Etude du r?le de m?tabolites de la flore microbienne intestinale dans le traitement de l’ob?sit? du diab?te et de l’asthme chez la souris

Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d’int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.

Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l’h?te et son environnement, font l’objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.

Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.

Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.

Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.

Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d’abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.