Souris
Mise en place d’un modèle de glioblastome opéré et validation par imagerie de bioluminescence. (EU porteur ; EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur greffe des cellules de glioblastome humain dans leur cerveau par chirurgie stéréotaxique, suit la tumeur par imagerie de bioluminescence sous anesthésie, puis pratique une ablation chirurgicale classée sévère. Il décrit un recours à des analgésiques et un hébergement en cage individuelle après l'opération, qui prive les souris de contacts directs. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne convient car le développement tumoral ne peut être appréhendé qu'in vivo.
Objectifs
Le projet se place dans le contexte clinique du traitement des tumeurs cérébrales très agressives : les glioblastomes. Si la tumeur est accessible, le traitement des glioblastomes commence par une ablation chirurgicale (ou exérèse), suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, l’ablation chirurgicale,ne permet dans la plupart des cas de n’enlever que partiellement la masse tumorale même si le bénéfice est indéniable. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet exploratoire se place dans un contexte de développement de modèles expérimentaux « in vivo » plus proches des conditions observées en clinique chez l’être humain. En effet, aujourd’hui, peu de modèles de glioblastome chez l’animal intègrent le traitement chirurgical de la pathologie. Nous souhaitons donc faire évoluer nos modèles pour nous rapprocher au mieux des stratégies thérapeutiques conduites chez l’Homme. Pour cela, notre laboratoire s’est doté d’un système d’imagerie original nommé « OptiMAX » permettant d’obtenir des images des tumeurs greffées chez la souris en « bioluminescence », c’est-à-dire par émission de lumière. En effet, nos cellules de glioblastome expriment la luciférase (lignées U87-Luc et U251-Luc ) et sont capables d’émettre un signal lumineux, que nous sommes capables de détecter et de quantifier grâce à notre appareil d’imagerie non invasive : ceci permet de suivre la croissance des tumeurs, et de détecter la présence de quelques cellules restantes. Cette technique a déjà été utilisée au laboratoire dans le cadre des projets précédents (Saisine APAFIS #22368-2019100915354084 v4 et Saisine APAFIS #26058-202006050946736 v5 pour les lignées respectivement U87-Luc et U251-Luc). Dans ce projet, l’imagerie par bioluminescence va nous permettre de suivre la première phase de croissance des tumeurs implantées et de définir le meilleur moment pour réaliser l’intervention chirurgicale, puis de valider la présence de cellules tumorales résiduelles après l’opération. Enfin, nous allons pouvoir ainsi caractériser la reprise de la croissance après chirurgie.
Bénéfices attendus
La transposition de la chirurgie d'exérèse (stratégie utilisée classiquement en clinique) et du phénomène de récidive sur modèle animal permettra de se placer dans les mêmes modalités qu'en clinique. La maitrise de cette technique est indispensable pour caractériser par la suite le phénomène de résurgence et évaluer l'implication de l'environnement tumoral dans ce phénomène. Une meilleure compréhension des processus associés à la résurgence tumorale sont indispensable pour le développement ultérieur de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
-Procédure 1: Xenogreffe intracérébrale stéréotaxique de cellules U87-Luc, U251-Luc : réalisé une fois au début de l'étude (durée de 1h) -Procédure 3 : Chirugie d'exerèse tumorale : réalisé une fois au milieu de l'étude (durée 1h)
Impact sur les animaux
Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 3) avec mise en place de soins post-opératoires rigoureux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exerèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes.
Devenir
- Procédure 1 : Xenogreffe intracérébrale stéréotaxique de cellules U87-Luc, U251-Luc : animaux gardés en vie - Procédure 2 : Suivi par imagerie par Bioluminescence : animaux gardés en vie sauf si un des points limites cités précédemment a été atteint ou dans le cas d'un animal satellite mis à mort 3 jours après avoir retiré la tumeur en vue d'analyses histologiques - Procédure 3 : chirugie d'exérèse : animaux gardés en vie
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à la chirurgie d’exérèse de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation de la microglie et des astrocytes, envahissement du parenchyme cérébral, angiogenèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Les données issues des études précédentes (Saisine APAFIS #22368-2019100915354084 v4 et Saisine APAFIS #26058-202006050946736 v5 pour les lignées respectivement U87-Luc et U251-Luc) nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des lignées -Luc citées précédemment implantées en stéréotaxie, en l'absence de stratégie de traitement (groupe contrôle). Les données générées seront donc exploitées et permettront de réduire le nombre d'animaux utilisé dans les séries sans exérèse (5 souris par lignée au lieu des 8 nécessaires dans les séries avec exerèse)
Raffinement
La validation de la chirurgie d'exérèse partielle de la tumeur ainsi que le phénomème de résurgence par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scintifique
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris athymiques présentant une lymphopénie T, sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciltier l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin. George Paxinos, Keith B.J. Franklin, MA, PhD (eds). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 3rd Edition. Elsevier Science Publishing Co Inc, (2007).
Rôle de PRL2 dans le développement de glioblastome primaire et récurrent chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'implantation d'une tumeur cérébrale, sa résection chirurgicale, une irradiation et une chimiothérapie reproduisant le protocole administré aux patients, avec suivi par bioluminescence. Il indique que la tumeur et les traitements peuvent provoquer désorientation, perte d'équilibre, troubles de la mémoire et de l'apprentissage, les animaux étant tués par dislocation cervicale. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule le microenvironnement tumoral et présente l'implantation chez la souris comme "indispensable".
Objectifs
Le projet vise à élucider le rôle de la phosphatase PRL-2 dans le développement de tumeurs cérébrales (appelées glioblastomes) primaires et récurrentes. La famille de gènes des protéines Tyrosine Phosphatases (PTP) comprend plus de 107 gènes dans le génome humain, dont beaucoup jouent un rôle important dans les cancers humains (PTEN et PTP1B). Dans cette famille, PRL-2 a été identifiée comme une protéine oncogène (qui stimule la tumeur) dans de nombreux types de cancer. Supprimer PRL-2 dans les cellules cancéreuses du sein entraîne une diminution de la croissance tumorale. Puisque PRL- 2 est élevée dans le glioblastome, nous avons examiner la contribution de cette phosphatase dans le développement de ce cancer. Nous avons observé que PRL-2 fournit une importante propriété cancéreuse aux tumeurs cérébrales et contribue au faible pronostique de survie chez les patients. L'inhibition de PRL-2 serait alors une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour les tumeurs cérébrales. En utilisant l'implantation des cellules tumorales chez la souris, nous examinons l'agressivité des lignées cellulaires tumorales lorsque l’expression de PRL-2 est modifiée dans la souris (vaisseaux sanguins) ou dans les cellules tumorales. Aussi, après de nombreuses expériences préliminaires in vitro, et in vivo avec nos modèles de greffe de tumeurs, nous voulons valider nos modèles d’étude de radiothérapie et chimiothérapie (traitement temozolomide (TMZ) utilisé chez les patients) sur un minimum d’animaux in vivo pour tenir compte du contexte physiologique, du microenvironnement et répondre à la problématique des chirurgiens. En plus de la chimio-radio thérapie, nous inclurons une resection de la tumeur c'est à dire nous opérerons à nouveau les souris portant une tumeur afin de retirer cette tumeur. La resection tumorale combinée à la radio et chimio thérapie sont le traitement standard des tumeurs chez les patients correspondant au protocole de Stupp. Après ce traitement la majorité des tumeurs ont une récurrence. La proposition de recherche fournira une compréhension plus globale de PRL-2 dans le développement agressif du glioblastome primaire et récurrent.
Bénéfices attendus
Ce projet est en complément d'un précédent projet visant à étudier le role de PRL2 dans le développement de tumeur cérébrale. Ici, nous élargirons nos résultats à des conditions plus proches de ce qui est observé en clinique chez les patient, ce qui constitue un bénéfice pour l'étude du role de PRL2 dans la récurrence des tumeurs cérébrales. Pour cela, nous allons appliquer le protocole thérapeutique des patients, le protocole de Stupp, aux modèles murins. Ce protocole consiste en la resection de la tumeur primaire puis traitement par radio et chimiothérapie. Grace à cette étude, on pourra valider PRL2 comme une nouvelle cible thérapeutique afin d'améliorer le traitement des patients.
Procédures
Injections de tamoxifène en intrapéritonéale pendant 8 jours (moins d'une minute par souris). Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales: une implantation de tumeur (10 min), une resection tumorale (10 min). Irradiation (10min). Injection de temozolomide (2 par jour pendant 8 jours non consecutifs). Suivi par bioluminescence: 6-25 min, une à deux fois per semaine.
Impact sur les animaux
Douleur légère mais répétée d’injections intrapéritonéales avec plusieurs molécules sans effet secondaire pour le tamoxifène. L'irradiation et le témozolomide peuvent induire des symptomes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgies à l’issue des 2 stéréotaxies. Le développement de tumeurs cérébrales peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, désequilibre). De manière générale, chaque manipulation est génératrice de stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale car tous les animaux sont utilisés pour l'impantation tumorale qui conduit aux points limites décrits précédemment.
Remplacement
Nous avons déjà mis en évidence par des tests fonctionnels in vitro que PRL2 est impliquée dans les caractéristiques oncogéniques de cellules de glioblastome humaines. Or, nous savons que le microenvironnement tumoral est une composante essentielle à la régulation de la tumeur. Bien que des tests in vitro existent pour mimer ce microenvironnement, aucun n'est capable de récapituler précisément ce qu'il se passe in vivo. L'implantation de tumeur chez la souris est donc indispensable pour tenir compte de la structure 3D, de la composition chimique, de l'interaction avec d'autres types cellulaires, avec la matrice extracellulaire, avec le flaux sanguin.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées grâce au test Anova car nous comparons en général plus de 2 groupes, c'est donc le test statistique adapté à ce type d'expérience. Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé sur le logiciel R le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre de bons résultats statistiques, et c'est 8 souris pour le Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prevoyons donc 10 souris par groupe pour éviter de finir une expériences avec moins de 8 souris par groupe en cas de problème pendant la procédure. Enfin, femelles et mâles seront utilisés. Par ailleurs, nos modèles murins de tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.
Raffinement
Durant les expériences, nous assurons un confort des animaux (gel sur les yex pour éviter de désèchelent durant l'anesthésie, tapis chauffant pour réguler la température corporelle). Des enrichissements (cocons et maisons rouges) sont placés dans les cages en tout temps et les hébergements sont collectifs. Nous assurons un suivi des animaux tout au long du projet, quotidiennement. Ceci nous permet de prendre en charge toutes les douleurs par une médication adaptée. Pour cela, nous utilisons des points limites spécifiques et adaptés à notre modèle (tumeur cérébrale). Nous procédons selon un arbre décisionnel évitant des souffrances inutiles grâce à des critères d’arrêt de l'expérimentation suffisamment précoces.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle Rag gamma2C-/- car il permet d'implanter des tumeurs humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. La greffe récapitule la tumeur observée chez des patients. Les deux autres lignées murines sont immunocompétentes, elles possèdent toutes les cellules immunitaires. Elles permettent d'etudier le role du microenvironemment dans le développement tumoral. Dans tous les cas, nous utilisons des souris de 7 à 9 semaines (adultes). Les expériences peuvent durer longtemps et nous voulons que le vieillissement n'intervienne pas dans le développement de la tumeur et le maintien en forme des souris.
Evaluation de produits d’immunotherapies exprimant une ou deux molécules thérapeutiques agissant sur le système immunitaire dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit des injections intraveineuses de vecteurs viraux dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, suivies de prélèvements sanguins au même endroit sous anesthésie locale, puis d'une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller l'apparition de fièvre et de lésions oculaires, un œil infecté ou dégradé entraînant la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'apporte le même niveau d'information sur l'expression des molécules in vivo.
Objectifs
Nous nous intéressons au développement de molécules agissant sur le système immunitaire exprimées par des vecteurs viraux notamment pour traiter l’immunosuppression post-sepsis. De nombreuses molécules existent sous forme de protéines recombinantes dont certaines d’entre elles sont déjà en développement clinique dans le traitement de l’immunosuppression post-sepsis. L’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur viral pourrait permettre une expression prolongée, une distribution différente dans l’organisme, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme soluble et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat basé sur un vecteur viral codant pour une molecule agissant sur l’immunité adaptative, administré par voie intraveineuse. Dans le but d’optimiser ce 1er candidat, nous voulons évaluer dans une étude préclinique exploratoire, la possibilité de co-exprimer dans ce vecteur, une molécule agissant sur l’immunité innée avec la molécule agissant sur l’immunité adaptative déjà validée, chez la souris naïve puis dans un modèle murin de souris spécifique de l’immunosuppression induite par le sepsis. Agir à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative pourrait permettre une meilleure restauration du système immunitaire et ainsi diminuer le temps d’hospitalisation, le taux d’infection secondaire et in fine le taux de mortalité post-première infection et/ou seconde infection. Plusieurs candidats ont été développés : un pour chacune des molécules seules et un pour les deux ensembles. L’objectif final est de démonter l’intérêt de co-exprimer deux molécules agissant sur les deux pans du système immunitaire pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis, dans un même vecteur. Cependant, le modèle murin de sepsis utilisé étant classé sévère, il est primordial de vérifier l’efficacité des produits dans des souris naïves au préalable. En effet, si le(s) produit(s) n’avai(en)t pas l’effet escompté sur le système immunitaire, ou que l’ajout de la seconde cytokine s’avérait délétère pour l’activité déjà connue du produit, il ne serait alors pas testé dans le modèle sepsis.
Bénéfices attendus
Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis en restaurant le système immunitaire (réponse innée et réponse adaptative) des patients septiques et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est de monter la pertinence de vectoriser deux molécules dans un même vecteur en prouvant que la molécule agissant sur la réponse immunitaire innée et la molécule ciblant la réponse immunitaire adaptative sont capables de booster le système immunitaire de souris saines. En cas d’obtention de ce résultat, ce candidat sera alors évalué dans le modèle qui mime les deux phases clées du sepsis. Si ce candidat permet de restaurer l’immunosuppression induite chez la souris, il pourrait faire l’objet d’un développement clinique afin d’espérer obtenir une autorisation de mise sur le marché afin de soigner l’immunosuppression chez l’homme dans l’indication du sepsis.
Procédures
1) Préhensions des animaux vigiles (transfert de la cage hébergement à la boite d’anesthésie puis de la boite d’anesthésie sur le plateau de la hotte) : 3 fois/souris (540 animaux et 15 secondes /souris) -2) Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro orbitale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : 540 Souris (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) -3) Application de l’anesthésique en locale : 1 contention pour 432 souris et 2 contentions pour 108 souris (15 secondes/souris/contention) -4) Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitale sur animaux vigiles en contention sous anesthésie locale. 456 souris seront prélevées une fois avec 1 contention (1 à 2 min/souris) 96 animaux seront prélevés deux fois soit deux contentions (2 fois 1 à 2min/souris/contension). -5) Contention de l’animal vigile puis mise à mort des animaux par dislocation cervicale 540 animaux et 30 secondes/souris
Impact sur les animaux
Nos candidats ne devraient pas avoir d’effet delétère sur l’état géneral des animaux. Néanmoins, les animaux seront observés 2 fois après injection des candidats (à 2h et 6h post injection). Si les souris sont prostrées dans la cage et ne réagissent pas à une stimulation, une prise de température sera effectuée. Si une fièvre supérieure à 39°C pendant deux jours malgré un traitement au doliprane persiste pouvant traduire une souffrance, les souris seraient alors mises à mort. les animaux subiront en plus de l'injection du candidat des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétroorbital après anesthésie locale à la tétracaïne.Les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins après anesthésie locale. Les yeux seront donc surveillés tout le long de la procédure, en cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au serum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si à l’observation, une infection bactérienne ou/et une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.Les animaux subiront en plus de l’injection du candidat des prélèvements sanguins après anesthésie locale. Les yeux seront donc surveillés tout le long de la procédure, en cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au serum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si à l’observation, une infection bactérienne ou/et une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort puis le sang et/ou organes sont prélevés nous permettant d’évaluer l’efficacité de notre produit d’immunothérapie. Aucune souris restante à la fin des deux procédures.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la durée et le taux d’expression des molécules 1 et 2 seules ou co-exprimées par les candidats in vivo et de mesurer les activités immunologiques sur différents types cellulaire provenant de différents organes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs.
Réduction
Tout au long du projet, nous essayerons de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le sang de 3 souris/groupe/temps sera prélevé pour suivre le taux des differentes molécules (nombre d’animaux suffisant, basé sur les résultats des procédures précédemment réalisées dans le cadre du projet global), pour limiter le nombre d’animaux. Six souris/groupe sont prévues pour couvrir l’éventuelle variabilité des tests immunologiques (variabilité plus importante pour ces tests immunologiques déjà observée au préalable) et permettre l’analyse statistique (tests non-paramétriques). Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, le nombre d’animaux proposé ici pour chacun des types de tests est le minimum requis pour obtenir un résultat fiable. Dans la procédure 1, l’activité biologique sera évaluée à différents temps afin de pouvoir déterminer le(s) temps d’analyse permettant de voir l’effet biologique optimal de notre candidat. Grâce à cette procédure, nous réduirons le nombre de temps d’analyse pour la suite du projet et donc le nombre de souris utilisées. Si toutefois, le nouveau candidat ne donnait pas les résultats escomptés, le projet serait arrêté (pas de procédure 2). Dans ce projet, pour chaque procédure nous prélèverons post morterm la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.
Raffinement
Mise en place du raffinement dans nos procédure : L’injection intraveineuse de nos candidats est réalisée sur animaux sous anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Tout au long des procédures nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue après injection de nos candidats (2h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de nos produits sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson. Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle animal pour étudier la réponse immunitaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. De plus ces études précliniques nécessitent un grand nombre d’animaux, il ne serait donc pas envisageable de les réaliser dans le modèle de primate non humain pour des raisons éthiques. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité d’un des candidats dans ce modèle murin, il nous semble pertinent de valider le candidat exprimant la molmécule-1 et le candidat coexprimant les 2 molécules dans le même modèle. Ces produits d’immunothérapies sont développés pour être utilisés chez l’homme et ils devraient cibler des patients adultes. Pour rester au plus proche de ce qui sera fait chez l’homme, nous utiliserons des souris d’au moins sept semaines (ayant un système immunitaire suffisamment mature) pour ces études précliniques.
Programme d’immunisation de souris en vue du développement d’anticorps monoclonaux.
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).
Procédures
4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle
Raffinement
Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.
Choix des espèces
La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole
Etude des déterminants moléculaires des effets antidépresseurs induits par la kétamine à l’échelle nanoscopique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de dépression obtenu par corticostérone dans l'eau de boisson pendant cinq semaines, suivi d'injections de kétamine, de chirurgies stéréotaxiques cérébrales et de la pose de canules intracérébrales. Il indique que les animaux subissent une "batterie de tests comportementaux" dont il ne précise pas le détail, avant la mise à mort pour analyser les marqueurs cérébraux. Sur le remplacement, il affirme que la dépression ne peut être reproduite sur des lignées cellulaires et que la souris en offre un modèle proche de l'humain.
Objectifs
La découverte de propriété antidépresseur de la (±)-kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et a suscité l’espoir de nouvelles avancées thérapeutiques. En effet, alors que les antidépresseurs classiques ciblant les systèmes monoaminergiques mettent des semaines à agir et sont souvent inefficaces - 30 % des patients ne répondent pas au traitement - l'administration d'une dose subanesthésique unique de (±)-kétamine provoque des actions antidépresseurs rapides et robustes chez les patients souffrant de dépression pharmaco-résistante. Si ce pouvoir antidépresseur est fermement établi, plusieurs aspects du mode d'action de la (±)-kétamine restent mal caractérisés ou controversés, et son utilisation clinique est limitée par des effets psychomimétiques indésirables sévères. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent son efficacité antidépresseur rapide et ses caractéristiques psychomimétiques afin d’identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique sûre dans les troubles dépressifs. Nous proposons qu'en remodelant l’organisation synaptique des récepteurs NMDA du glutamate (récepteurs majeurs de la neurotransmission excitatrice), la (±)-kétamine modulerait les réseaux neuronaux soutenant la récompense et l'humeur, et soulagerait ainsi les symptômes de la dépression.
Bénéfices attendus
En utilisant une combinaison de techniques d’imagerie de super-résolution, électrophysiologie, de biochimie et de comportement, nous évaluerons l'impact de la (±)-kétamine sur la dynamique, la stabilisation et l’organisation synaptique des récepteurs NMDA dans les réseaux corticaux et hippocampiques. Nous étudierons ensuite comment les redistributions des récepteurs NMDA induites par la (±)-kétamine peuvent soutenir les changements de connectivité au sein des réseaux cortico-mésolimbiques et mettrons en œuvre des tests comportementaux pour établir si moduler l’organisation des récepteurs NMDA aux synapses contrebalance ou imite les actions antidépresseur ou psychotomimétique de la (±)-kétamine.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions: -remplacement de l'eau de boisson par une eau de boisson supplémentée avec de la corticosterone pour generer un stress chronique chimique visant à créer un modéle de depression (5 semaines), qui sera reversé par l'injection intraperitonéale de Kétamine (1 min). -Les animaux subiront une batterie de tests comportementaux pour evaluer la depression et l'impact de la ketamine ou des anticorps bloquant la mobilité des récepteurs sur la depression. (12 jours). -Des injections intracerebrales de virus par chirurgie stéréotaxique (30 min) permettant d'identifier des changements de connections entre les réseaux neuronaux de la depression. -Installations par chirurgie des guides cannules intracérébrales (1h) et injection intracerebrale de molécules visant à manipuler les réseaux neuronaux de la depression (15 min) Avec l'euthanasie, notre saisine contient 6 procedures, mais tous les animaux ne subiront pas les 6 procédures.
Impact sur les animaux
Notre modèle de dépression chez la souris repose sur l’administration chronique de corticostérone dans l’eau de boisson pendant une période de 5 semaines. Ce traitement va donc générer un comportement anxieux et dépressif. Nous mettrons en œuvre également des approches chirurgicales, soit pour injecter des préparations d'ADN, soit pour poser des systèmes médicaux à demeure (canules d’injection) permettant l’injection intracérébrale locale. Ces approches chirurgicales pourront occasionner une gêne associée à la cicatrisation et la récupération post- chirugicale. Toutes ces nuisances sont suivies et pris en charge médicalement quand cela est possible
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux sont maintenus en vie pour participer à une autre procédure ou soient euthanasiés pour réaliser l'analyse des marqueurs moléculres de la depression
Remplacement
La dépression est une pathologie complexe, faisant intervenir plusieurs régions cérébrales et plusieurs systémes de neurotransmetteur. Il est impossible de mimer les changements cérébraux sur des modèles alternatives types lignées céllulaires. Les modèles murins offrent une opportunité unique d'étudier au plus prés de la pathologie humaine la depression
Réduction
Une planification précise des expériences a également été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides (réduction).
Raffinement
Toutes les chirurgies s'accompagnent de l'injection de substances pharmacologiques permettant de réduire durablement la douleur et les souffrances pendant la chirurgie et les jours suivants, pendant la phase de récupération. Le stress des injections intracérébrales (IC) est réduit par une manipulation quotidienne des souris pour l'entretien des guides canules. Les effets secondaires potentiels seront évalués par un suivi des prises alimentaires. Des changements dans l’interaction des animaux avec les expérimentateurs seront contrôlés quotidiennement, 3 jours avant et pendant toute la période des injections. Si ces paramètres varient, ils seront consignés et provoqueront l'arrêt des injections. Les animaux seront maintenus par 4 afin de maintenir le comportement social, pour une cabane transparente rouge et un carré de coton seront ajoutés dans la cage pour enrichir l’environnement. Si nous observons un ou plusieurs des signes cliniques tels que la perte de poids, l'absence d'appétit, l'agressivité anormale à la manipulation, poils hérissé et dos vouté, indifférence par rapport au milieu extérieur). Une fiche de suivi quotidien est initiée pour un suivi sur au moins 5 jours (cf suivi chirurgie). Si les solutions de raffinement telles que le réchauffement de l'animal, l'apport de nourriture ramollie/en gel enrichi en glucose ne changent pas durablement l'état de santé de l'animal durant les 5 jours de suivi, nous procéderons à la mise à mort de l'animal. Le responsable de l'étude est le seul à pouvoir prendre la décision de mise à mort à ce stade.
Choix des espèces
Notre projet utilise des souris C57BL/6J principalement en raison de la forte homologie dans les mécanismes de base de la depression entre l'homme et la souris. Les réseaux neuronaux et les systémes de neurotransmetteurs mis en jeu sont similaire entre la souris et l'homme. De plus, les nombreuses stratégies thérapeutiques actuelles chez l'homme ont été développé ce qui permet d'illustrer la pertinence de ce modèle La depression est une pathologie qui touche tous les ages, sans réelle prépondérence en fonction de l'âge, c'est pourquoi nos études se feront sur les souris adultes (2-4 mois)
Evaluation de l’effet d’une supplémentation alimentaire en poudre de tomate sur le métabolisme, l’inflammation et la résistance à l’insuline dans le modèle d’obésité induite par l’alimentation chez la souris mâle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime riche en graisses induisant l'obésité, complété par une supplémentation en poudre de tomate, avec prises de sang par incision de la queue, perçage des oreilles, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et isolement pour recueil des fèces. Il indique que l'isolement provoque un stress social et que l'incision et le perçage peuvent être douloureux, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'une supplémentation sur la santé métabolique ne s'envisage qu'in vivo.
Objectifs
La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de tomates et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit différents niveaux de stress hydrique et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (6 poudres différentes en tout) puis administrés à 80 souris C57Bl/6J males (8 groupes de 10 souris) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudres de tomate sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors d'un test de tolérance à l'insuline, d'un test oral de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des doses de glucose pendant le test oral.
Devenir
Les animaux de cette prcédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.
Remplacement
L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.
Réduction
Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Rôle des gènes de Salmonella dans la colonisation, la virulence et la persistance de cette bactérie– Développement/Tests d’inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité de Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
6 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une infection à Salmonella par voie orale entraînant perte de poids et diarrhée, complétée par une inoculation par anses intestinales sous chirurgie sans réveil, puis la mise à mort pour prélever les organes. Il précise que les souris de fond génétique sensible sont euthanasiées dès l'apparition de difficultés à se mouvoir. Sur les bénéfices, il affirme que comprendre l'interaction du pathogène avec son hôte est "indispensable" au développement de traitements.
Objectifs
Salmonella est une bactérie pathogène importante en santé publique. Elle est responsable, suivant le sérotype, d’infections systémiques létales, de gastroentérites ou encore d’un portage asymptomatique chez l’homme et les animaux. Chez l’homme, la fièvre typhoïde touche encore 22 millions de personnes chaque année et on estime à 1,3 milliard le nombre de cas de gastroentérites à Salmonella chaque année dans le monde. Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Elle permet
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la fitness et/ou la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à une infection à salmonella par voie orale. Ils pourront ensuite être soumis à des prélèvements sanguins afin d'étudier la perméabilité intestinale, à un suivi par imagerie in vivo. L'inoculation de salmonella sera également réalisé grâce à la méthode des anses intestinales (chirurgie sans réveil).
Impact sur les animaux
Dans le cas de l'infection par voie orale les animaux pouront perdre du poids et développer une diarrhée
Devenir
Mise à mort afin de réaliser le prélèvement des organes
Remplacement
Une caractérisation préalable des gènes est réalisée in vitro pour permettre la sélection des gènes les plus pertinents et pour orienter le choixdes voies d’inoculation à mettre en œuvre
Réduction
L'utilisation du système d'imagerie in vivo permet de suivre les souris au cours du temps et permet donc l'étude de la cinétique de la colonisation sur une même souris là où il aurait fallu les sacrifier à différents temps sans cela. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Une étude statistique est réalisée sur les données brutes d’immunohistochimie ou de FACS obtenues à partir des organes prélevés. Les tests appliqués sont des tests non paramétriques (Kruskall-Wallis one-way analysis of variance suivi d’un Mann-Whitney en post-test). Pour les niveaux de colonisation des organes par Salmonella, les tests utilisés sont des tests paramétriques (ANOVA suivi d’un post-test Tukey-Kramer) car le cumul de l’ensemble des données que nous avons obtenues depuis plus de 10 ans concernant ce caractère montre que ces données suivent une loi normale. Ceci nous permet lorsque nous souhaitons uniquement comparer le niveau de colonisation de plusieurs souches de diminuer le nombre d’animaux pour obtenir la même puissance de test.
Raffinement
Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Dans le cas du modèle de portage, les souris CBA/J ne présentent aucun symptôme. Pour les souris de fond génétique Balb/C ou C57Bl/6, un animal est euthanasié lorsqu’il présente des difficultés à se mouvoir après une stimulation et que l’expérimentateur juge que l’animal décèdera dans la ½ journée suivante c’est-à-dire avant la prochaine visite de l’expérimentateur afin d’éviter toute souffrance inutile. Ceci est rendu possible grâce à l’expérience acquise par l’équipe depuis plus de 15 ans. Les expérimentateurs « novices » travaillent en binôme tant qu’ils n’ont pas acquis l’expérience nécessaire De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lorsque la procédure le nécessite les animaux seront anesthésiés à l’isofurane.
Choix des espèces
La souris est donc particulièrement pertinente pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris puisque nous reproduisons ainsi une infection naturelle. Le modèle gastroentérite a été montré dans la littérature comme reproduisant l’infection et la réponse immunitaire au cours d’une gastroentérite chez le veau, où Salmonella est responsable naturellement d’une gastroentérite. L’utilisation de ce modèle murin de « gastroentérite » est justifiée par rapport au modèle bovin par le moindre coût, la moindre lourdeur et la plus grande disponibilité des animaux. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 10 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature
Amendement du projet 20-107 : Evaluation de l’efficacité d’une thérapie cellulaire basée sur l’édition de génome de lymphocytes T ex vivo pour le traitement d’une immunodéficience primaire dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
203 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cet amendement décrit chez des souris immunodéficientes le développement d'une tumeur à la nuque, une injection sous-cutanée, huit injections intrapéritonéales et cinq séances d'imagerie, avant la mise à mort pour analyser la tumeur. Le porteur teste une thérapie cellulaire par lymphocytes T corrigés contre une immunodéficience humaine. Il indique que l'essai préclinique sur modèle animal est exigé par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant tout essai chez l'homme.
Objectifs
Cet amendement a pour but de modifier le protocole afin d'obtenir une meilleure réponse immunitaire des lymphocytes T. Des tests préliminaires in vitro nous ont indiqué que le Blinatumomab permet d'augmenter la réponse immunitaire des lymphocytes T. Il s'agit d'un anticorps humain bi-spécifique permettant de cross-linker les lymphocytes T avec les cellules pré-cancéreuses. 1 microgramme de Blinatumomab sera donc coinjecté en même temps que l'IL2 à partir de la date d'injection des lymphocytes T. Cet anticorps n'a pas d'effet physiologique chez la souris. L'ajout de cet anticorps n'entraine pas un plus grand nombre de souris à utiliser ni d'injection supplémentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce rpojet permettaont d'évaluer l'efficaicté et l'inocuité d'un nouvrea traitement de thérapie celulaire pour le symdrome de la Pi3kinase activée (APDS1)
Procédures
Une injection sous cutanée, 8 injections intra péritonéale, 5 points d'imagerie non invasive (IVIS Spectrum).
Impact sur les animaux
En l'absence de système immunitaire, une tumeur se développera au niveau de la nuque de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d'étudier le contenu tumoral et l'infiltration des lymphocytes T.
Remplacement
La mise en place d’essais pré-cliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un nouvel essai clinique chez l’homme.
Réduction
Les prélèvements de cellules de patients sont très limités ce qui entraine un faible nombre de souris à utiliser. Des mises au point sur la quantité de cellules permettront d'ajuster le protocole.
Raffinement
Toutes les manipulations induisant de la douleur chez l’animal (injection intraveineuse, injection sous-cutanée) seront précédées par une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 2%). Un collyre à base de tétracaïne sera appliqué sur l’œil après l’injection dans le sinus rétro-orbitaire afin de limiter la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement et nous avons établi des points-limites entrainant l’euthanasie des animaux si nécessaire. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement exempt d’organisme pathogène, et avec une nourriture et une eau stérile. De plus, nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de cotons, de bâtonnets à ronger et de maisonnettes en carton. Ces mesures permettent de maintenir les meilleures conditions de vie et de santé des souris répondant à l’impératif du raffinement.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente NSG est un modèle de choix pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ce modèle est capable de permettre la greffe de tumeurs développées à partir de cellules B-EBV de patients. L’injection de lymphocytes T de ce même patient qui auront été corrigées, permettra de mesurer l’efficacité d’immunosurveillance des cellules corrigées par rapport aux cellules malades non corrigées. Le potentiel d'immunosurveillance est corrélé à la régression tumorale induite par ces cellules. La lignée NSG est commercialisée par Charles River et ne présente pas de phénotype dommageable à l’état basal. Des adultes de 6-8 semaines seront utilisés, un protocole précédemment établi (PMID : 27799161) a en effet permis de déterminer que des souris de cet âge permettent de mesurer le potentiel d’immunosurveillance de lymphocytes T corrigés.
Analyse de l’hypoxie et du pH intra-tumoral par IRM CEST
- Recherche fondamentale
- Oncologie
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit l'inoculation sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines chez des souris immunodéficientes, suivie de séances d'imagerie IRM sous anesthésie, puis de la mise à mort pour prélever les tumeurs. Il indique que la croissance tumorale peut entraîner perte de poids, nécrose ou infection, une perte de plus de 20 pour cent du poids déclenchant l'euthanasie. Sur le remplacement, il affirme que la validation de cette méthode d'imagerie ne peut être réalisée qu'in vivo.
Objectifs
L’hypoxie (baisse de l’oxygénation du tissu) est une caractéristique du microenvironnement tumoral commune à la plupart des tumeurs solides et constitue une source importante de résistance aux traitements de radiothérapie et de chimiothérapie. Décrite comme fluctuante et inhomogène aussi bien dans son intensité que dans sa distribution spatiale, l’hypoxie évolue au cours de la progression de la tumeur. Elle est responsable de remaniements métaboliques qui associés à la faible perfusion des tumeurs entrainent une accumulation d’ions H+ sera la cause majeure d’acidification du milieu extracellulaire au sein de la tumeur. La répartition hétérogène de l’hypoxie et donc du pH au sein des lésions cancéreuses n’est actuellement pas prise en compte en clinique pour générer une stratification des tumeurs en fonction de leur statut hypoxique ou acide conduisant de ce fait au manque d’efficacité de nouvelles thérapies ciblant l’hypoxie. Ainsi pour ce programme de recherche, nous proposons de réaliser dans un premier temps une étude chez la souris porteuse de xénogreffe visant à montrer la capacité d’une nouvelle technique d’IRM par échange chimique et transfert de saturation (IRM CEST) à cartographier et quantifier l’hétérogénéité de l’hypoxie et du pH intra-tumoral pour en faire un outil de stratification des tumeurs. La validation de la méthode d’IRM CEST sera réalisée par l’implantation d’une sonde pH/pO2 en intra-tumoral afin de corréler les mesures avec les observations réalisées par IRM. Si la méthode est validée, une seconde étude sera réalisée. Elle permettra de juger de la pertinence de l’IRM CEST pour l’évaluation de l’hypoxie et du pH au cours de la croissance tumorale en suivant les souris à plusieurs stades tumoraux.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous souhaitons stratifier les tumeurs en fonction de l’hétérogénéité constatée grâce à l’IRM CEST 3D. Ainsi, la caractérisation l’hypoxie tumorale pourrait offrir une opportunité unique de pouvoir sélectionner les patients éligibles aux traitements ciblant l’hypoxie tumorale.
Procédures
Les animaux auront une inoculation de cellules cancéreuses en sous cutané à l'aide d'une aiguille 26G sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 3min). Les animaux auront une ou plusieurs imageries IRM sous anesthésie gazeuse (non invasif).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dans cette étude sont principalement liés à la croissance tumorale (perte de poids, altération de l’état général de l’animal, nécrose ou infection de la tumeur).
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à l'issue des 2 procédures afin de prélever les tumeurs pour des analyses immunohistochimiques complémentaires.
Remplacement
La validation d’une méthode d’imagerie permettant que caractériser et stratifier le tissu tumoral ne peut être réalisée qu’in vivo. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=10) a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Il prend notamment en compte l’hétérogénéité de la prise tumorale (estimée à 80%) afin de garantir un nombre optimal d’animaux permettant une signification statistique à l'étude menée. Le nombre total d’animaux est de 100 souris maximum sur une période de 5 ans. L'étude 1 déterminera la nécessité de faire l'étude 2.
Raffinement
Des méthodes sont utilisés afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, volume tumoral, aspect du point d’injection……). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, le modèle souris immunodéficientes porteuses de xénogreffe de lignée tumorale humaine est adapté pour les études fondamentales et appliquées de développement et traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèles.
Synchronisation de la méiose chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur décrit le gavage de souriceaux dès le deuxième jour de vie, une fois par jour pendant sept à dix jours, suivi d'une injection intrapéritonéale, puis la mise à mort pour disséquer les testicules. Il précise que les souriceaux ne prenant pas de poids par rapport aux témoins, un seuil fixé à 20 pour cent de moins, seront tués. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour étudier la méiose et présente la souris comme "indispensable".
Objectifs
La reproduction sexuée, chez les organismes eucaryotes qui incluent les animaux, nécessite la formation de gamètes (ovocytes et spermatozoïdes) auxquels est transmise la moitié du matériel génétique du parent. La fécondation permet, en réunissant les chromosomes des gamètes de chacun des deux parents, de reconstituer des cellules qui possèdent une paire de chaque chromosome, un exemplaire étant fourni par la mère, l’autre par le père. Nous étudions les mécanismes qui permettent la transmission correcte des chromosomes aux gamètes. Nos projets visent à comprendre le rôle de plusieurs protéines dans ce processus, chez le mâle.
Bénéfices attendus
Nous étudions les mécanismes qui permettent la transmission correcte des chromosomes aux gamètes. Nos projets visent à comprendre le rôle de plusieurs protéines dans ce processus, chez le mâle.
Procédures
sur 234 animaux Gavage : souriceaux à jours 2, 1 fois par jour pendant 7 à 10 jours injection intrapéritonéale : 1 injection à jour 7 à 10
Impact sur les animaux
Inconfort sur l’animal suite à des gavages et des injections intrapéritonéales
Devenir
Animaux mis à mort pour une dissection des testicules pour des études biochimiques, moléculaires et génomiques
Remplacement
Le recours aux animaux est indispensable car il n’existe aucun modèle in vitro pour étudier la méiose. Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. Le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires) mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse. Le protocole proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience.
Réduction
Les protocoles sont optimisés pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires. En particulier, les techniques biochimiques sont revues régulièrement pour réduire la quantité de matériel, et donc d’animaux, nécessaire. Nous estimons que 234 souris seront nécessaires pour mener à bien notre projet.
Raffinement
Aucun des animaux utilisés ne souffrira d’un phénotype dommageable dans nos conditions d’élevage et le traitement qui leur est administré dans une fenêtre de temps précise agira seulement sur les gamètes et n’aura aucun effet dommageable sur les animaux. Ces animaux sont pesés quotidiennement pendant les 7 à 10 premiers jours de traitement, s’ils ne prennent pas de poids par rapport aux animaux témoins (plus de 20% de moins que les animaux non traités de la même portée), ils seront mis à mort.
Choix des espèces
- Le contexte des aspects que nous étudions est bien décrit chez la souris - Cette espèce se prête aux études génétiques grâce aux nombreux modèles déjà existants, et grâce à la possibilité de générer de nouveau modèles génétiques. Les connaissances du génome de Mus musculus sont nécessaires pour nos analyses génétiques et génomiques. - Ce modèle, surtout grâce au protocole proposé, permet des études biochimiques, de plus, beaucoup d’outils existent déjà, notamment les anticorps. Jours 2 à Jours 20 après la naissance. Il s’agit de la période où les souris sont traitées, jusqu’à récupération des tissus. Cet période correspond au moment optimal pour obtenir une population de spermatocytes enrichit dans le type cellulaire que nous étudions.
Amendement du projet #2020102016121286 Approche thérapeutique contre les accidents vasculaires cérébraux dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
394 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime déséquilibré de trois mois suivi d'un accident vasculaire cérébral provoqué chirurgicalement, avec injection de nanoparticules porteuses d'ARN. Il indique que l'AVC peut entraîner perte de poids, mouvements de rotation et mort prématurée, les animaux étant ensuite tués pour prélever les tissus cérébraux. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de l'ischémie ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et qualifie d'"indispensable" le passage à l'animal.
Objectifs
Les complications cardiovasculaires représentent l’une des premières causes de morbi-mortalité chez les patients âgés associant un vieillissement artériel et métabolique. Ce projet s’intéresse particulièrement à une pathologie ischémique dont la prévalence augmente considérablement au-delà de 60 ans : l’accident vasculaire cérébral (AVC). Chez ces patients, les perturbations métaboliques systémiques, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans ces pathologies ischémiques, ciblent en premier lieu la monocouche endothéliale des vaisseaux. De plus, après l’ischémie, ces perturbations créent un environnement délétère qui altère la capacité à développer un réseau vasculaire collatéral nécessaire à la revascularisation post-ischémique. La revascularisation implique des phénomènes angiogéniques, processus de novo qui se produisent lors de l'expansion et la constitution du lit capillaire. Cependant, chez les patients présentant des perturbations métaboliques systémiques à l’origine de pathologies ischémiques, ce processus est nettement altéré. L’initiation d’une réponse pro-angiogénique a ainsi été identifiée comme un challenge thérapeutique chez ces patients. La demande d'amendement de ce projet concerne une mise à mort anticipée à 24h post-AVC et l'abandon d'une procédure. Cette étude permettra d'améliorer le travail préliminaire effectué lors de l'étude précédente (Projet #2020102016121286).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme.
Procédures
Le traitement protecteur sera administré à des souris par voie systémique. Il consiste à injecter des nanoparticules porteuses d’ARN inhibiteurs ciblant une protéine dans l’endothélium. Les souris seront suivies de façon longitudinale tout au long de l'étude et ce dès le début du vieillissement métabolique et artériel induit par un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides. Après 3 mois de ce régime couplé au traitement, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale.
Impact sur les animaux
Un changement de nourriture suivi d'un accident vasculaire cérébral pourront se traduire par une perte de poids et/ou par une mobilité anormale (rotations). Ces nuisances pourront se traduire par une mort prématurée.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude de la protection induite par notre molécule d'intérêt
Remplacement
Après des premières étapes montrant l’intérêt d’éteindre cette protéine de l’endothélium dans un modèle de culture primaire de cellules isolées de sang de cordon humain, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et de son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous possédons des expertises en modèles reconnus de vieillissement vasculaire et d'accident vasculaire cérébral ischémique. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les données seront analysées grâce à un test de Kruskal-Wallis suivi de comparaisons multiples de Dunn.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement analgésique en pré- per- et post-opératoire. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou euthanasié selon le score.
Choix des espèces
Après des premières étapes montrant l’intérêt d’éteindre cette protéine de l’endothélium dans un modèle de culture primaire de cellules isolées de sang de cordon humain, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.
Comprendre la pathophysiologie de la malnutrition sévère aigüe
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Le porteur décrit un modèle de dénutrition sévère chez des souris juvéniles sevrées, avec suivi de poids, prélèvements sanguins et de fèces, puis une phase d'infection par Salmonella provoquant pelage hirsute, prostration et amaigrissement. Les animaux sont euthanasiés à chaque point de la cinétique pour prélever sang, cerveau et intestin. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ni le poisson zèbre ou la drosophile ne conviennent et présente la souris comme un "modèle incontournable" pour transposer à l'enfant dénutri.
Objectifs
Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale. Actuellement les campagnes de re-nutrition n’ont qu’un effet bénéfique transitoire sur la santé des enfants souffrant de dénutrition sévère (Severe Acute Malnutrition, SAM). La rémission nécessite la prise en compte simultanée des paramètres anthropométriques, physiologiques, immunitaires et microbiologiques. Or l'interaction entre la physiologie, le microbiote et l'immunité mucosale reste peu étudiée. En effet, déchiffrer l'interaction des principaux acteurs de l'écosystème intestinal chez les enfants SAM nécessite d'utiliser des méthodes invasives, telles que des biopsies intestinales, chez des enfants déjà affaiblis par la malnutrition. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Actuellement, un obstacle majeur qui limite l’investigation de la SAM, est l'absence d'un modèle animal approprié. Cependant, nous avons réfléchi au développement d’un modèle de souris juvénile qui présenterait de fortes similitudes physiologiques, microbiennes et immunitaires avec les enfants atteints de SAM. Grâce au modèle murin de dénutrition que nous développerons, nous déterminerons comment améliorer les interventions nutritionnelles en 1) identifiant les signatures physiologiques, microbiennes et immunologiques précoces associées à la dénutrition sévère et au régime thérapeutique proposé, et 2) en utilisant ces signatures afin de créer une combinaison de candidats associé au régime thérapeutique (nutriment et ou métabolite bactérien/bactérie bénéfique) qui simultanément améliorerait chaque paramètre. Chez les enfants, les conséquences de la SAM semblent persister au-delà de la première année après la sortie d’hôpital, et une mortalité élevée est toujours associée à de nombreuses infections et entéropathies. Une fois, le modèle de dénutrition et le régime thérapeutique amélioré, nous voudrions tester la susceptibilité des souris dénutries et ou en phase de rétablissement à développer une infection de type entéropathie avec Salmonella enterica Typhimurium.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme: La SAM est une maladie multi-factorielle où la physiologie (reprise de poids, croissance, maturation intestinale pour une absorption des nutriments optimale), l’immunité mucosale et le microbiote intestinal jouent un rôle important dans son développement mais aussi au cours des traitements de re-nutrition avec le RUTF. Chez des enfants déjà affaiblis par la dénutrition, il n’est pas concevable de prélever des échantillons invasifs comme il serait nécessaire de la faire pour étudier la maturation intestinale ou encore le système immunitaire mucosal. Développer un modèle animal approprié est donc nécessaire afin de déchiffrer les principales caractéristiques de la SAM, et de proposer des stratégies thérapeutiques durables. L'importance de l'intégration de méthodologies multidisciplinaires comme nouvelle façon d'aborder la complexité de la physiopathologie de la SAM fait de ce projet un projet phare pour faire avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme: Les résultats de cette étude permettront de fournir de nouvelles approches nutritionnelles qui pourraient être envisagées chez les enfants atteints de SAM. Des stratégies multifactorielles comprenant un RUTF optimisé avec des métabolites bactériens et/ou des bactéries bénéfiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Prise de poids sur animaux vigiles, hebdomadaire. Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement de feces (1 fois à la fin de l'expérience), prélèvements sanguins pour glycémie (procédures 3 et 5), 1 fois à 0, 30, 60 et 90 minutes après administration de la solution de glucose, un prélèvement sanguin de l’ordre de 0,3 μl sera effectué au niveau de la queue). Prélèvements sur animaux endormis: prélèvement sanguin rétro-orbital pour le FITC dextran ( procédures 2 et 6) et 1 fois à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet qui est de suivre l’impact d’une alimentation qui entraine une dénutrition et un régime thérapeutique pouvant contrer cette dénutrition sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux. Ce projet occasionnera des modifications physiologiques sur les animaux. Selon le régime alimentaire apporté, les animaux subiront un ralentissement de croissance ou des hausses de poids. Selon le régime alimentaire apporté, les animaux subiront un ralentissement de croissance ou des hausses de poids. Une fois, le modèle de dénutrition et le régime thérapeutique amélioré, nous voudrions tester la susceptibilité des souris dénutries et ou en phase de rétablissement à développer une infection de type entéropathie avec Salmonella enterica Typhimurium. Pour la procédure impliquant une infection par Salmonella, les symptômes de la maladie seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs: pelage hirsute , yeux tirés larmoyants, miclos, posture anormale, dos rond, prostration).
Devenir
Tous les animaux de toutes les procédures sont concernés par la mise à mort. A chaque point de cinétique déterminé, les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer les prélèvements en vue d’analyses.
Remplacement
L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux. Nous développerons notre modèle sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 21 jours. L’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, tout au long des expériences, les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. Des groupes de 5 souris seront donc étudiés. Les expériences seront répétées de manières indépendantes 3 fois. Cette répartition des groupes a été choisie pour permettre une analyse statistiquement significative des résultats tout en limitant au minimum le nombre de souris. Un maximum de 820 souris seront utilisées sur 5 ans.
Raffinement
La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou hebdomadaires pour le suivi du poids et la consommation des régimes sera réalisés plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La table de souffrance animale (Cf. Annexe 3) indique que lorsque le score est compris entre 0 et 4, aucune procédure spéciale n’est à appliquer considérant normal l’état de « souffrance » des animaux ; un score compris entre 5 et 12, nécessite un renforcement de notre surveillance à 2 fois par jour, et l’administration éventuelle d’un analgésique (buprénorphine voie s.c. 0.1mg/kg) ; enfin un score compris entre 13 et 30 indique une souffrance animale avérée ou sévère et entrainera l’euthanasie de l'animal considéré. Ce score final sera calculé suivant 4 points limites : l’apparence générale, la prise alimentaire et le poids corporel, la détection de signes cliniques et le comportement général. Dans chaque catégorie, un score allant de 0 (RAS) à 4 (état critique ultime) sera établi, générant un score intermédiaire qui sera modifié ou non suivant le critère suivant : si le score est égal à 3 plus d'une fois, ajouter un point. Après dénutrition ou infection, si le score de la table de souffrance animale (Cf. Annexe 3) indique un score compris entre 5 et 12, nous renforcerons notre surveillance à 2 fois par jour, et administrerons un analgésique si besoin (buprénorphine voie s.c. 0.1mg/kg) ; si le score est compris entre 13 et 30 la souffrance animale avérée ou sévère entrainera l’euthanasie de l'animal considéré.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal sont suffisamment proches de celui de l’Homme afin d’utiliser la souris comme modèle fiable avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les LysoDC ont été les mieux caractérisées. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Les animaux utilisés seront des souris males âgées de 21 jours. L’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. C'est donc lors de cette fenêtre particulièrement sensible que se joue le développement en bonne santé de la souris mais également de l'Homme. Les souris sevrées à 21 jours seront alors utilisées afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.