Souris
Caractérisation d’une nouvelle lignée de souris comme modèle dans les expériences de transfert adoptif de cellules
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur irradie une partie des souris, greffe des cellules souches, en infecte d'autres par le virus de la vaccine, pour valider une nouvelle lignée destinée aux expériences de transfert de cellules immunitaires. Il indique attendre peu de douleur, les manipulations étant faites sous anesthésie, et n'avoir jusqu'ici associé aucun signe clinique à l'infection virale. Il présente cette lignée comme supprimant un biais des lignées existantes, avant une mise à mort pour prélever les organes.
Objectifs
Le transfert adoptif de cellules donneuses dans un animal hôte est fréquemment utilisé pour l’étude du système immunitaire. Une expérience classique consiste à transférer des cellules issues d’animaux sauvages ou mutés pour un gène donné dans un animal hôte et de suivre le devenir de ces cellules (circulation, fonction …). Ceci nécessite l’expression par les animaux donneurs et receveurs de marqueurs permettant de les distinguer. L’un des marqueurs les plus classiquement utilisé est le CD45. CD45 est une protéine exprimée à la surface de toutes les cellules immunitaires existant sous deux formes : CD45.1 et CD45.2. Des outils ont été développés permettant la distinction de ces deux formes par cytométrie de flux. Les cellules donneuses sont ainsi issues de souris de lignées B6.SJL ou B6 exprimant respectivement les formes CD45.1 et CD45.2. Or de récentes études ont montré que plusieurs gènes sont exprimés différemment entre ces deux lignées, indépendemment de toute expérimentation ou modification génétique. Notamment, les cellules souches issues de souris de lignées B6.SJL ont une capacité de greffe réduite en comparaison à celles issues de souris B6. De plus, ces deux lignées n’ont pas la même capacité de réponse à une infection par un virus, ce qui introduit un biais expérimental. Pour pallier à ça, nous avons créer une nouvelle lignée de souris B6 exprimant le CD45.1, appelée B6-CD45.1. Cette lignée souris vise à remplacer la lignée B6.SJL et est supposée strictement identique à la souris B6 sur le plan génétique à l’exception de la forme de CD45 exprimée. L’objectif de cette procédure est de démontrer que cette nouvelle lignée ne présente pas de différence en termes de greffe de cellules souches et de réponse immunitaire antivirale comparé à la B6, et qu'elle peut ainsi être utilisée comme modèle dans les expériences de transfert adoptif.
Bénéfices attendus
Le modèle actuel de transfert adoptif de cellules utilisant les lignées B6.SJL et B6 présente un biais puisque plusieurs gènes sont exprimés différemment entre ces deux lignées, indépendemment de toute expérimentation ou modification génétique. Ceci entraîne notamment des différences au niveau de la réponse immunitaire et de la capacité de greffe des CSH de ces deux lignées. La nouvelle lignée B6-CD45.1 qui nous avons générée et que nous souhaitons caractériser dans ce projet, est supposée génétiquement identique à la B6 à l’exception de la forme de CD45 exprimée. Ainsi, on s’attend à une réponse immunitaire et une capacité de greffe de cellules souches hématopoietique strictement identique entre ces deux lignées. Cette nouvelle lignée permet d’abroger les biais précédemment cités et représente une réelle plus-value en comparaison à la lignée B6.SJL pour tous les scientifiques pratiquant le transfert adoptif de cellules.
Procédures
L’irradiation par rayon X (10 minutes) et l’infection intranasale par VV sont réalisés sous anesthésie générale profonde injection intra-péritonéale de Ketamine/Xylazine (respectivement 70 mg/kg et 9 mg/kg ). Les transfert de cellules par voie intraveineuse et les prélèvements de sang au sinus retro-orbital sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane (4% dans une chambre à oxygène). Fréquence : x irradiation : une seule fois/animal x infection : une seule fois/animal x transfert de cellules : une seule fois/animal x prélèvement de sang : une (procédure 2) ou deux fois (procédure 1)/animal
Impact sur les animaux
Peu de douleur est attendue au cours de la procédure d’irradiation qui est réalisée sur animaux anesthésiés. Peu de douleur également attendue au cours de l’injection de cellules par voie intraveineuse et des prélèvements de sang au sinus retro-orbital, réalisés sur animaux anesthésiés Infection par le virus de la Vaccine (VV-NP68) : Le laboratoire bénéficie d’une longue expérience de manipulation du virus VV-NP68 in vivo (10 ans). Nous infectons avec un titre viral modéré suffisant pour induire une réponse CD8 sans causer de pathologie détectable. En effet, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’a jusque-là pu être associé à l’infection par VV-NP68.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements des organes.
Remplacement
La procédure 1 consiste à étudier la capacité de greffe de CSH chez un hôte irradié. Les cellules souches greffées vont se différencier en différentes cellules de la lignée hématopoïétique (erythrocytes, lymphocytes …) qui vont coloniser les différents organes de l’hôte. La réponse immunitaire antivirale (procédure 2) est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (poumons, ganglions drainants, rate …). Ces deux procédures ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats. La procédure 1 sera réalisée avec des mâles et des femelles car un effect sexe dans les expériences de transfert de CSH a été rapportée par différentes études.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque procédure. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : x Irradiation : réalisée sur des animaux anesthésiés (Ketamine/xylazine), avec peu de douleur attendue. Le déssèchement des yeux lié à l’anesthésie sera prévenu par application d'ocrygel. Après irradiation, les souris seront placées en armoire chauffante jusqu'à leur réveil. Une surveillance sera réalisée dans les minutes qui suivent la greffe, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. x Injection de cellules et prélèvements de sang : un collyre anesthésique (tetracaine) est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. L’injection et le prélèvement de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Fradexam). x Infection par le virus de la Vaccine (VV-NP68) : Les infections intranasales sont réalisées sur animaux anesthésiés (Ketamine/xylazine). Durant la phase de réveil, les 5 souris de la cage sont positionnées les unes à côté des autres afin de réduire les risques d’hypothermie. Le laboratoire bénéficie d’une longue expérience de manipulation du virus VV-NP68 in vivo (10 ans). Nous infectons avec un titre viral modéré suffisant pour induire une réponse CD8 sans causer de pathologie détectable. Aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’a jusque-là pu être associé à l’infection. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’infection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser une lignée de souris, seul ce modèle sera utilisé dans ce projet. Les souris receveuses de la procédure 1 qui vont subir l’irradiation seront âgées de plus de 9 semaines. En effet, les souris plus jeunes supportent moins bien l’irradiation. Les souris donneuses de moelle osseuse de la procédure 1 et les souris de la procédure 2 seront âgées de 8-12 semaines, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Formation du personnel, entrainement et raffinement des techniques chirurgicales
- Formation professionnelle
Rats : 40
Hamsters dorés : 20
100 animaux non-humains, soit 40 souris, 40 rats et 20 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les opère sous anesthésie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner quatre membres du personnel à des techniques chirurgicales, avant une mise à mort et une nécropsie. Il indique que des complications peuvent provoquer une mort prématurée pendant la chirurgie et des infections locales chez les animaux réveillés. Il présente ce recours comme du raffinement et de la réduction, en affirmant qu'il diminuera "à terme" le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Le recours à différentes techniques chirurgicales est régulièrement nécessaire dans les différents projets de recherche. Ce recours n’est envisageable qu’après l’acquisition d’un niveau d’expérimentation animale (applicateur ou concepteur) et l’obtention d’un diplôme complémentaire en chirurgie expérimentale. Ces formations ne rendent pas directement opérationnel sur tous les types de chirurgie et il est important de continuer à se former et à pratiquer pour obtenir un geste bon et un bon taux de réussite. Cela va dans le sens du concept de raffinement, mais également de celui de réduction de la règle des 3R. Effectivement en acceptant d’utiliser des animaux à des fins de formations et d’entrainement on diminue à terme le nombre d’animaux utilisés dans les projets en améliorant de taux de réussite et le bien-être animal global. Ce projet a pour objectifs de former, d’améliorer, de raffiner les techniques chirurgicales des principales chirurgies déjà réalisées ou à venir dans d’autres projets de la société. Le public visé concerne le personnel disposant déjà des niveaux réglementaires (4 personnes). La formation permettra également de valider 2 jours de formation continue dans le cadre des 3 jours de formation continue à réaliser par fenêtre de 6 ans. La formation sera assurée par une formatrice vétérinaire spécialisée en chirurgie. Après ces 2 jours, le personnel continuera son parcours de formation en relation avec le responsable de chirurgie du site.
Bénéfices attendus
À la suite de ce parcours de formation, une attestation sera délivrée et de nouvelles personnes pourront être identifiées pour réaliser ces différentes techniques dans le cadre de projets de recherches spécifiques faisant l’objet d’autres demandes d’autorisation de projet. La formation permettra également de valider 2 jours de formation continue dans le cadre des 3 jours de formation continue à réaliser par fenêtre de 6 ans. L'amélioration des techniques chirurgicales apportera un bénéfice scientifique en améliorant le taux de réussite et une optimisation de la réalisation des chirurgies dans les projets à venir, mais également en diminuant le nombre d'animaux utilisés à terme et le bien-être animal global.
Procédures
Tous les animaux de ce projet recevront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (air/isoflurane). La chirurgie durera entre 15 min à 1h. Le poids corporel sera évalué quotidiennement pour tous les animaux après leur réveil et pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, il est possible que des complications lors de la chirurgie entraine une mise à mort prématurée de l'animal (sous anesthésie). Pour les animaux qui seront réveillés, un amaigrissement normal avec reprise de poids sera attendu dans les 3 jours post chirurgie. Des infections locales pourraient également apparaitre (plaies de grattage au niveau du dispositif).
Devenir
A la fin des procédures les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets. Pour cette raison, les animaux seront mis à mort et nécropsiés à la fin de chaque procédure. Cette nécropsie permettra également de de vérifier la bonne implantation des dispositifs chirurgicaux et la création d'Abaque participant ainsi au raffinement des techniques chirurgicales.
Remplacement
L’entrainement à la chirurgie élémentaire peut être pratiqué sur cadavres et/ou mannequins. Passé cette étape, seule la chirurgie sur animal avec réveil et récupération permet de valider la technique et habilité le personnel. Le recours à l’animal est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été déterminé pour obtenir un bon compromis entre réduction maximale et maitrise des différentes techniques chirurgicales. En fonction de l'atteinte du critère de réussite de manière précoce, le nombre d'animaux pourra être davantage réduit. En utilisant des animaux à des fins de formation, de raffinement, on réduit à terme, le nombre d'animaux utilisés dans les autres projets nécessitant de la chirurgie.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de raffiner les techniques chirurgicales en faisant intervenir un vétérinaire spécialisé dans le domaine pour la formation. Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse (air /isoflurane) et un traitement analgésique sera mis en place tout au long des procédures chirurgicales pour une bonne prise en charge de la douleur. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 ou 3 dans des cages avec enrichissement (matériel de nidification + tube rouge) et habitué pendant 1 semaine avant le début des protocoles.
Choix des espèces
Les souris, les rats et les hamsters sont les animaux que nous utilisons au sein de notre animalerie, dans nos différents projets et la majorité de ces chirurgies est déjà réalisée et maitrisée par une personne suivant la formation (responsable de chirurgie). Afin de raffiner les méthodes et de former d’autres personnes, il est nécessaire de recourir à l’utilisation des espèces utilisées dans nos projets habituels. Jeunes adultes (8 - 10 semaines), ce qui correspond à l’âge moyen auquel les animaux sont utilisés dans nos différents projets où ils sont susceptibles de recevoir une intervention chirurgicale.
Evaluation d’agent de contraste pour l’aide à la chirurgie par imagerie optique NIR-II
- Recherche appliquée
- Cancers
563 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur greffe des tumeurs à des souris immunodéficientes, teste des composés fluorescents censés guider la chirurgie, puis pratique une excision de la tumeur à la joue. Il indique comme nuisances des douleurs et le stress des injections, de la contention et des anesthésies. Il affirme que le projet peut déboucher sur des brevets ou une start-up et qu'il devient "nécessaire" de passer à l'animal après des essais sur œufs de poule embryonnés.
Objectifs
Nous voulons utiliser des composés fluorescents pour l'aide à la chirurgie des cancers. Nos objectifs sont donc de : - Valider le choix des fluorophores dans un modèle animal adapté; - Déterminer les conditions optimales d'utilisation des fluorophores (concentration, dose, délai entre injection et imagerie etc); - Comparer les propriétés des nouveaux fluorophores avec celles de fluorophores déjà utilisés chez l'homme - Réaliser la preuve de concept in vivo de l'aide à la chirurgie dans un modèle adapté.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer l'intérêt et le potentiel des nouveaux fluorophores dans l'aide à la chirurgie des tumeurs, ainsi que leurs avantages par comparaison avec les standards utilisés en clinique. Cette preuve de concept pourrait entrainer de nouveaux brevets, ou favoriser la création d'une start-up basée sur cette technologie.
Procédures
Pour l'éude de pharmacocinétique : prélèvement sanguins sur animaux vigiles : maximum 7 prélèvements sur 24h, maximum 48h. (9 prélèvements au total dans le cas extrême). Pour l'étude de l'aide à la chirurgie: excision tumorale au niveau de la joue de l'animal; 1 seule fois, 15 minutes maximum d'opération.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, orthotopiques et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies.
Devenir
Euthanasie sous anesthésie générale gazeuse (Isoflurane 4%) de l'ensemble des animaux avec prélèvements de pièces anatomiques/organes/sang.
Remplacement
Ce projet a été initié au laboratoire en 2016. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les propriétés optiques des composés ont été réalisés par imagerie de gouttes de solution. Nous avons ensuite réalisé des investigations in vitro ainsi que des essais sur des oeufs poule embryonnés. Ceci nous a permis de remplacer un certain nombre d'animaux. Cependant, le projet avance en maturation et nous devons évaluer chez l'animal l'apport de ces fluorophores sur l'aide à la chirurgie. Il devient nécessaire d'utiliser des animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous étudierons seulement 3 fluorophores (seul ou couplés à un anti-EGFR ou à un anti-PD1) contre une dizaine initialement, et ceci sur une partie des animaux. Par la suite, un maximum de 2 de ces 3 fluorophores sera conservé pour les investigations.
Raffinement
Nous utiliserons des souris Nude, qui représentent le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine, permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La croissance des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures
Choix des espèces
Nous développons des composés pour le diagnostic et la thérapie des cancers. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouveaux agents de contraste et de nouvelles thérapies anti-tumorales, et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris nude immunodéficiente est le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine, permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. La méthode utilisée pour induire une tumeur est rapide et reproductible, et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont connues (taille de la tumeur éthiquement acceptable...). C’est également le modèle expérimental robuste et adapté à l'aide à la chirurgie. Souris NMRI nude de 6 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK (Natural Killer) à l’âge de 8 semaines.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine impliquée dans la sénescence et l’inhibition de l’initiation tumorale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur les irradie à faible dose et suit le développement d'adénomes pulmonaires par scanner sous anesthésie, pour tester le rôle protecteur d'une protéine contre le cancer du poumon. Il indique que des difficultés respiratoires sont possibles mais prévoit la mise à mort avant que les lésions ne soient trop importantes. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'effet à l'échelle d'un "organisme entier" et développe en parallèle des organoïdes de poumon.
Objectifs
Le patrimoine génétique de nos cellules est constamment soumis à des stress qui induisent des anomalies. Les cellules se sont dotées d’un arsenal de molécules permettant de réparer ces anomalies. Ces molécules agissent en tant que barrière anti-tumorale. Au cours du processus par lequel une cellule devient tumorale, il est fréquent que plusieurs de ces molécules soient inactivées, et ceci permet l’émergence de mutations. Le but du projet proposé ici est de démontrer qu’un nouvel acteur de ces voies de réparation agit comme une barrière anti-tumorale pour protéger le tissu pulmonaire in vivo. Les résultats obtenus pourraient ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon non à petites cellules reste un cancer fatal et la résistance aux traitements est fréquente. Découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans les mécanismes de protection du patrimoine génétique des cellules et de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur est donc primordial pour accroitre les connaissances et ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer du poumon
Procédures
Les animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie gazeuse. La durée de l’acquisition au scanner est de 2 min et l’anesthésie de 5 min.
Impact sur les animaux
Les souris seront irradiées à des doses faibles ce qui réduira le risque d’affecter les épithéliums à fort taux de renouvellement tels que la muqueuse intestinale. Des difficultés respiratoires seront possibles du fait du développement d’adénomes dans le tissu pulmonaire mais le protocole prévoit une mise à mort pour analyse des tissus avant que les lésions ne soient trop importantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus pulmonaires.
Remplacement
Jusqu’à présent ce projet a été mené sur des lignées de cellules humaines in vitro. Afin de démontrer le rôle anti-tumoral du gène d’intérêt dans l’objectif de publier ces résultats, il est nécessaire de démontrer l’effet à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience sera suffisant pour permettre une interprétation statistique des résultats. L’utilisation d’un appareil d'imagerie de type scanner permettra de suivre l’évolution des lésions de manière longitudinale sur les mêmes groupes d’animaux et d’éviter le maintien inutile d’animaux en souffrance respiratoire. La mise en place de procédures pilotes contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés pour la phase expérimentale.
Raffinement
Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des souris permettra d'éviter toute souffrance, en particulier l'aspect des poils, la prostration, des difficultés respiratoires et l’isolement social seront les paramètres majeurs pris en compte. L’analyse par imagerie ainsi que les procédures d’inhalation seront réalisées sous anesthésie. De la nourriture hydratée sera fournie aux groupes de souris irradiées. Les expériences de détermination de la dose des irradiations à utiliser seront menées de façon séquentielle. Si la première dose donne des résultats satisfaisants, nous ne procéderons pas avec le 2ème test. En parallèle nous établissons des cultures organoïdes de poumon. Il s’agit de cellules primaires dérivées des animaux, maintenues et propagées en culture tridimensionnelle. Nous testerons si les réponses sont similaires in vivo et ex vivo. Le cas échéant, nos futures expériences pourraient être réalisées sur organoïdes.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère comportant le plus grand nombre d'outils génétiques développés (technologie de transgénèse . Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis. Les expériences seront réalisés sur des animaux adultes
Caractérisation d’un modèle de souris mutante de déficience intellectuelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur étudie une lignée porteuse d'une mutation liée à une déficience intellectuelle humaine, au moyen d'une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en Y, rotarod, mesure de la force musculaire, reconnaissance sociale et réponse à des stimuli sonores jusqu'à 110 décibels. Il indique comme effets un stress d'isolement et des douleurs modérées, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour analyse du cerveau. Il affirme que le modèle souris est "nécessaire" pour étudier la mutation à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les déficiences intellectuelles (DI) se caractérisent par des limitations significatives du fonctionnement intellectuel et des comportements inadaptés, qui impactent de nombreuses aptitudes sociales et pratiques quotidiennes. Ce handicap se manifeste avant l'âge de 18 ans et touche 1 à 3 % de la population générale. En France, cela représente environ 3,5 millions de personnes dont Le spectre des handicaps varie considérablement d'une personne à l'autre, allant de symptômes légers à sévères. L'apprentissage et la mémoire sont des processus nécessaires pour que les individus développent un fonctionnement intellectuel et un comportement adaptatif indispensables à une vie normale, ils sont associés à des processus moléculaires complexes au niveau des cellules nerveuses. Nos collaborateurs cliniciens ont identifié une mutation rare d’un gène chez des patients atteints de déficience intellectuelle. Les patients sont tous de sexe masculin et sont issus de familles consanguines. Ainsi, nous avons généré une lignée de souris avec la même mutation du gène humain et notre objectif est d’étudier les effets de cette mutation sur les cellules nerveuses ainsi que le comportement des souris, ce qui nous permettra de comprendre comment les effets cellulaires peuvent conduire au déficit intellectuel pour améliorer la compréhension de la maladie et permettre la découverte de nouvelles thérapies. Nous appliquerons, sur notre modèle de souris mutante, une large batterie de tests comportementaux pour évaluer les différentes fonctions cognitives et neurologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre comment la mutation de notre gène d’intérêt conduit à déficit intellectuel décrit chez l’homme. La caractérisation comportementale et moléculaire de la souris mutante sera essentielle pour identifier les déficits des circuits cérébraux causés par la mutation. À l'avenir, ce modèle pourrait être essentiel pour tester la pertinence thérapeutique des cibles moléculaires.
Procédures
Tous les animaux vont être soumis à l’ensemble des protocoles suivants selon l’âge: 9 semaines : implantation sous cutanée de puce pour identification de taille 2x12mm sous anesthésie générale. Durée : moins d’une minute 11 semaines : Etude de l'activité locomotrice dans des cages individuelles pendant 35 heures. 12 semaines : test du labyrinthe en Y, les souris explorent librement pendant 5 minutes. 13 semaines : Live mouse tracker, permet de mesurer le comportement individuel d’animaux en groupe par détection vidéo. Durée : 3 jours et 3 nuits. 14 semaines : *Analyse de l'apparence physique, du poids corporel, des réflexes neurologiques et des capacités motrices sensorielles. Durée : 5min. *Mesure de la force musculaire maximale des membres antérieurs et postérieurs avec une grille. Durée : moins de 5min. * Mesure de la capacité d'un animal à maintenir son équilibre sur un cylindre en rotation. Trois essais de 5min par souris, soit au total 15min. 15 Semaines : Reconnaissance sociale : évalue la préférence d'une souris pour un congénère par rapport à un objet placé dans un compartiment opposé. Le test est effectué pendant 2 jours consécutifs. La durée est de 10min le premier jour et 20min le 2eme jour. 16 Semaines : *Etude des possibles altérations des capacités de filtrage de l’information des animaux : différents stimuli sonores (entre 65 et 110dB) pour une durée maximale de 40ms sont aléatoirement émis et les réactions de l’animal sont enregistrées. La session dure environ 48min. *Etude des capacités de conditionnement aversif : Les animaux sont placés dans une enceinte avec des stimuli acoustique et visuel, d’une durée de 20 sec. La dernière seconde où les stimuli sont présentés, un choc électrique d’intensité modérée (1sec, 0.4mA) est délivré à la souris par le plancher. La durée est de 6min 20sec le premier jour et de 14min le deuxième jour. 17 semaines : *Etude de la sensibilité thermique : Placement de l’animal sur une plaque chaude, ne provocant pas de brulure, retrait de l’animal dès la première réaction de douleur d’une des pattes arrière (par exemple léchage ou soulèvement brusque…). Le temps maximum est de 30sec. * Etude de la sensibilité plantaire aux chocs électriques : détermination de la non-altération des capacités des souris à percevoir un choc électrique plantaire d’intensité modérée. Durée totale est de 4 à 5min par souris. 18 semaines : un prélèvement sanguin à la veine temporale superficielle sera appliqué à toutes les souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liées aux procédures expérimentales qui seront appliquées aux souris, et sont: le stress de l’isolement, douleurs modérées et contention et prélèvement sur animal vigile. La prise en charge de chaque nuisance est prévue.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale pour l'analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Une partie de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre du déficit intellectuel ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.
Réduction
Au total 24 animaux seront nécessaires à ce projet. Pour réduire le nombre d’animaux et éviter tout doublon, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les tests comportementaux et l'étude des structures cerebrales. Le nombre de souris utilisées dans cette étude a été calculé en tenant compte notamment de la variabilité inter-individus mais également pour l’application de tests statistiques adéquats : le test t de Student ou le test de MannWhitney selon la normalité des données.
Raffinement
Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Une anesthésie gazeuse sera appliquée lors de la procédure d’identification des souris par puce électronique.
Choix des espèces
Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre du deficite intellectuel. Les animaux seront agèes de 9 semaines environ au début des tests comportementaux, afin d'étudier des animaux adultes.
Etude de l’origine des cancers pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, pour étudier l'origine et la progression des tumeurs selon le rôle d'une protéine. Il indique que les souris développent une maladie pulmonaire avec des difficultés respiratoires en stade avancé, et fixe des points limites sur le rythme respiratoire. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer les facteurs modulant l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine des tumeurs (alvéolaire ou broncho-alvéolaire) en utilisant des modèles murins exprimant la mutation KRAS caractérisés dans la littérature. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que CD98hc module l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine alvéolaire ou broncho-alvéolaire des tumeurs. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus. Des demandes d'autorisation expérimentale sur l'animal ont été préalablement accordées pour caractériser le rôle de CD98hc dans l’apparition et la progression des cancers pulmonaires. Les résultats obtenus suite à cette étude ont permis de mettre en évidence une expression différentielle de CD98hc dans les cellules broncho-alvéolaires ou alvéolaires.
Bénéfices attendus
L’adénocarcinome pulmonaire est un cancer très agressif, dont l’espérance de vie à 5 ans est d’environ 5%. De plus, les cancers exprimant une mutation KRAS sont réfractaires aux traitements anti-cancéreux actuels. Ainsi, trouver un traitement est primordial pour soigner ces cancers. CD98hc a été décrit comme étant impliqué dans l’initiation et le maintien des leucémies. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de CD98hc dans l’initiation et la progression des adénocarcinomes pulmonaires dépendants de KRAS et la survie des cellules cancéreuses. Cette étude in vivo va nous permettre de mieux comprendre le rôle de CD98hc en fonction non seulement de l’origine des tumeurs mais également du génotype tumoral. De plus, comme CD98hc est une protéine transmembranaire pouvant être inhibée in vivo par l’utilisation d’anticorps anti-CD98hc, cela pourrait représenter une cible de choix dans le traitement des cancers pulmonaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - anesthésie (procédure 1) 20 min - instillation intratrachéale (procédure 1 ), 1x 1 minute environ - injection intrapéritonéale (procédure 2/3) , procédure 2: 5x 1min. procédure 3: 1x 1min - prélèvement sanguin (procédure 1 et 2), pour le modele KRAS/P53 uniquement, tout les 15 jours, 200ul de sang, temps d'intervention: 5min.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un cancer pulmonaire avec les nuisances liées a cette pathologie comme une difficulté respiratoire en stade avancé. Cette difficulté respiratoire s'observe par un ralentissement et un changement de la respiration (accélération ou ralentissement). Au moindre signe de détresse respiratoire et/ou de douleurs associées (prostration), les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
Les lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum en utilisant la méthode statistique prédictive de Monte Carlo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (10 animaux pour l’étude statique (les resultats seront analysés avec un t test corrigé (logiciel Prism)) et 10 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.
Raffinement
Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis quotidiennement . Les points limites ont été définis comme suit : -Respiration rapide > 250 bpm (compter pendant 1 minute les mouvements de la cage thoracique). -Respiration lente < 80 bpm -Suffocation : la souris ne peut plus respirer, les mouvements de la cage thoracique sont amples. -Halètement (à confirmer 20 minutes plus tard) : La respiration est forte et saccadée.
Choix des espèces
La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ces modèles permettent une très bonne approche des processus impliqués dans l’initiation et la progression tumorale. L'inhibition de CD98hc dans ces modèles se fera soit par adénovirus soit en croisant ces modèles avec les souris K14 et K19 et injection de Tamoxifen 4OHT. Nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 8 semaines (souris adultes).
Elevage d’un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (projet multi-site 1/2)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
21 696 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie destinée aux croisements et à la production, les surnuméraires étant tués. Le porteur élève un modèle d'un nanisme héréditaire humain et génotype chaque animal par biopsie de la queue ou de l'oreille. Il indique qu'environ 30 % des souris homozygotes meurent dans les 48 premières heures de vie et 10 % développent des complications sévères comme une hydrocéphalie ou des troubles respiratoires, les survivantes pesant jusqu'à 30 % de moins que les autres. Il affirme qu'aucune démonstration n'est possible sans "modèle animal" de la maladie.
Objectifs
Le but de ce projet est de produire des lots d'un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. Ces lots seront utilisés afin de développer un traitement contre cette maladie. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme à plusieurs niveaux. Actuellement, il n’existe pas pour cette maladie de traitements qui restaurent une croissance osseuse et qui permette donc aux patients de grandir mais surtout qui élimine les complications dues à cette pathologie. Ce projet pourra donc offrir à long terme un traitement pour soigner cette maladie. De plus, cette maladie étant encore peu connue, ce projet permettra à court terme de mieux comprendre sa physiopathologie grâce au modèle de souris malades.
Procédures
Les souris d’intérêt seront détectées par génotypage à partir d’une biopsie caudale (prélèvement de 1 à 3 mm) prélevée avant le sevrage des animaux (tissus moins ossifiés, réaction à la douleur moindre) ou d’une biopsie d’oreille prélevée après l’âge de 14 jours (fin de développement des oreilles). Chaque souris produite sera génotypée et ne subira donc qu'un prélèvement unique (2 prélèvements pourront être effectués maximum par animal en cas de problème de génotypage) ; nous procéderons donc à 21696 prélèvements pendant les 5 ans du projet.
Impact sur les animaux
Les souris hétérozygotes n’ont pas de phénotype apparent, contrairement aux souris homozygotes qui présentent un phénotype dommageable. Les complications surviennent de façon chronologique et si les animaux survivent les premières semaines, ils restent modérément atteints. Environ 30% des animaux homozygotes meurent dans les 48 premières heures de vie et environ 10% développent des complications sévères (hydrocéphalie, pectus excavatum, troubles respiratoires) dans les 3 premières semaines de vie. A la naissance, les souris homozygotes sont identifiables par leur petite taille et un tronc raccourci. A l’âge de 4 semaines, elles pèsent environ 20% de moins que les souris sauvages. A l’âge de 8, 12 et 16 semaines, leur poids est environ 30% inférieur à celui des souris sauvages. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique à ce projet.
Devenir
Les animaux seront soit utilisés pour les expériences, soit pour les croisements, ou soit utilisés pour réaliser des fecondations in vitro. Les animaux restants seront sacrifiés (animaux surnuméraires, non utilisés pour les expérience, ou trop âgés).
Remplacement
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de SEDc, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. De plus, et afin de répondre à ces besoins, l’optimisation des croisements permettra d’utiliser peu d’animaux avec la garantie d’un rendement maximum et de résultats homogènes.
Raffinement
Les points limites sont observés pendant toute la durée du projet. Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille interne d’évaluation. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification).
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est largement bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de celui-ci un modèle de choix fiable pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats valables pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les demandes et les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi en expérimentation. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Pour la production d’animaux expérimentaux, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être utilisés dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être utilisées.
Programmation de bactéries comme agents thérapeutiques contre le cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe des tumeurs sous la peau, dans le côlon ou dans la rate, puis les infecte par des bactéries modifiées censées libérer des molécules anticancéreuses au contact de la tumeur. Il indique que la greffe et la croissance tumorale peuvent provoquer perte de poids, prostration et perte de poils en fin d'étude. Il affirme qu'aucune alternative en laboratoire ne permet de faire croître une tumeur tout en conservant la diversité de ses cellules.
Objectifs
Le projet consiste en une étude chez la souris, d’utilisation de bactéries non pathogènes issues de la flore intestinale, comme agents thérapeutiques anti-cancéreux. Dans ce but, les bactéries sont modifiées afin de libérer au niveau de la tumeur des molécules chimiques anti-cancéreuses. Ce projet sera réalisé dans deux modèles tumoraux : cancer colorectal et le fibrosarcome. Dans le cadre de nos recherches, nous avons travaillé sur la modification de lactobacilles qui, par leurs caractéristiques, se présentent comme une thérapie prometteuse. Notre objectif est de réaliser une étude d’infection par ces modèles bactériens afin de démontrer que leur utilisation est possible pour atteindre différents types de tumeurs et développer des molécules thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
La biologie permet aujourd’hui de concevoir et construire de nouveaux outils qui peuvent être utilisés afin de produire des composés d’intérêt ou de détecter des molécules (marqueurs ou contaminants environnementaux), d’assainir l’environnement et de créer de nouvelles thérapies. Notre projet s’inscrit dans ce dernier domaine et a pour objectif de développer de nouveaux modes de thérapie anti-tumorale. Les résultats attendus sont : (i) la validation de bactéries non pathogènes en tant qu’agent thérapeutique, (ii) la démonstration de l’efficacité anti-cancéreuse des molécules libérées par les bactéries au site tumoral et (iii) l’absence d’effets secondaires tels que ceux observés lors de chimiothérapies ou immunothérapies.
Procédures
Les animaux vigiles pourront être soumis à 3 types de procédures : - Greffe sous-cutanée, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 1) ou - Greffe intra caecale, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 2) ou Greffe intra splénique, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 3).
Impact sur les animaux
La procédure de greffe, le développement tumoral ou encore l’induction de molécules anti-tumorales peuvent entraîner : une perte de poids ou des effets indésirables chez les animaux tels que : prostration, dos courbé, ou perte des poils. Ces signes ne devraient apparaitre qu’en fin d’étude. Les animaux faisant l’objet d’un dépassement des points limites ou présentant des signes de souffrance clinique irréversibles seront systématiquement euthanasiés et sortis de l’étude.
Devenir
Tous les animaux ayant fait l’objet d’une des procédures seront euthanasiés par inhalation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale, réalisée par du personnel formé et compétent.
Remplacement
- « Remplacer » les modèles animaux : pour ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative en laboratoire permettant de faire croître une tumeur isolée à partir d’une lignée cellulaire tout en maintenant la diversité des cellules qui composent cette tumeur.
Réduction
« Réduire » le nombre d'animaux en expérimentation. Nous avons prévu prévu de réaliser une étude pilote puis d'utiliser un nombre minimum mais suffisant d’animaux pour garantir l’obtention de résultats pertinents et utilisables pour la génération de nouvelles thérapies bactériennes anti-cancer.
Raffinement
« Raffiner » la méthodologie utilisée, ce qui implique les notions d’élevage en milieu enrichi et de points limites (critères d'interruption de l’expérience). Afin d’améliorer la qualité de vie des souris, elles seront hébergées dans des cages d’une superficie de 500cm2. La litière sera enrichie avec des frisottis ou des carrés de cellulose. Nous porterons une attention particulière au bien-être de nos animaux qui feront l’objet d’un suivi quotidien. Pour les greffes de lignées de cellules cancéreuses, toutes les mesures d’asepsie, d’anesthésie, d’analgésie et de confort lors du réveil des souris, seront prises. Les souris seront ensuite traitées par les bactéries qui seront injectées par voie intra-tumorale, intraveineuse ou orale. L’évolution des traitements sera suivie par imagerie. .
Choix des espèces
L’étude de l’effet des thérapies bactériennes y compris sur le système immunitaire se fera sur des souris immunocompétentes C57Bl/6 greffées avec différents modèles tumoraux (colon et fibrosarcome). Les souris seront réceptionnées à l’âge de 4 semaines puis greffées 1 semaine plus tard (temps d’acclimatation minimum après réception).
Etude de la libération de dopamine sous-corticale induite par le THC chez des souris mutantes pour le récepteur aux cannabinoïdes CB1 (CB1-E134G)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les souris étant tuées avant tout réveil. Le porteur mesure la libération de dopamine dans leur cerveau par microdialyse intracérébrale pendant environ quatre heures, après administration de THC, pour étudier le rôle d'un stéroïde dans les effets du cannabis. Il indique que les seuls effets possibles tiennent à l'anesthésie, maintenue jusqu'à la mort. Il affirme qu'aucune modélisation ne rend compte de cette complexité et juge "nécessaire" un modèle mammifère proche de l'homme.
Objectifs
Le but de notre projet de recherche est de mieux comprendre le rôle physiologique du stéroïde pregnénolone (PREG) dans la régulation CB1 impliquées dans les effets du cannabis. Notre stratégie est d'utiliser des souris génétiquement modifiées (CB1-E134G) dans lesquelles le site de liaison de la PREG a été perturbé. Le projet a pour but de mesurer la libération de dopamine dans le cerveau des souris « Knock-in » CB1-E134G en comparaison de souris exprimant un récepteur non muté (Wild-type, WT). Ces mesures de dopamine seront réalisées de base et en réponse à différents traitements pharmacologiques associé au THC (composé psychoactif du cannabis) dans différentes régions cérébrales. Plus particulièrement, la dopamine sera dosée par microdialyse intracérébrale couplée à la chromatographie à haute performance en phase liquide à détection ampérométrique, chez la souris anesthésiée.
Bénéfices attendus
Ce projet peut avoir comme bénéfices de mettre à jour les mécanismes cérébraux impliqués dans la régulation endogène mise en jeu dans les effets addictifs et toxiques du cannabis chez l’homme.
Procédures
Une seule procédure est utilisée dans ce projet. Cette procédure sans réveil se fera sous anesthésie générale. Cette intervention durera environ 4 heures.
Impact sur les animaux
La procédure entraînera peu d’effets indésirables pour l’animal. Les seuls effets indésirables possibles pourraient survenir à l’induction de l’anesthésie, voire durant le maintien de celle-ci (au maximum pendant une durée de 4h).
Devenir
A la fin de la procédure 1, la mise à mort sera faite par une personne habilitée par injection létale de pentobarbital sodique (Exagon, 300mg/kg) et de lidocaïne (Lurocaïne 30mg/kg) (volume d’injection 10ml/kg).
Remplacement
Les études in vivo sont nécessaires pour la compréhension de la physiologie et pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notamment, l’utilisation d’animaux est nécessaire pour étudier la physiopathologie in situ de systèmes endogènes (l’action de la pregnénolone sur CB1) comprenant l’ensemble de leurs régulateurs et de leurs effecteurs. La complexité des mécanismes étudiés (l’étude des modifications de l’activité des neurotransmetteurs) ne permet pas de travailler uniquement sur des cellules et aucune modélisation mathématique ne peut rendre compte à ce jour de cette complexité. Aussi, l’espèce sélectionnée doit avoir une physiologie et un métabolisme le plus similaire possible à celui de l’homme. Ces raisons justifient l’emploi d’un modèle mammifère.
Réduction
Sur la base d’études préalablement réalisées au sein du laboratoire, nous utiliserons 16 animaux par groupe (8 mâles et 8 femelles), ce qui permettra de pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes
Raffinement
Les procédures expérimentales seront développées de façon à réduire au maximum l’inconfort des animaux. Les souris seront hébergées dans une pièce dédiée, sous environnement contrôlé, et seront sous la prise en charge de personnes formées et compétentes. Les souris seront hébergées en cage collective, et seront mises en cage individuelle seulement pour les procédures qui nécessitent ce type d’hébergement. Les cages seront transparentes, et rapprochées les unes des autres permettant de maintenir des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement permettra de réduire l’ennui et le stress. Dans le cadre du suivi du bien-être des animaux, il y aura une observation accrue des animaux et si nécessaire, une modification du protocole adaptée à l’état de l’animal sera mise en place.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisées en neuropharmacologie expérimentale pour les études biochimiques et comportementales du mécanisme d’action des médicaments psychotropes et des substances susceptibles d’appartenir à cette catégorie. De plus, l’organisation du cerveau de cette espèce est très proche de celle du cerveau humain, et une littérature extensive et croissante permet une bonne planification des expériences. En particulier, la souris permet une modélisation par délétion génique (souris transgéniques), et une étude approfondie des facteurs impliqués dans la physiopathologie des affections neuropsychiatriques citées précédemment. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie).
Etude du microenvironement dans les cancer pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, puis administre des injections répétées pendant deux mois pour étudier si la rigidité de la tumeur modifie la réponse à l'immunothérapie. Il reconnaît que sa manipulation peut augmenter la dissémination des métastases et fixe un point limite à 10 % de perte de poids. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer si la modulation de la rigidité matricielle impacte la réponse des cancers pulmonaires aux immunothérapies et ce de plusieurs façons : 1)Soit en inhibant notre protéine d'interet (impliquée dans le remodelage de la matrice extracellulaire) au niveau des cellules tumorales à l’aide des modèles KRASG12Dfl/+ et KRASG12Dfl/+, p53fl/fl. Ces modèles sont très bien documentés et bien caractérisés. 2)Soit en inhibant cette protéine au niveau des fibroblastes pulmonaires à l’aide du modèle FSP1Cre. Ce modèle a été très bien décrit. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que la modulation du microenvironement matriciel pourrait impacter la réponse de ces cancers à l’immunothérapie. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus.
Bénéfices attendus
L'immunothérapie est une arme thérapeutique actuellement en plein essor dans le cancer du poumon. Néanmoins, bien que prometteuse pour certains patients, une grande majorité de patients ne répondent pas ou peu à l'immunothérapie. Notre projet, base sur des résultats préliminaires solides permettrait de mettre en évidence un levier thérapeutique potentiel. Non seulement CD98hc pourrait être un marqueur de résistance mais aussi une cible thérapeutique potentielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - instillation intratrachéale (1x au début de l'expérience - durée de l'intervention: 2 minutes) - injection intrapéritonéale (2x par semaine pendant 2 mois- duréee de l'intervention 1minute) - prélèvement sanguin (toutes les deux semaines pendant 2 mois - durée de l'intervention: 10 min) - injéction sous-cutanée (1x au début de l'expérience- durée de l'intervention: 10 min) Pour chaque intervention les animaux seront anesthésiés afin de diminuer le stress.
Impact sur les animaux
Il a été démontré que le "softening de tumeur" pourrait augmenter les metastases. En modulant l'expression de la protéine d'interet dans le compartiment tumoral ou dans le microenvironnement, le risque est une augmentation de la dissemination tumorale dans le groupe controle. C'est pourquoi nous allons suivre les cellules tumorales circulantes régulierement et analyser les differents organes en coupe histologique. Le marque mTmG pourrait également etre utile dans la détection des métastases.
Devenir
A la fin de l'étude, nous devons analyser la taille, le nombre et le grade des tumeurs pulmonaires. Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation de lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum (analyse statistique prédictive selon la méthode de Monte-Carlo). Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (12 animaux pour l’étude statique et 8 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.
Raffinement
Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis périodiquement à l’aide d’une fiche de score. Toute alteration de la respiration (plus rapide, plus lente), ainsi qu'une perte de plus de 10% du poids de la souris sont considérés point limite entrainant la mise a mort de l'animal.
Choix des espèces
La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ce modèle permet une très bonne approche des processus impliqués dans la l’initiation et la progression tumorale. Dans cette étude, nous utiliserons des souris agées d'au moins 3 semaines.
Création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 700 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, destinées à d'autres protocoles selon leur phénotype, celles n'ayant pas le profil recherché étant tuées. Le porteur croise deux lignées génétiquement modifiées pour obtenir des souris exprimant une molécule d'étude sur leurs lymphocytes T. Chaque petit est identifié par une boucle d'oreille sous anesthésie, puis phénotypé par prise de sang à la mâchoire ou au sinus rétro-orbitaire. Il affirme que ce passage in vivo est une étape "indispensable" avant le recours aux gros animaux puis à l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle d'une molécule spécifique sur la biologie des Lymphocytes T in vivo. CEtte molécule n’est pas exprimée chez les rongeurs, nous avons donc fait modifier génétiquement des souris de fond C56BL/6 afin que l’expression son expression soit sous le control du promoteur du CD3e, ainsi tous les Lymphocytes T exprimeront la molécule d'étude. Son ligand, est une molécule ubiquitaire, présent chez la souris mais la protéine étant légèrement différente, nous avons choisi de faire développer des souris hybrides exprimant la portion extracellulaire de la version humain du ligand tout en gardant la portion intracellulaire de la version murine de cette molécule. Cette souris « hybride » a également été créée sur un fond C56BL/6. Nous souhaitons désormais croiser ces 2 lignées pour obtenir des souris Hybrid pour le ligand exprimant également la molécule d'étude.
Bénéfices attendus
Une fois obtenues, ces souris seront incluses dans des projets ou le système immunitaire sera chalengé et le rôle de notre molécule d'intérêt sera évalué grâce au développement d’Ac bloquant spécifiquement l’interaction de la molécule à son ligand (version extra cellulaire humaine et intracellulaire murine) et déjà validés in vitro.
Procédures
Lors du sevrage, les souriceaux seront identifiés par la mise en place d'une boucle d'oreille numérotée. Pour cette mise en place l'animal reçoit une dose de charge d’Isoflurane. En fonction du caractère récessif ou dominant des modifications génétiques, et du génotype des parents les petits seront ou non phénotypés par analyse des cellules sanguine. Cette prise de sang sera réalisée soit, sur des animaux vigiles au niveau mandibulaire ou sur des animaux anesthésiés au niveau du sinus rétro-orbitaire sur animal anesthésié et ayant reçu une goutte de Tétracaine 1% .
Impact sur les animaux
Ce nouveau phénotype ne devrait pas engendrer d’effet nuisible pour les souris
Devenir
Les souris issues de l’élevage seront incluses dans des expériences en fonction de leur phénotype ou bien sacrifiées si le phénotype escompté n’est pas obtenu.
Remplacement
Des données préliminaires in vitro ont été obtenues mais le rôle exact de la molécule que nous étudions n’a pas encore été totalement clarifié. Un passage à l’in vivo dans des souris génétiquement modifiées pour exprimer les molécules d’intérêts permettra de mieux comprendre le rôle de ces molécules et les conséquences de leur blocage spécifique. Il s’agit d’une étape indispensable avant le passage aux gros animaux puis à l’homme.
Réduction
L’élevage sera dimensionné en fonction des expérimentations prévues.
Raffinement
Les couples seront hébergés dans des cages contenant des frisottis papiers et du coton leur permettant la nidification. Une fois sevrées, les souris seront hébergées dans des cages contenant des frisottis papiers. Une surveillance journalière par les animaliers nous permettra de surveiller que les souris n’ont pas de phénotype dommageable. La prise de sang pour phénotyper les souris sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 4%/air comprimé) en ayant préalablement déposé une goutte de Tétracaïne 1% collyre.
Choix des espèces
Les souris issues de cette nouvelle lignée seront ensuite incluses dans des protocoles que nous maitrisons pour questionner le système immunitaire. La molécule d’intérêt pourra ou non être bloquée à l’aide d’Ac spécifiques pour questionner son rôle dans différentes situations expérimentales mettant en jeux le système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5-6 semaines pour maintenir l’élevage
Conception de modèles d’hémopathies malignes chez la souris immunodéprimée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe à des souris immunodéprimées des cellules humaines rendues cancéreuses, puis suit la prise de greffe par des ponctions dans le fémur sous anesthésie chaque mois, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller la perte de poids, une croissance tumorale pouvant s'accompagner de nécrose ou d'ulcère cutané. Il affirme avoir "besoin" d'un "organisme entier" pour étudier le développement des tumeurs et conclut que la souris n'est remplaçable par aucune autre méthode.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la conception de deux modèles de cancer du sang, associés a des altérations chromosomiques, chez des souris immunodéprimées. Pour cela les souris recevront des cellules humaines exprimant, après manipulation, des acteurs clés de la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse. Ce projet se déroulera uniquement après validation in vitro du caractère cancéreux des cellules générées afin de limiter le nombre d'animaux nécessaires à ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra pour la première fois le développement de deux modèles de cancer du sang associés à des altérations chromosomiques. En mettant à jour le rôle clé de certaines molécules, iIl pourrait mettre en évidence de nouvelles combinaisons thérapeutiques. pour ces deux cancers.
Procédures
La greffe chez les souris recevant une injection par voie retro-orbitale sera suivie par ponction médullaire tous les mois. En pratique les souris sont anesthésiées sous anesthésie gazeuse, après désinfection à l'alcool de la patte, un trou est effectué dans le fémur, la ponction s'effectue par aspiration dans ce trou à l'aide de seringue . Au moment opportun les souris seront sacrifiées par dislocation cervicale pour être disséquées
Impact sur les animaux
La prise de greffe devra etre surveillée car elle peut engendrer une perte de poids importante et rapide et une modification du comportement des animaux. Une croissance tumorale en sous-cutanée peut etre également associée à une nécrose/ulcère de la peau. Ainsi, après toute application d'une procédure, les critères de surveillance généraux seront appliqués : une perte de poids atteignant les 20%, un comportement anormal grave, un arrêt d’alimentation, une baisse de la température corporelle ou un mutisme de plus de 24 h conduiront à un arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’animal sera immédiatement euthanasié.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable à aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Les expériences sur les souris ne sont faites que après avoir testé in vitro les differents ARN non codants et la translocation NPM_ALK. Seuls les « acteurs » ayant un intérêt biologique seront testés sur l'animal. Cette étape est nécessaire en cancérologie car il est crucial de connaitre le devenir des cellules cancéreuses dans un organisme entier afin d'étudier les risques de genèse, de metastases ou de rechutes après traitement.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études statistiques nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'est pas besoin d'être reproduite.
Raffinement
L'évaluation quotidienne de la souffrance nous permet de déterminer si l'expérience doit être arrêtée. Pour cela des points limites et une methode d'évaluation pour la prise en charge des animaux sont identifiés. Les experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec utilisation d'analgésie.
Choix des espèces
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable par aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Ce modèle expérimental nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés (pour permettre la croissance des cellules humaines). La souches murine de référence pour l’implantation des cellules primaires humaine et les cancers hémathologiques est la souris NSG. Animaux adultes à partir de 6 semaines. L’utilisation d’animaux adultes est justifiée par le fait que les deux hémopathies malignes que nous étudions sont des cancers de l'adulte.