Souris

608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur, puis elles reçoivent des médicaments par injection intraveineuse et intra-tumorale, avec des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins. Le projet teste des nanoparticules activées par ultrasons pour concentrer les médicaments anticancéreux au niveau de la tumeur. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour évaluer la biodistribution in vivo.

Objectifs

Aujourd'hui, de nombreux médicaments en oncologie souffrent d'une faible efficacité. Seul un pourcentage très faible de la dose atteint la cible à traiter lorsqu'ils sont administrés par voie orale ou intraveineuse, tandis que la majorité de la dose surcharge inutilement et dangereusement le corps du patient. En cancérologie, les traitements entrainent des effets indésirables difficiles à supporter pour les patients nécessitant de diminuer les doses et d’espacer les traitements. L’effet thérapeutique est alors fortement diminué. De nombreuses thérapies innovantes telles que l’ajout de transporteurs actifs tentent d’apporter une réponse à ce problème mais sont le plus souvent actives sur un nombre restreint de patients et ont un coût très élevé. Nous avons mis au point une nouvelle approche utilisant des nanoparticules pouvant être administrées chez les patients pour délivrer tout type de médicaments de façon ciblée au niveau de la tumeur. Cette délivrance peut être contrôlée par l’action d’ondes sonores (ultrasons) appliquées au niveau de la zone à traiter. Cette approche permettrait de traiter la zone cancéreuse chez un patient avec une plus grande efficacité thérapeutique tout en minimisant les effets indésirables au niveau des tissus sains. Elle permettrait ainsi d’éliminer les effets indésirables du médicament administré qui serait, de fait, mieux toléré et dont l’efficacité thérapeutique serait conservée. De nombreux médicaments utilisés aujourd’hui dans le traitement des cancers, peu tolérés en administration seule ou présentant certaines toxicités, pourraient être combinés à nos nanoparticules afin de limiter leurs effets indésirables et augmenter leur efficacité thérapeutique. Cette approche permet, en plus, d’exploiter des agents déjà développés ou en cours de développement et ayant fait leur preuve in vitro contre divers cancers avec des résultats mitigés in vivo. Nous avons montré en laboratoire (in vitro) que des ultrasons à des ondes bien précises entrainent la délivrance contrôlée de médicaments utilisés dans le traitement des cancers. Ces études en « tube à essai » sont une étape initiale importante mais doivent être validées dans un organisme vivant pour se rapprocher de la complexité rencontrée chez les patients. .

Bénéfices attendus

Ce projet avec un fort potentiel clinique doit permettre de tester cette nouvelle stratégie thérapeutique qui couple délivrance par ultrasons et médicaments anti cancéreux dans un modèle préclinique. Le recours à l’animal est indispensable pour l’évaluation in vivo sur la biodistribution et l’efficacité. Ces études auront pour but de vérifier et d’optimiser le ciblage de médicaments anti-cancéreux au niveau de la tumeur et d’étudier comment le médicament se distribue dans le reste du corps. Ces études sont une étape clé pour continuer le développement de cette technologie chez l’humain.

Procédures

Les effets interventions prévues sur les animaux sont listés ci dessous : o L’injection des médicaments en intra veineux et intra tumorale (2 fois par semaine maximum) peut induire une courte douleur (moins de 5min) qui sera réduite via l’utilisation d’anesthésiant local (Xylocaïne, gel 2%). Les injections de médicaments ne seront réalisées que sur une durée de moins de 3 semaines. o Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1.5% à 2.5%). Lors du réveil, les souris peuvent être désorientées et stressées. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière sera prévu dans la cage propre. o Des prélèvements sanguins seront réalisés pendant les différentes procédures. Un volume maximal de 50-100µL, lors de séance d’imagerie, soit une heure et 48h après l’injection des médicaments seront réalisés (durée totale : 5minutes). L’application de gel de Xylocaine (2%), sera effectué pour atténuer la douleur. o Les tumeurs peuvent impacter la mobilité de la souris. Suite à l’injection des xénogreffes, les souris seront examinées tous les deux jours afin de vérifier que le volume tumorale n’impacte pas la mobilité de la souris. Dès l’observation de cette mobilité réduite (dans les 24h), les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur lors de l’injection de cellules pendant quelques heures. Une analgésie adaptée est mise en place (Xylocaine en gel) ainsi qu’un suivi régulier des animaliers. L’injection d’agents d’imagerie, toujours réalisée sous anesthésiant local (imagerie par tomographie par émission de positon, imagerie optique et /ou échographie) n’induit pas d’effets indésirables, étant donné que le traceur est à très faible dose. Le prélèvement sanguin n’est réalisé qu’une ou deux fois par semaine avec des volumes très faibles, ne perturbant pas le bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser des corrélations entre des analyses ex vivo et l’imagerie. L’analyse ex vivo est un point crucial afin de réduire dans les prochains projets le nombre d’animaux en validant la méthodologie appliquée. De plus, le volume tumoral à chaque fin de procédure serait trop important pour garantir les points limites sur le volume tumoral.

Remplacement

L’efficacité de la délivrance des médicaments augmentée par ultrasons sera dans un premier temps évalué in vitro afin de définir aux préalables les paramètres ultrasonores. La toxicité des nanoparticules et des médicaments associés seront évaluées in vitro également. Ces études sont essentielles afin de remplacer l’utilisation des animaux par des essais in vitro. De plus ces études permettent de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murins.

Réduction

L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie, individuellement ou globalement, permettront après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.

Raffinement

Toutes les interventions invasives, à savoir, les injections systémiques ou intra-tumorales seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse, complétées par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif de suivre et d’évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique sur la délivrance de médicaments anti-tumoraux associés à des nanoparticules augmentée par ultrasons. La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation. Les modèles sous-cutanés sont largement utilisés pour examiner rapidement de larges cohortes de tumeurs relativement homogènes dont la croissance et la réponse aux médicaments délivrés de façon standard ont déjà été évaluées.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises seize semaines à un régime gras jusqu'à devenir obèses, avec pesées, mesures de composition corporelle et tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme que la dysfonction métabolique de l'obésité ne peut être étudiée que sur des animaux entiers.

Objectifs

Le but est d'evaluer la reponse metabolique des animaux porteurs d'anomalies de l'expression de certaines proteines a un regime obesogene , et d'evaluer l'importance des changements metaboliques par rapport a un groupe controle .Il s'agit de de tester la pertinence des cibles proteiques etudiées du point de vue physiopathologique/et/ou thérapeutique. Il s'agit d'un protocole de suivi metabolique standard, avec de légeres modifications qui ont pour seules consequences d'ameliorer le confort des animaux (elevage en thermoneutralité).

Bénéfices attendus

ce projet s'inscrit dans le contexte de l'etude de modeles de souris comme outil de comprehension des mecanismes physiopathologiques de l'obesité, qui necessite des etudes sur animaux vivants ne pouvant etre subsitues. Il permettra de demontrer l'importance de l'espression des proteines ciblées dans la dysregulation metabolique mise en jeu dans l'obesité, etape necessaire a la poursuite vers des essais therapeutiques.

Procédures

pendant l'etape 1 pendant 16 semaines: Changement de régime alimentaire et mise sous régime enrichi en graisse. Maintient a thermoneutralité (30°C) pendant l'etape 2: Pesée hebdomadaire. Mesure non invasive de la composition corporelle par RMN. Procedure realisée 2 fois a S0 et S15 sur animaux vigiles. Test de tolerance au glucose et a l'insuline comportant la mise a jeun pendant 4h suivie de prelevements de gouttes de sang a la queue (1 goutte x 6 pendant 180 minutes) sur animaux vigiles. Procedure realisée 2 fois a S0 et S15. pendant l'etape 3: (a S16) Anesthesie gazeuse pour prelevement sanguin retroorbital. Euthanasie pour prelevement d'organes post mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce protocole seront soumis a un regime alimentaire obesogene (riche en graisse) consommé avec grande appétence, qui conduit au développement d'une obésité expérimentale, ce qui peut etre considéré comme une nuisance a la santé. Egalement nous proposons dans ce protocole de maintenir les animaux a thermoneutralité (30°C) et non pas a temperature ambiante comme c'est generalement le cas dans la plupart des animaleries. Cette procedure peut constituer une nuisance dans le sens ou elle necessite l'utilisation d'une enceinte climatique pour la stabulation des animaux, cependant le confort thermique est amélioré, et plus proche des conditions de vie des humains qui vivent la quasi totalité dans des conditions de thermoneutralité.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux sont euthanasiés en vue de prelever et d'etudier differents organes (tissu adipeux, foie, muscle etc). Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et que cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux

Remplacement

La dysfonction metabolique induite par l'obésité chronique est une situation impliquant de nombreux acteurs cellulaires, qui ne peuvent être étudiées dans leur intégralité que sur des animaux. L’évaluation de candidats therapeutiques potentiels nécessite l’utilisation des modèles murins génétiquement modifiés. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et permet d'explorer les males et les femelles.

Réduction

Pour chaque groupe experimental correpondant a un regime (standard ou enrichi en graisse) et un genotype (ko ou control), 12 animaux (6males et 6 femelles) seront utilisés. Au total par lignée transgenique 48 animaux seront nécessaires, soit 240 au totalpour les 5 lignées a étudier. C'est le nombre minimal pour prendre en compte la variabilité experimentale de la reponse au regime riche en graisse, qui permet d'obtenir des differences statistiquement significatives apres 16 semaines de regime. . La durée du regime (16 semaines) correspond au temps necessaire pour obtenir non seulement une augmentation du poids corporel mais aussi des effets metaboliques associées a l'obesité chronique. De plus il est necessaire d'evaluer a la fois des males et des femelles car il est connu que les risques metaboliques consecutifs a l'obesité sont differents selon le sexe.

Raffinement

Pour l’étape 1 : Le maintien es animaux a thermoneutraliré réduit le stress thermique par rapport a un élevage a température ambiante. Il est réalisé dans une enceinte a climat constant a 30°C avec éclairage led entre 6.00AM et 18.00PM, l'humidité est maintenue constante a 40-70%, les cages standard utilisées pour la stabulation a température ambiante avec l'enrichissement habituel (lanières de papier) ont utilisées avec des biberons pour l'accès a l'eau de boisson. 6 animaux par cage au maximum. Le type d'enrichissement (lanières de papier a disposition dans les cages tapissées de sciure) est identique pour tous les groupes. Les point limites de l'expérience sont définis sur les critère habituels de bien être des animaux (posture, état du pelage) mais aussi sur l'évolution du poids corporel et de la prise de poids induite par le regime enrichi en graisse. Toute perte de poids de plus de 10% constatée sur 2 pesées hebdomadaires consécutives entrainera le retrait de l'expérience. Pour l’étape 2 : La pesée hebdomadaire et la mesure non invasive de la composition corporelle sont réalisées dans un environnement calme pour minimiser le stress lié a la manipulation. Pour l’évaluation metabolique par le test de tolerance au glucose, la mise a jeun temporaire (4h) est réalisée en laissant les animaux dans leur cage habituelle. Après chaque prélèvement d’une goutte de sang a la queue, les animaux vigiles sont immédiatement remis dans leur cage habituelle avec leurs congénères. Pour l’étape 3 nécessitant un prélèvement sanguin retro orbital et le prélèvement d’organe post mortem, une anesthésie gazeuse sans réveil est réalisée immédiatement suivie de dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Stade adulte (soit age de 6 semaines) pour induction d'une obésité nutritionnelle. Le suivi pondéral des animaux permet de détecter le phénotype obèse qui se traduit par une prise de poids superieure à celle des animaux en régime standard. Les modeles commerciaux sont elevés comme reproducteurs pour generer les groupes experimentaux, ils ne sont pas utilisés dans le protocole. Les animaux sont identifiés par un marquage aux oreilles. Le genotypage est effectué par PCR sur de l'ADN genomique extrait de fragments de queue prelevés par les personnels de l'animalerie avent le sevrage.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour une maladie rénale rare, elles sont gavées quotidiennement pendant deux mois, placées en cage métabolique 48 heures, puis soumises à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie le jour de leur mise à mort. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier un rein in vitro.

Objectifs

La néphronophtise (NPH) est une maladie rénale héréditaire rare affectant l’enfant et l’adolescent. Cette affection est responsable de 10% des cas d’insuffisance rénale terminale chez l’enfant et nécessite le recours à la dialyse ou à la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. La maladie se révèle par une augmentation du volume des urines et une soif excessive. En parallèle, le rein subit de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa transformation en un tissu fibreux non fonctionnel. Au cours de l'évaluation d'une grande quantité de composés chimiques, pour la plupart déjà utilisés en clinique, sur différents modèles cellulaires, des molécules avec un fort potentiel thérapeutique ont été mis en évidence. Récemment, un modèle murin transgénique récapitulant en partie la néphronophtise humaine a été développé. Ces souris présentent des atteintes oculaires, une infertilité masculine et des anomalies de structure du rein à partir de 3 mois sans insuffisance rénale. Dans ce modèle, l’administration par voie intrapéritonéale, d’un des composés identifiés, le composé C1, permet d’améliorer l’état du tissu rénal. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer l’efficacité thérapeutique du composé chimique C1 administré cette fois-ci par voie orale, dans le même modèle murin de néphronophtise.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’administration orale d’un composé thérapeutique identifié in vitro permettant ainsi à terme d’éviter la greffe rénale aux patients.

Procédures

Les 80 animaux seront soumis à un gavage quotidien pendant 2 mois à l’aide de sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal. A la fin du protocole, si après avoir réalisé le spot urinaire, un défaut de concentration des urines a été observé chez certains animaux, les 80 animaux seront également soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines des 24h. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, chacun des 80 animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale (test des réflexes et de la mesure de la fréquence respiratoire pour vérifier l’endormissement) une seule fois le jour du sacrifice à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Si cela est observé, on attendra de voir si l’animal reprend souffle dans les minutes qui suivent. Si cela n’est pas le cas, l'animal sera mis à mort immédiatement par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Afin de limiter ce stress, une période d’adaptation de 24h est réalisée. La mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée.

Devenir

A l’issue de la Procédure 1, les 80 animaux âgés de 3 mois, seront euthanasiés afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification du composé C1 qui fait l’objet de l’étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’un rein in vitro, il n’a pas été possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum (10 animaux par groupe de traitement) permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test de one-way ANOVA suivi d’un test de Tukey pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages répétés et réduire les risques de perforation de l’œsophage, des sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal seront utilisées. Toutes les procédures douloureuses sont effectuées sous anesthésie générale associée à une analgésie pré- et post-opératoire. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Des points limites spécifiques à la procédure ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. De plus, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Le traitement avec le composé C1 sera initié à 1 mois de vie (avant le début de la maladie) et sera poursuivi jusqu’à 3 mois de vie.

1 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections chroniques de cocaïne ou de morphine, et une partie subit un test de peur conditionnée par chocs électriques (864 souris) ou une lésion pharmacologique du cortex frontal (608 souris) pour modéliser un stress post-traumatique ou un traumatisme crânien. Le porteur affirme que le conditionnement de peur n'induit "ni stéréotypies ni modification du comportement" durable. La mise à mort se fait par exsanguination sous anesthésie, présentée comme la seule façon de prélever assez de sang.

Objectifs

L’objectif du projet est de rechercher des biomarqueurs des comorbidités addictions / traumas psychologique (stress traumatique) ou physique (trauma cérébral). Pour cela, nous modéliserons chez la souris la prédisposition au développement de comportements de type état de stress post-traumatique (ESPT) suite à l’addiction à différentes drogues telles que la cocaïne et la morphine, et inversement d’établir un modèle de prédisposition à l’addiction à ces drogues dans le contexte de l’ESPT ou de trauma cérébral léger cortico-frontal. Ces modèles seront utilisés afin de rechercher des biomarqueurs de co-morbidités à la fois au niveau central (cerveau) et périphérique (sang). Le but à long terme est de proposer des stratégies diagnostiques et thérapeutiques communes à l’addiction et aux traumas psychologiques et/ou physiques.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'identifier des biomarqueurs des comorbidités addictions et traumas, et de mieux comprendre les mécanismes communs à ces pathologies afin de développer de futures thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies comorbides.

Procédures

Afin de modéliser l'addiction un test de préférence de place conditionnée est effectué sur l'ensemble des souris (n=1472) et permet de mesurer l'effet récompensant d'une drogue (administration chronique, 8 injections, morphine ou cocaine). Afin de modéliser les comorbidités, des animaux subiront également, soit une modélisation de l'ESPT, soit du trauma crânien léger. La modélisation du stress traumatique est effectuée sur n=864 souris, grâce au test de la peur conditionnée, qui permet que l'animal associe un choc electrique léger (x6, 2sec) avec un environnement durant 15 minutes totale du test. Une remise ultérieure dans cet environnement sans choc electrique constituera un "rappel de la peur" afin de mimer les flashbacks, reviviscence du souvenir traumatique, symptôme retrouvé chez les patients atteints d'ESPT. La modélisation du traumatisme crânien léger, sera effectuée sur n=608 souris, par lésion pharmacologique du cortex cérébral frontal, et necessite un chirurgie sous anesthésie générale ainsi que la prise en charge de l'éventuelle douleur résultante par un antalgique.

Impact sur les animaux

Même si le conditionnement de peur, consiste à modéliser un stress traumatique, dans nos conditions, il n'induit, ni stéréotypies, ni modification du comportement de type émotionnel (aux tests de comportement de type anxieux effectués le lendemain). Le stress ressenti par l'animal lors de cette procédure est donc de très courte durée. La lésion cortico-frontale peut entrainer une perte de poids et une mobilité réduite légère durant les 24h suivant la chirurgie, mais les animaux, pour la plupart (sauf atteinte des points limites dans 10% des cas au maximum), recouvrent leurs capacités locomotrices et leur poids au maximum 3 jours plus tard. Les traitements avec les drogues peuvent entrainer une perte de poids. Par contre, l’interruption du traitement durant 2 jours le samedi et le dimanche empêche généralement une perte supérieur à 15%.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie. L'exsanguination est en effet la seule méthode permettant de prélever suffisamment de sang chez la souris pour la recherche de biomarqueurs au niveau périphérique.

Remplacement

Les analyses in silico ou in vitro ne permettent pas à ce jour de modéliser ni la complexité du cerveau, ni celle du comportement aux cours des pathologies telles que l’addiction aux drogues et le trauma cérébral. Le modèle animal permet de réaliser des expériences comportementales complexes.

Réduction

Pour réduire le nombre de souris utilisées, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace (ANOVA et tests post-hoc) grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Dans chaque expérience, le nombre minimum d’animaux pour avoir une étude statistique satisfaisante a été choisi. L’existence de variabilités interindividuelles ne permet pas d’aller en dessous d’une population de 14 animaux par groupe.

Raffinement

L’angoisse des animaux sera minimisée par au moins une semaine d’habituation aux conditions d’hébergement avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés dans des conditions normales (4 souris / cage) avec enrichissement du milieu (nids végétaux). Tous les groupes auront accès libre à l’eau et à la nourriture. Les animaux opérés bénéficeront d'anesthésie (kétamine/xylazine) et de traitement d'un traitement anagésique per-opératoire (méloxicam). Toute atteinte de point limite entrainera la mise à mort de l'animal par dislocation cervicale. Les points-limites sont les suivants : - Toute perte de poids supérieure à 15% (aucune perte de poids : score = 0, perte de poids 15% : score = 2). - Toute modification majeure de l’état général : comportement (très agité, immobilité, automutilation) ; apparence physique (présence de pus sur la plaie, poil très ébouriffé, posture anormale). Aucune modification : score = 0, comportement ou apparence physique : score = 1, comportement et apparence physique : score =2.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles d’addiction, de trauma cérébral, et le conditonnement de la peur. De plus, cette espèce offre la possibilité de travailler ultérieurement sur des animaux génétiquement modifiés. Les animaux que nous utiliserons seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne seront pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour éviter l’effet de l’âge sur les performances comportementales.

16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse, un prélèvement sanguin et une blessure musculaire provoquée par un agent chimique injecté dans la patte. Le porteur indique que l'irradiation entraîne une immunodépression, une fatigue et une perte allant jusqu'à 15 % du poids pendant quelques jours. Il présente cette étude comme une preuve de concept du rôle d'une protéine des macrophages dans la régénération du muscle.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion, grâce aux cellules souches musculaires. Ces cellules doivent développer des interactions avec leur environnement pour assurer la réparation du muscle. Certaines cellules de l'immunité jouent un rôle important dans ce processus. Une protéine a été identifiée comme un candidat important impliqué dans le contrôle des fonctions de ces cellules au cours de la régénération musculaire, ce qui a été validé par des expériences réalisées sur des cellules in vitro. La validation du rôle de cette molécule dans les macrophages au cours de la régénération musculaire in vivo nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation du gène à l’origine de cette molécule. Une approche réductrice en nombre d'animaux qui permet de faire la preuve de concept du rôle de cette molécule au cours de la régénération musculaire consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses normales. De cette manière, seules les cellules du sang sont inactivées pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire avec un agent chimique est réalisée afin de pouvoir analyser les muscles de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider la preuve de concept de la pertinence de l’inactivation spécifique de la molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire en réalisant des expériences de transplantation de moelle et de lésion musculaire sur un petit nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude preuve de concept permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les macrophages pour la régénération musculaire. Le cas échéant, des études plus complètes seront mises en place ultérieurement afin d'en analyser le fonctionnement moléculaire. A terme, la compréhension des mécanismes permettant la régulation de l'inflammation au cours de la réparation tissulaire sera bénéfique pour améliorer les conditions d'inflammation chronique en général, et les dystrophies musculaires en particulier.

Procédures

- irradiation (1 fois 10 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - prélèvement sanguin (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - induction de blessure musculaire : injection d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie)

Impact sur les animaux

L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et entraine une perte de mobilité pendant environ 4 jours, conduisant à une perte jusqu'à 15% de poids de corps 5 jours après l'irradiation, et qui est récupérée à partir du 7ème jour. L'irradiation peut également, dans de très rares cas, induire une pousse des dents. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager, au maximum de quelques heures, chez les animaux, qui recouvrent leur mobilité et leur comportement dans les 2-3heures suivant la lésion.

Devenir

Mise à mort pour des prélèvements tissulaires et cellulaires en vue d'analyses.

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées en amont de ce projet. Il s'agit d’ expériences de culture cellulaire in vitro, qui montrent un rôle de la molécule dans la fonction des macrophages dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car il permet de répondre à la question et car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux. Les études précédentes ont montré que 4 individus par point d’analyse est suffisant pour réaliser des statistiques. De plus, l'établissement d'une lésion au deux pattes de chaque souris permet de réduire par deux le nombre d'animaux.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie lors de l'injection de la moelle osseuse, de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions prophylactiques strictes et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée trihebdomadaire, la surveillance d’une pousse des dents en plus de la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme sont observées au cours de la régénération musculaire. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). L'existence de lignées murines génétiquement modifiées et permettant le traçage des populations de macrophages est un argument supplémentaire pour l'utilisation de cette espèce. Les souris sont utilisées à l'âge adulte, soit entre 8 et 12 semaines car le projet concerne la régénération musculaire chez l'individu adulte.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur sous la peau, puis elles reçoivent une immuno-chimiothérapie par injection et par gavage quatre jours sur cinq, tout en étant soumises à des séances de course sur tapis. Le porteur reconnaît que le gavage cinq jours sur sept est "reconnu comme stressant" et que la croissance tumorale ou une ulcération peuvent conduire à la mise à mort avant terme. Il affirme n'avoir "aucune autre possibilité que d'utiliser un organisme entier" pour étudier l'effet de l'exercice sur la tumeur.

Objectifs

Nous savons que réaliser de l’activité physique (AP) diminue la mortalité induite par différents types de cancer chez l’Homme. Cela a été montre dans des études chez l’humain et chez l’animal. Cependant, nous ne comprenons pas vraiment comment l’exercice agit pour diminuer la croissance de la tumeur. Notre projet chez la souris est associé à notre projet chez l’homme ou nous souhaitons voir si un exercice physique juste avant la prise des traitements anti-cancéreux améliorerait l’efficacité de ces traitements. Chez l’homme, nous ne pouvons pas souvent récupérer les tumeurs chez des patients en stade avances car il y a trop de risques pour les patients. Nous avons donc besoin de développer d’autres modèles pour étudier les effets sur la tumeur elle-même. L’exercice physique pourrait modifier la réaction du système immunitaire ou le nombre de vaisseaux sanguins sur la tumeur (vascularisation) et ainsi rendre la tumeur plus sensible aux traitements. Secondairement, nous savons que le cancer ainsi que les traitements contre cette maladie peuvent engendrer des effets secondaires. En particulier, il existe une fonte musculaire et une altération de leur fonctionnement. Cela diminue la qualité de vie des patients et serait synonyme d’un moins bon pronostic. Ainsi faire réaliser des exercices physiques aux patients permettraient de maintenir leur masse musculaire et améliorer les effets des traitements. Notre projet vise donc à étudier les effets d’un exercice physique aigu pré- traitements sur 1) le développement de la tumeur dans un modèle de cancer chez la souris ; 2) la fonte musculaire induite dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le développement de la recherche dans le domaine de l'exercice appliqué à l’oncologie a permis de constituer une base de données importante sur le rôle de l’exercice physique dans la prévention et la gestion des effets indésirables du cancer. Néanmoins, il est essentiel de comprendre comment l'exercice diminue la progression tumorale. Sur le plan scientifique, ce projet permettra donc d’apporter des nouvelles données scientifiques sur les interactions entre l’exercice physique et les traitements anticancéreux des patients ainsi que les mécanismes potentiels par lesquels l’exercice physique pré-administration de l’immunochimiothérapie pourrait potentialiser l’efficacité des traitements. Aujourd’hui pour des questions de réduction de technique invasive chez les patients, de moins en moins de biopsie de la tumeur sont réalisées ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle murin à visée scientifique pour comprendre l’interaction biologique et moléculaire entre un exercice physique réalisé juste avant l’injection des traitements et le microenvironnement tumoral. Ce modèle nous permet donc d’accéder aux tumeurs et d’évaluer l’effet de l’exercice sur la taille de tumeur, les mécanismes immunitaire et vasculaire sous-jacent ainsi que le muscle squelettique. Grâce à cette étude nous pourrons rapidement apporter de précieuses données sur les interactions entre exercice et cancer. Sur le plan clinique, les mécanismes mis en évidence au cours de cette étude permettront d’envisager des essais cliniques futurs grandes ampleurs étudiant plus spécifiquement les effets de ce type d’intervention combiné sur le développement tumoral et la cachexie musculaire associée au cancer, deux paramètres majeurs dans la survie des patients. Ces résultats permettront ensuite de concevoir des essais cliniques plus poussées afin de déterminer et affiner la prescription de la dose d’exercice (durée, intensité, modalités) à utiliser en combinaison à un traitement anti-cancéreux. Ces différentes études permettront d’améliorer la prise en charge des patients et l’efficacité de la thérapie.

Procédures

Les animaux utilises dans ce projet seront tout d’abord soumis à une seule injection sous la peau au niveau du flan gauche de cellules capables de former une tumeur. Après avoir attendu quelques jours pour que la tumeur se forme, les animaux commenceront leurs traitements bases sur une immuno et chimiothérapie. Certains des animaux ne seront pas injectes avec des cellules tumorales et ne développeront pas de tumeurs. Ceux-ci correspondront aux groupes Non-Tumoraux (NT). Pour cela, les animaux recevront une fois par semaine une injection au niveau du ventre pour atteindre les organes (intrapéritonéale) ainsi qu’un gavage (insertion d’une sonde dans l’œsophage) quatre jours sur cinq pour recevoir la totalité des traitements. Une partie des animaux eux ne recevront pas le traitement mais un placebo. Au moment du début des traitements, les animaux commenceront de réaliser de l’exercice physique. Le premier exercice sera réalisé avant même l’injection des tumeurs pour établir le niveau de d’endurance physique des animaux grâce a un test de vitesse maximal de course (VMC) qui permettra d’adapter les exercices suivants. Ces derniers seront réalisés juste avant les traitements anti-cancéreux quatre jours sur cinq et dureront 50 minutes à une vitesse correspondant a 60% de la VMC. Ensuite une partie des animaux, seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs après quatre jours de traitement et/ou d’exercice. L’autre partie des animaux poursuivra le protocole (traitement + exercice) jusqu’à 30 jours. A la fin du protocole, une partie des animaux sera utilise pour évaluer si l’exercice a modifie la vascularisation des tumeurs, c’est-à-dire savoir si l’exercice a permis que la tumeur soit plus perfusée et reçoive plus de traitement. Pour cela, les animaux recevront une molécule capable de visualiser les zones qui ont une diminution de leur taux d’oxygène (hypoxie) qui est une caractéristique des tumeurs agressives. Après cette injection, soient les animaux resteront au repos soient ils seront mis à l’exercice, puis mis à mort pour récupérer les tumeurs. Une autre partie des animaux, sera utilise pour voir si la croissance tumorale et les traitements ont un impact négatif sur les muscles et étudier les mécanismes mis en jeu. Pour cela, nous testerons la capacite des souris à réaliser une contraction musculaire. Puis, les animaux seront mis a mort et les muscles récupérés pour être étudiés.

Impact sur les animaux

Le modèle de tumeur sous la peau ne présente pas de métastases ni d’atteintes musculaires trop importantes. De plus, la localisation sous-cutanée de l’implantation de la tumeur permet de minimiser les douleurs associées à la croissance tumorale de par l’espace disponible et l’élasticité de la peau. La douleur ou gêne occasionnée lors de celle-ci sera néanmoins surveillée, en particulier si les animaux en évaluant une possible gêne à se mouvoir ou a se nourrir. Il est possible que les animaux présentent une plaie au niveau de la tumeur et dans ce cas les animaux touches seront mis à mort dans les plus brefs délais pour arrêter leur souffrance. De même si la croissance tumorale est trop importante et que la tumeur atteint une taille trop importante, les animaux seront sacrifiés. Les intensités d’exercice sont modérées et se rapprochent des intensités utilisées chez des patients atteints de pathologies chroniques. Elles sont donc connues pour induire des adaptations physiologiques bénéfiques sans effets négatifs chez l’homme comme chez la souris. Les différents traitements utilisés au cours de ce protocole ont déjà été validés au cours d’études précédentes et permettent une réduction du volume tumoral tout en minimisant la toxicité liée au traitement. Les traitements sont administrés par gavage ou injection dans le ventre. Les animaux seront donc exposés au stress induit par la contention et à la douleur de la manipulation. Ces gestes seront de très courte durée pour minimiser l’impact négatif sur les animaux. Ces procédures ont été choisies car utilisées dans le modèle tumoral utilise et déjà valide et n’ont pas été modifié pour ne pas changer l’efficacité des traitements. Le gavage 5 jours sur 7 est reconnu comme stressant. L’injection IP altère les tissus autour de la zone d’injection mais celle-ci n’ayant lieu qu’une fois par semaine, cela limitera les effets délétères de ce geste. La mesure de la force chez l’animal est réalisée sous anesthésie générale afin de ne pas induire de stress chez l’animal. Les contractions des muscles induites lors du test n’entraînent pas d’altérations de la fonction et de l’intégrité du muscle squelettique (i.e. crampe et/ou déchirement musculaire).

Devenir

Les animaux seront mis à mort après l’expérimentation car l’utilisation des muscles et de la tumeur sont nécessaires pour répondre aux questions émises dans le projet.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les interactions complexes des traitements combinés immuno/chimiothérapie et de l’exercice physique au sein de la tumeur et le rôle joue par le système immunitaire. De plus le second objectif est d’évaluer l’altération des muscles induits par ces différentes interventions. Nous n’avons donc aucune autre possibilité que d’utiliser un organisme entier. Toutes les découvertes faites lors de ce projet feront ensuite l’objet d’approfondissement dans des modèles de cellules n’utilisant pas d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos expériences passées pour mettre en évidence des différences en utilisant le minimum d’animaux. Dès lors que nous obtiendrons des différences entre nos conditions, nous arrêterons les expérimentations chez l’animal afin de maintenir le nombre d’animaux utilises au strict minimum.

Raffinement

Nous veillerons à améliorer au mieux les conditions d’hébergement des animaux en leur donnant accès a des zones cachées pour s’isoler, des jeux et en favorisant les interactions entre les animaux. Si leur condition physique rend difficile leur accès a la nourriture ou à l’eau en hauteur, nous adapterons leur environnement en leur mettant a disposition eau et nourriture au sol. Pour être sûr que la croissance tumorale reste acceptable pour l’animal, nous surveilleront le développement de la tumeur et mettrons a mort les animaux si la tumeur devient trop grosse. Nous surveillerons aussi le poids des animaux pour veiller à ce qu’ils ne subissent pas une perte de poids trop importante et synonyme de leur souffrance. Dans le cas d’une trop forte perte de poids, les animaux concernes seront mis à mort. Le protocole d’exercice physique est d’intensité modérée (60% des capacités maximales). A la suite du test de vitesse maximale de course, la récupération des souris sera vérifiée par observation de leur capacite à bouger le jour de l’intervention et le suivant avec un intervalles de 2h entre deux observations. Les différentes procédures peuvent induire du stress et nous veillerons donc à adapter au mieux nos manipulations pour limiter les actes stressants. Par exemple, nous limiterons le nombre de fois où nous toucherons les animaux en réalisant au même moment la mesure de la taille de la tumeur et les injections des traitements anti-cancéreux ; ou lors du transfert des cages au tapis de course et inversement ou nous pouvons les transférer sans les toucher avec l’aide d’une petite boite. Normalement le modèle ne devrait pas induire de douleur particulière sauf lors de l’atteinte d’un point limite (ulcération ou taille tumorale trop importante) menant à la mise à mort des animaux. Cependant, dans le cas où il semble que les animaux souffrent, nous prendrons contact avec le vétérinaire réfèrent pour évaluer les possibilités d’utiliser des médicaments pour réduire la douleur.

Choix des espèces

Le modèle de cancer sous la peau et les traitements anti-cancéreux que nous utilisons ont été valides préalablement sur les souris. Ces animaux sont très souvent utilisés dans les études en cancérologie ou dans les études portant sur l’exercice physique. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats nouveaux sans avoir à répéter des expériences déjà réalisées avant (nous limitons donc le nombre d’animaux ainsi que les procédures subites par ces animaux). De plus, les outils techniques dont nous avons besoin pour répondre aux questions ont bien été valides chez l’animal augmentant la probabilité d’obtenir de nombreux résultats en utilisant un minimum d’animaux. L’âge des animaux a été déterminé par des études précédentes qui ont valide le modèle que nous utilisons. Nous savons qu’a cet âge, nous obtiendrons un développement de la tumeur suffisant pour répondre à notre question. A cet âge, les animaux ont une fonction musculaire bonne qui permet de diminuer le nombre d’animaux ne voulant pas courir (pourcentage augmentant avec l’âge). Ainsi, a ce stade nous pouvons répondre aux différents questionnements du projet.