations de l'OCDE 474 et 489
Etude du rôle des différents sous-types de macrophages dans le développement des lésions pulmonaires associées à l’irradiation stéréotaxique chez la souris : hypothèse d’une origine circulante des macrophages
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont cousues deux par deux par chirurgie pour relier leurs circulations sanguines, puis leur poumon est irradié, afin de déterminer l'origine des macrophages impliqués dans la fibrose. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire et une mobilité modifiée par la suture, mais s'appuie sur une publication rapportant l'absence d'effet de la parabiose sur le sommeil et le toilettage. Il affirme qu'il n'existe aucune alternative et que la souris est un "modèle incontournable" pour ces tests.
Objectifs
Chaque année en France, 30 000 nouveaux cas de cancers pulmonaires sont diagnostiqués. Dans 25% des cas, le diagnostic est précoce et la prise en charge thérapeutique est chirurgicale avec de bons résultats. Néanmoins, environ 40% des patients sont considérés comme inopérables et depuis 10 ans, la radiothérapie stéréotaxique (permettant de cibler précisément la zone à traiter) leur est proposée. Elle nécessite des appareils permettant de délivrer avec une grande précision de fortes doses en quelques fractions, sur un très petit volume. Globalement, la toxicité majeure associée à la radiothérapie stéréotaxique, est la pneumopathie radique pouvant évoluer vers une fibrose radique. Vu son efficacité sur le contrôle tumoral, des questionnements sont en cours sur une possible utilisation de la radiothérapie stéréotaxique en première intention chez les patients opérables mais également sur la possibilité d’utiliser des champs plus larges pour traiter des tumeurs plus grosses, permettant une utilisation plus large. Les connaissances sur ces doses ablatives (très fortes doses par fraction) ne sont que parcellaires. L’acquisition d’un appareil permettant ce type d’irradiation chez le petit animal a permis la conduite d’études (thèses et publications). Un recul important sur le modèle d’irradiation stéréotaxique pulmonaire chez la souris a été acquis, avec des données anatomopathologiques précises jusqu’à 12 mois après irradiation en dose unique ou fractionnée. L’objectif de ce projet est de déterminer si les macrophages sont issus du tissu lui-même ou s’ils sont recrutés depuis la circulation sanguine. Pour cela, l’objectif est de pouvoir faire circuler dans le sang des souris avant irradiation des cellules colorées, que nous pourrons rechercher ensuite dans le tissu (seules les cellules sanguines circulantes sont colorées, les cellules du tissu restent normales). Pour cela, le projet utilisera le modèle de parabiose chez la souris permettant de créer une connexion des systèmes sanguins de deux souris. Les souris GFP sont des souris dont toutes les cellules expriment une protéine fluorescente verte, la GFP : toutes leurs cellules sanguines sont donc vertes. Une fois la parabiose établie entre une souris normale et une souris GFP, la souris normale se retrouve donc avec des cellules vertes circulantes. Nous allons rechercher ces cellules chez la souris normale après irradiation localisée du poumon.
Bénéfices attendus
La fibrose est une cicatrisation exagérée aboutissant à un dépôt excessif de collagène au sein des tissus et organes. Les macrophages, cellules immunitaires jouant un rôle également dans la cicatrisation, ont été démontrés comme impliqués dans le développement de la fibrose pulmonaire, que l’on peut observer chez certains patients traités par radiothérapie au niveau du thorax (cancers pulmonaires, cancers du sein, lymphomes). Les techniques de radiothérapie ont beaucoup évolué ces dernières années, avec en particulier l’irradiation de très petits volumes pulmonaires avec des doses quotidiennes beaucoup plus fortes que lors des protocoles classiques. Si on sait aujourd’hui que les macrophages jouent un rôle dans le développement de la fibrose pulmonaire lors des protocoles « classiques » de radiothérapie, très peu de choses sont connues sur la fibrose induite par l’irradiation de petits volumes pulmonaires. La possibilité récente de modéliser ces petits volumes irradiés chez la souris permet de mieux connaître les processus responsables du développement fibreux dans ce contexte, et en particulier le rôle des macrophages. Le but de ce projet est savoir si les macrophages sont issus des macrophages présents au sein du tissu (prolifération in situ) ou issu d’un recrutement depuis la circulation sanguine. La réponse à cette question est déterminante pour la suite des projets de recherche. En effet, dans une perspective thérapeutique, les stratégies pouvant être mises en place pourront être très différentes en fonction de l’origine des macrophages. Par exemple et de manière simplifiée, si la stratégie thérapeutique mise en place vise à bloquer le recrutement des macrophages depuis la circulation sanguine alors qu’en réalité ils prolifèrent in situ au sein du tissu, la stratégie est vouée à l’échec.
Procédures
• Chirurgie de mise en place de la parabiose, anesthésie générale : durée 1 heure • Prélèvement au sinus rétro-orbital, animal vigile, 1 prélèvement par animal 2 semaines après la chirurgie • Irradiation sous anesthésie : durée maximale 35 min • Durée totale d’une étude : 8 semaines
Impact sur les animaux
Le modèle de parabiose implique une douleur post-opératoire, prise en charge par injection de buprénorphine. Une perte de poids est observée de l’ordre de 10%, avec récupération du poids initial dans les 8 jours suivant la chirurgie. Les souris étant suturées l’une à l’autre, ceci implique forcément une modification de mobilité, sans réduction. Lorsque la parabiose est équilibrée (souris habituées l’une à l’autre, poids identiques, pas de dominance), le comportement des souris n’est pas affecté. Une publication ne rapporte aucun effet de la parabiose sur les différentes phases de sommeil ni sur les activités de toilettage.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements sous anesthésie terminale
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à ce jour concernant l’étude du recrutement macrophagique depuis la circulation sanguine vers le tissu pulmonaire irradié. L’utilisation des animaux vivants est indispensable à l’étude de ce processus.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques paramétriques (Anova, T-test), il est donc en général nécessaire d’avoir un minimum de 5 animaux pour chaque groupe et condition étudiée. Nous prévoyons donc 5 couples en parabiose pour les analyses en cytométrie en flux. En revanche, étant donné le recul acquis au laboratoire sur les lésions tissulaires et leur étude en histologie et immunohistologie, nous jugeons suffisant de réaliser 3 couples en parabiose pour les analyses histologiques. Nous prévoyons également 6 couples contrôles (parabiose mais non irradiés), 3 pour la cytométrie en flux, 3 pour l’histologie. Enfin, le risque chirurgical impose de réaliser quelques couples supplémentaires, nous avons choisi de réaliser 6 couples supplémentaires afin de garantir la taille des groupes d’étude.
Raffinement
Pour la chirurgie et l’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Des traitements associés à la chirurgie seront mis en place : analgésie per et post-opératoire, anti-inflammatoires et antibiotiques. Un seul couple de parabiose sera hébergé par cage. Des dômes jetables seront disposés dans les cages afin de fournir un abri rassurant. La taille de l’ouverture sera adaptée pour que le couple de parabiose puisse y avoir accès. Les souris sont suivies régulièrement (2 fois par jour/1 fois par jour le week-end les 2 premières semaines puis 1 fois par jour) et tout signe de détresse sévère et de prostration d’un animal entrainera l’euthanasie anticipée des deux souris impliquées dans la parabiose (immobilité, perte de poids, anémie, déshydration sévère, signes de détresse respiratoire, conflit entre les deux membres de la parabiose).
Choix des espèces
Le développement fibreux est un processus évolutif s’étendant sur une période longue. Le rongeur est utilisé pour plusieurs raisons : - durée de vie courte (la fibrose peut s’installer en 8 semaines) - facilité de manipulation - modèles incontournables pour réaliser des tests thérapeutiques préventifs ou curatifs La souris est utilisée pour ses variantes génétiques et la grande quantité d’outils moléculaires disponibles sur le marché. Les animaux seront commandés âgés de 10 semaines et utilisés après 1 semaine d’habituation à l’animalerie.
Inflammation pulmonaire Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques dans des modèles d’inflammation pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent l'induction d'un asthme sévère ou d'un syndrome de détresse respiratoire par instillation de bactéries ou de toxines dans la trachée, avec une gêne respiratoire pouvant évoluer vers la détresse et une perte de poids allant jusqu'à 25 %. Le porteur fixe des points limites, notamment la mise à mort au-delà de 25 % de perte de poids ou d'une température tombant à 33 degrés, et prévoit une ventilation forcée pouvant léser les poumons avant euthanasie. Il justifie l'animal par la difficulté de recréer in vitro une pathologie impliquant plusieurs types de cellules et de tissus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des modèles d’inflammation pulmonaire afin de tester des composés chimiques ou biologiques pour le traitement des pathologies associées, notamment un modèle d’asthme sévère résistant aux traitements par les stéroïdes ainsi qu’un modèle de syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA). L'asthme est défini comme une dyspnée ou gêne respiratoire. Il s'agit d'une maladie multifactorielle où l'allergie joue un rôle important. L'asthme allergique est une maladie inflammatoire des bronches qui débute essentiellement avant l’âge de 20 ans : il représente plus des 2/3 des asthmes chez l'enfant et 1/3 des asthmes chez l'adulte. L'asthme allergique est lié à l'inhalation d'allergènes de l'environnement, même si des facteurs non spécifiques (pollution, tabac, effort, stress...) peuvent le favoriser ou l'aggraver. De même, l’infection par des virus ou des bactéries induit une exacerbation de l’asthme et est associée à une inflammation neutrophilique au niveau des voies aériennes. Près de 20 à 30% des patients présentent un asthme neutrophilique et répondent très mal aux traitements conventionnels, à savoir les corticoïdes. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux modèles animaux pour évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Le SDRA (Syndrome de détresse respiratoire aigüe) est une réaction pulmonaire sévère amenant souvent à une hospitalisation, se produisant en réponse à des facteurs pulmonaires (infections bactériennes ou virales, quasi noyade, aspiration de contenu gastrique, traumatisme thoracique), et/ou non pulmonaires (sepsis extra thoracique, traumatisme abdominal, choc, brûlures étendues…). Ce syndrome se manifeste de manière brutale et est associé à une inflammation et des lésions importantes de l’épithélium et endothélium alvéolaires, et à une accumulation de fluides dans les alvéoles pulmonaires (œdème pulmonaire), ce qui cause une détresse respiratoire et une hypoxie chez le patient. Selon sa gravité, ce syndrome entraine la mort chez 27% (SDRA léger) à 45% (syndrome sévère) des patients concernés (JAMA, 2012). A ce jour, la stratégie thérapeutique principale se base uniquement sur une oxygénothérapie et une gestion symptomatique des complications. Il est donc crucial de développer des stratégies thérapeutiques pour ces patients via des modèles animaux de ce syndrome.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’asthme résistant aux stéroïdes ou sur le SDRA. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces deux maladies pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Induction d’asthme allergique : Sous anesthésie générale à l’isoflurane, J0: Sensibilisation à l’OVA par voie IP J12 & J13: administration d’OVA par voie intra-nasale J14: inoculation des bactéries Haemophilus Influenzae ou Chlamydia pneumoniae par voie intratrachéale. J32-33-34: Traitement aux corticoïdes par voie IP J33-34: sensibilisation à l’OVA par voie intra-nasale Euthanasie au plus tard à J35. Induction de SDRA : sous anesthésie générale, administration intratrachéale de LPS ou de Streptococcus pneumoniae. Euthanasie au plus tard une 7j après. Test de composés chimiques ou biologiques: Administrations intra-nasales sous anesthésie générale, maximum 25µL par narine Administrations intratrachéales sous anesthésie générale, maximum 50 µL Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale si nécessaire Implantation de mini-pompes osmotiques en sous-cutané pour administrer les composés, sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : AINS vétérinaire (Meloxicam) ou dérivé morphinique si contre-indication de l’AINS (Buprénorphine). Désinfection de la plaie régulière et application d’un cicatrisant (Dermaflon crème). Si besoin, suture reprise sous anesthésie à l’isoflurane Administration per os: gavage sous contention Prélèvements: Sang: Si peu invasifs: sous anesthésie générale à l’isoflurane (veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire…) Piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention Prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Puis constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale Liquide céphalorachidien (10 µL pour une souris) sous anesthésie générale Biopsie tissulaire: anesthésie générale et conditions aseptiques Prélèvements de tissus et lavages broncho-alvéolaires post mortem Mesures de la mécanique pulmonaire : sous anesthésie générale, la souris est intubée puis reliée à un appareil de ventilation mécanique forcée qui mesure des paramètres mécaniques (pression, volume) des poumons. Puis euthanasie. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique + méthode physique. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir: prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Dans les deux modèles, nous nous attendons à observer chez les souris des signes de difficulté respiratoire (dyspnée), pouvant potentiellement évoluer jusqu’à la détresse respiratoire et l’hypoxie. Un suivi clinique longitudinal sera effectué par du personnel compétent. Une grille de scoring clinique, et des points limites adaptés seront mis en place. Nous nous attendons par ailleurs à observer une perte de poids transitoire chez les animaux, se résolvant en quelques jours ( à 25% ou persistantes (entre 20 et 25% pendant 3 jours consécutifs) constitueront un point limite. Concernant le modèle de SDRA, nous nous attendons par ailleurs à observer au cours des 2 premiers jours une chute de température corporelle de 5 à 10%. Les animaux seront équipés de puces de mesure de température sous cutanées (mises en place sous anesthésie) afin de pouvoir suivre la température des animaux. Les pertes de températures atteignant 33°C constitueront un point limite. Si des baisses de températures sont observées (entre 1 et 3°C), du coton et du sizzle dry seront rajoutés dans la cage afin que les animaux puissent s’y réchauffer. Concernant les mesures de saturation, peu d’effets indésirables pour l’animal sont attendus, puisque la mesure est peu invasive et indolore et seront réalisées sur animal anesthésié (Isoflurane) Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles peuvent potentiellement créer des lésions pulmonaires, c’est pourquoi elles seront réalisées sous anesthésie profonde avec analgésie (Xylazine et Buprénorphine) et suivies d’une euthanasie sans réveil. Les administrations de traitement se feront sous anesthésie générale, sauf pour les administrations pour lesquelles le stress engendré serait inférieur au stress d’une anesthésie, et pour les administrations incompatibles avec une anesthésie (gavage).
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe sera nécessaire si une réduction significative de l’inflammation pulmonaire doit être observée suite à un traitement préventif ou curatif. Ce nombre pourra monter jusqu’à 15 en fonction d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, l’histologie et/ou l’expression de gènes dans les poumons. Cette analyse sera effectuée au moyen du test ANOVA.
Raffinement
S’agissant de modèles d’inflammation pulmonaire, les animaux pourraient présenter de la dyspnée. Si celle-ci évoluait vers la détresse respiratoire (position d’orthopnée, mouvements respiratoires anormaux) ou la suffocation, cela constituerait un point limite avec euthanasie dans les plus brefs délais. Du fait de l’inflammation générée, nous nous attendons aussi à ce que les animaux perdent du poids. En conséquence, les animaux seront pesés 2 fois par semaine avant induction de la maladie, puis une fois par jour à partir de l’induction de la maladie. A partir de 10% de perte de poids, une réhydratation sous-cutanée sera mise en place. -Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate par voie sous-cutanée, 0.5mL, une fois par jour. -Entre 15 et 25%% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL par voie sous cutanée, deux fois par jour. En cas de perte de poids constatée supérieure à 10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus.
Choix des espèces
- La réponse asthmatique allergique est aussi très bien caractérisée chez la souris. - Les challenges OVA et infections avec Haemophilus influenzae ou Chlamydia pneumoniae chez la souris sont bien documentés. - Les inductions de SDRA par le LPS ou Streptococcus pneumoniae sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie pulmonaire et la dose toxique dans la même espèce. Des animaux sevrés (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés pour procédures d’induction d’asthme résistant aux corticoïdes et de SDRA, ces modèles étant bien décrits chez les animaux adultes.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement des cancers chez la souris : évaluation thérapeutique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles de métastases expérimentales.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse ou dans la veine du foie, puis l'injection de radioéléments couplés à des vecteurs et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur cinq mois, pour évaluer de nouveaux médicaments radioactifs contre le cancer. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être étudiés in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable". Les bénéfices annoncés, un transfert en clinique, restent formulés comme une perspective.
Objectifs
L’objectif principal de notre plateforme est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Nous disposons de différents vecteurs (Anticorps, affitines, liposomes, etc…) et de plusieurs radioéléments (Astate 211, Iode 131, zirconium, Yttrium 90 Scandium 47, cuivre 64 etc…), certains connus qui servent de références et des nouveaux, produits. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon « toxique » pour cette cellule. Il faut accrocher le radioélément à un ligand et à un vecteur afin de former un radiopharmaceutique qui doit cibler et détruire la cellule tumorale tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. Nos études suivent le même protocole. Le système vecteur- ligand-radioélément est d’abord testé sur des cellules tumorales en culture. Quand l’efficacité est démontrée, les cellules tumorales sont greffées à des souris. Le système vecteur- ligand-radioélément est injecté aux animaux porteurs de tumeurs pour étudier la distribution dans un organisme vivant, la fixation du radioélément sur la tumeur et tous les organes. La radiothérapie sera appliquée sur 2 types de modèles de métastases expérimentales : injection intraveineuse dans la veine latérale de la queue qui engendre un envahissement disséminé et injection dans la veine porte hépatique qui permet un envahissement du foie. Ces 2 procédures reflètent les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de produire un radiopharmaceutique capable de détruire les cellules tumorales dans des modèles précliniques. En vue d'un futur transfert à la clinique.
Procédures
Greffe de cellules tumorale en intraportale (Procédure 2) : Cette procédure reflète les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements. Injection unique. Concerne 700 souris sur souris analgésiées et anesthésiées. La procédure chirurgicale en elle même dure 15 minutes par souris. Les souris sont ensuite suivies jusqu'à 150jours. Prélèvement sanguins 50µl de sang à J-7,15,30,45,60,90,120, 150 pour évaluer toxicité hématologique (procédure 3). Lors des prises de sang, une goutte de tétracaïne 1% collyre unidose est appliquée au niveau de l’œil puis les souris sont anesthésiées sous isoflurane, et le sang est prélevé au niveau du sinus rétro orbital à l’aide d’un capillaire. Les prélèvements en eux mêmes ne durent qu'une trentaine de secondes et concernent 1750 souris.
Impact sur les animaux
Les procédures de modèles de métastases (procédure 1 et 2) sont modérées si les animaux sont bien suivis. Ils seront suivi quotidiennement selon une grille de score et de points limites (en annexe) qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. En palier 1 (un critère de la liste en annexe): AINS : Méloxicam 2.5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 (2 critères associés de la liste en annexe) : morphinique faible : Buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané matin et soir (soit 50 µL à 0,03 mg/mL pour une souris de 25 g). En palier 3 : mise à mort. La procédure de thérapie (3) pourrait entraîner des effets indésirables. Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Enfin, la procédure d'imagerie (4) n'entraine pas d'effet indésirable
Devenir
Porocédure 1 : 1050 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie. Procédure 2 : 700 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie.
Remplacement
Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism. Nous utiliserons des T-tests non paramétriques pour les analyses intergroupes, et un test Logrank pour l’analyse des courbes de survie.
Raffinement
L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois ou cinq en fonction des protocoles, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe
Caractérisation par IRM et SRM in vivo du développement de la sclérose latérale amyotrophique ( SLA) chez la souris mutante TDP-43-A315T
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles sont suivies par IRM et spectroscopie sous anesthésie à différents stades de la maladie, puis mises à mort par inhalation de CO2 pour prélever cerveau et moelle épinière. Le porteur qualifie l'imagerie de "totalement non invasive et atraumatique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal entier. Le modèle est décrit comme un phénotype dommageable encore peu caractérisé, dont ce projet vise surtout la description.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative fréquente, dont la prévalence est de 4 à 6/100 000. Elle est caractérisée par la mort progressive et sélective des motoneurones dans le cerveau et la moelle épinière, ce qui provoque une paralysie fatale. L’évolution naturelle aboutit au décès, avec une médiane de survie de 40 mois. Il a été mis en évidence une agrégation anormale de la protéine TDP-43, dans certaines régions du système nerveux central ainsi qu’une mutation du gène codant pour cette protéine. Il existe un modèle transgénique de souris TDP-43-A315T qui possède une mutation du gène codant pour la protéine TDP43. Par contre, ce modèle est très peu caractérisé à ce jour. Il s’agit d’un modèle à phénotype dommageable.Le but de ce projet est de caractériser le modèle de façon non invasive in vivo par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et Spectroscopie par Résonance Magnétique (SRM) tout au long du développement de la pathologie. L’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et la SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique) sont deux techniques d’imagerie et de spectroscopie particulièrement adaptées à l’étude du cerveau et de la moelle épinière. L’imagerie va fournir des images qui peuvent être analysées pour en extraire des paramètres tissulaires ou morphologiques, et la SRM fournit des spectres permettant de quantifier plusieurs métabolites cérébraux (choline, créatine, NAA, inositol, glutamate, glutamine).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleur compréhension du développement de la pathologie pour laquelle il n'existe pas de médicament mise à part les antidouleurs
Procédures
Les séquences d'IRM et de SRM sont d'une durée maximale de 2h et seront réalisées 1 fois. pour chaque stade
Impact sur les animaux
les séances d'imagerie IRM sont totalement non invasives et atruamatiques. Le seules "nuisances" possibles sont celles liées à la piqure d'aiguille lors de l'injection de l'agent de contraste. L'agent de contraste dotarem est celui utilisé en routine clinique donc sans effet secondaire
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à chaque stade après les acquisitions IRM et SRM par inhalation de CO2. Le cerveau ainsi que la moelle épinière seront prélevés.
Remplacement
La compréhension du modèle chez l'animal est indispensable avant de pouvoir envisager de passer chez l'Homme. Les mammifères sont des animaux proches de l’Homme au niveau du fonctionnement de l'organisme. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la mise en place de la SLA.
Réduction
le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.
Raffinement
Raffinement: Les animaux seront suivis quotidiennement. Ils sont anesthésiés pour les actes IRM et SRM qui sont deux techniques d’imagerie non invasives. Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique.
Choix des espèces
Cette étude sera réalisée sur des souris mutantes TDP-43-A315T Les souris auront entre 2 et 3 mois, les premiers symptômes de la maladie apparaissant vers 3-4 mois
Etude de molécules favorisant la présentation antigénique sur des cellules tumorales pulmonaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales pulmonaires par chirurgie du thorax, puis des injections répétées et un suivi de la tumeur par imagerie, pour tester des molécules censées restaurer la reconnaissance des tumeurs par le système immunitaire. Le porteur reconnaît des alternatives sur cellules mais affirme que seul un "animal vivant, entier" permet d'étudier l'effet anti-tumoral. Les effets attendus incluent une gêne respiratoire liée à la greffe et une toxicité possible du traitement.
Objectifs
Le cancer est un groupe de maladie touchant une grande partie des organes, il se caractérise par la multiplication anarchique de cellules. Ces cellules, dites « tumorales », ont subi plusieurs mutations qui leur ont permis d’acquérir de nouvelles propriétés telles que l’immortalité. Aujourd’hui, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, en particulier en France où il est devenu la première cause de décès. De plus, avec 30 991 morts répertoriés en 2017, le cancer du poumon est la première cause de mortalité par cancer en France. Celui-ci est divisé en deux catégories en fonction des cellules à partir duquel il se développe : les cancers non à petites cellules (NSCLC) et les cancers à petites cellules (SCLC). Les NSCLC représentent 85% des cas, contre 15% pour les SCLC. Cette distinction est importante car la prise en charge des patients est différente. Le choix de traitement d’un patient dépend du type de tumeur, mais aussi de son stade de développement. Parmi ce choix thérapeutique, il existe la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie. Cette dernière se définie par l’administration de molécules stimulant le système immunitaire afin de lutter contre le cancer. En autres, les anticorps anti-PD1 (Nivolumab© ou Pembrolizumab©) sont indiqués pour le traitement de certains cancers avancés, tels que les mélanomes, les NSCLC, etc. Cependant chez les patients atteints de NSCLC, seuls 20-30% d’entre eux répondent positivement à l’immunothérapie anti-PD1. Cette résistance peut être expliquée par plusieurs paramètres intrinsèque à la tumeur du patient, par exemple le faible taux d’expression d’antigène à la surface de la tumeur. A savoir, ces antigènes sont des protéines qui sont présentes seulement à la surface des cellules cancéreuses. La présentation de ceux-ci permette au système immunitaire du patient de différencier les cellules tumorales des cellules saines. Ainsi, le système immunitaire est capable de protéger quotidiennement notre organisme en surveillant, puis en éradiquant les cellules non-saines. Le faible taux d’antigènes sur les NSCLC met donc en péril la reconnaissance des cellules tumorales par le système immunitaire. Notre étude donc sur la restauration de l’expression d’antigènes sur les NSCLC grâce à de petites molécules. Cette restauration permettrait donc au système immunitaire du patient de lutter contre les cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Notre stratégie thérapeutique est de favoriser l’expression d’antigènes au sein de la tumeur NSCLC lors de son développement facilitant sa reconnaissance par le système immunitaire et donc, sa régression et/ou son élimination. Cette réactivation du système immunitaire à l’aide de ces molécules pourrait aussi être combinée avec des immunothérapies déjà approuvées chez les patients, telles que anti-PD1, afin de lever la résistance chez les patients concernés.
Procédures
Greffe orthotopique pulmonaire chirurgicale avec incision au niveau du thorax et injection sous anesthésie de moyenne durée (quelques minutes). Après l'inoculation des cellules, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (anesthésie locale) pour la voie d'administation du traitement (1, 2 ou 3 fois par semaine pendant 2 semaines) et pour le suivi de la croissance tumorale par bioimagerie (2 injections de luciferine par semaine pendant 2 semaines, puis 1 injection par semaine si l'animal ne présente plus de signe de tumeur). Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (isoflurane) (1 fois par semaine durant la durée du traitement). Après euthanasie des animaux, certains organes seront prélevés afin d’étudier l’impact des traitement sur le système immunitaire et les cellules tumorales.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient présenter des signes moteurs anormaux et des changements sensoriels au réveil après anesthésie, ils seronts donc oberservés de façon accentuée les 24 heures suivant l'opération. De plus, pour favoriser une récupération rapide, les souris seront nourries avec du DietGel Recovery. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés à la greffe intrapulmonaire et une toxicité éventuelle du au traitement par les petites molécules.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (poumons, rate, ganglions drainants) et d'étudier au mieux la réponse anti-tumorale mise en place après traitement de nos deux molécules.
Remplacement
Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests de toxicité sur cellulles, test d'inhibition du splicésome sur cellules à l'aide plasmide. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire les caractéristiques de nos molécules et non leur activité anti-tumorale sur les NSCLC. L'utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité et l’effet anti-tumoral des thérapies sur le modèle TC-1 en orthotopique. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses pulmonaires et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
D'après nos études antérieures, on observe une différence significative de surface tumorale entre deux groupes lorsque la différence entre les moyennes est supérieure à 28%, avec une variabilité d’environ 22%. Après calcul de puissance, avec un risque alpha à 0.05 et beta de 0.20, on obtient 12 animaux par groupe. Nous ferons un suivi longitudinal de la croissance tumorale. Nous vérifierons si les valeurs suivent une loi normale. En fonction, nous utiliserons soit un Mann Withney ou un t test lorsqu’il n'y a que deux groupes à comparer, ou un 2-way ANOVA avec un post test Kruskal Wallis ou Bonnferoni lorsqu'il y a plus de deux groupes. Nous pourrons ainsi également comparer les groupes entre eux à un temps T défini (par exemple à J7 afin de voir si le lot de souris développant la tumeur avant traitement est homogène, ou bien à des temps plus avancés afin d’apprécier la différence de croissance entre 2 ou plusieurs groupes). Afin de répondre aux obejectifs scientifiques de cette étude, nous avons calculé que 4 groupes suivants 4 conditions de traitement différents (procédure 1) serait suffisant.
Raffinement
Afin de réduire la douleur chez l’animal les injections intrapéritonéales seront effectuées après anesthésie locale (lidocaïne); les injections intra-pulmonaires seront faites sous anesthésie isoflurane . Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi à l’aide de nestlets et maisons en cartons afin de réduire le stress des animaux.Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux adultes à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, car ce cancer se développe chez les adultes.