Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-332054)
Tuées à l’issue de chaque procédure pour que leurs poumons soient prélevés, 1 156 souris vont être utilisées, 804 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 352 un niveau léger. Elles reçoivent des injections deux fois par semaine, une injection dans la trachée sous anesthésie générale et une instillation nasale, et une partie d’entre elles est irradiée pendant cinq minutes ou privée de macrophages pulmonaires. Infectées par la grippe, elles perdent du poids et voient leur température baisser, et développent une fibrose des poumons que le porteur qualifie de non létale et réversible. Sur le remplacement, il affirme que l’environnement des alvéoles pulmonaires « ne peut être reproduit in vitro », tout en annonçant développer en parallèle une culture de macrophages alvéolaires pour étudier les mêmes mécanismes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La réponse immunitaire est généralement de plus forte amplitude chez les femmes comparées aux hommes. Cela les protège vis-à-vis des infections virales ou bactériennes, mais augmente également le risque de développer des pathologies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique (LES). Le récepteur toll like 7 (TLR7), codé sur le chromosome X, reconnait des ARN simple brin dérivés du soi ou de virus. Des études d’association génétiques ont identifié une mutation pour TLR7 associée à une perte de fonction conférant des formes sévères de COVID-19. L’inflammation et les réponses immunitaires sont régulées par des facteurs liés au sexe comme les hormones et les facteurs génétiques portés sur le chromosome X comme le gène TLR7. Nous avons mis en évidence que le gène TLR7 peut être exprimé en deux copies dans les cellules immunitaires femelles, ce qui leur confère un avantage fonctionnelle comparées aux cellules immunitaires de mâles. Nous avons développé des modèles génétiques rapporteur/délétère pour l’expression du gène Tlr7 chez la souris. Ces modèles nous permettent de suivre les cellules exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, et également de les éliminer de manière constitutive ou inductible. Nos objectifs scientifiques sont d’identifier précisément les cellules immunitaires exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, de caractériser leurs fonctions immunitaires à l’état basal et durant une infection par le virus influenza.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les infections respiratoires par influenza ou coronavirus (comme le MERS ou SARS-CoV-2) sont plus sévères dans les individus âgés de plus de 65 ans. Il a été suggéré que les monocytes et macrophages pulmonaires ont un rôle dans la dysrégulation de la réponse immunitaire. Il existe des différences liées au sexe dans la susceptibilité au COVID-19 avec un risque de mortalité presque deux fois supérieur pour les hommes comparé aux femmes après 50 ans. Cette différence est maintenue à tous les âges. Les différences liées au sexe dans le remplacement des macrophages pulmonaires, promu par des infections récurrentes, le vieillissement ou des facteurs environnementaux peut être un mécanisme contribuant aux observations épidémiologiques. Ce biais de sexe n’ayant jamais été documenté, ce projet permettra de mettre en avant l’importance d’un double dosage des gènes codés sur le chromosome X dans la biologie des macrophages alvéolaires, en utilisant les modèles murins uniques que nous avons développés. Le double dosage des gènes codés sur le chromosome X pourrait contribuer au biais de sexe en permettant l’activation plus efficace des cellules immunitaires mais aussi en promouvant la maintenance et les fonctions d’homéostasie des macrophages alvéolaires chez les femmes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux recevront des injections plusieurs fois (2 /semaine sur une semaine maximum) pendant 1 minute. Une injection par voie intratrachéale sous anesthésie générale une seule fois pendant 3 minutes. L’irradiation sera faite une fois pendant 5 minutes. L’instillation nasale se fera une seule fois pendant une minute.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans le modèle de reconstitution les animaux seront irradiés ou déficients en macrophages alvéolaires. Dans le modèle d’infection à l’influenza, les souris présentent une baisse de température et une perte de poids. La fibrose pulmonaire n’est pas létale et est réversible.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour analyser leurs tissus, en particulier les poumons.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’environnement des alvéoles pulmonaires ne peut être reproduit in vitro. La physiologie de l’infection, le recrutement des cellules ne peut s’étudier que dans un modèle in vivo. Nous nous attacherons à développer un modèle d’expansion de « macrophages alvéolaires like » in vitro afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’inactivation de l’X ou son échappement.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’expériences effectuées nous utilisons un nombre d’animaux suffisant par expérience afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et de faire des analyses différentes. Le nombre de lots et d’animaux par lot sont détaillés dans chaque procédure. De manière générale, nous avons estimé que 2 à 3 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante. Nous allons comparer 2 conditions.
3. Raffinement
Les souris sont hébergées en portoirs ventilés. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par quinzaine. Les cages seront systématiquement enrichies (coton, igloo, tunnel) pour leur permettre de faire un nid. L’angoisse des animaux sera réduite par une période d’acclimatation à l’hébergement (1semaine) mais également par une habituation à la manipulation. Un protocole est mis en place avec la structure du bien-être animal (SBEA) pour prévenir toute douleur, souffrance ou angoisse de l’animal. De plus, les procédures et le suivi de l’animal seront effectués par des personnes compétentes et formées à l’expérimentation animale. Les animaux sont surveillés tous les jours par les zootechniciens du service, en accord avec la réglementation.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ces expérimentations ne peuvent être conduites que chez la souris car nous avons développés de nombreux modèles génétiques sur le fond C57BL/6 pour suivre et éliminer les cellules exprimant le gène Tlr7 à partir du X inactif chez les femelles. Résumé des modèles génétiques de souris reporter/deleter utilisés : lignée#1 : XmXistKOTlr7WT XpXistWTTlr7MCH modèle biaisé dans lequel le X actif est fixé. Permet de suivre l’échappement de Tlr7. lignée#2 : XTlr7mCh XTlr7YFPCre Rosa26LSL-DTA rapporteur mCherry maternel/délétion cellules YFP paternelles ou rapporteur mCherry paternel/ délétion cellules YFP maternelles. lignée#3 : XmXistKO Tlr7WT XpXistWT Tlr7tdTomato DTR (human diphteria toxin receptor): rapporteur tdTomato et expression du récepteur à la toxine diphtérique de manière à éliminer les cellules exprimant Tlr7 sur le chr X porteur de cette construction. lignée #4 : Csf2rb-/- déficiente pour la chaine béta du récepteur au GM-CSF. Ces souris n’ont pas de macrophages alvéolaires. lignée #5 : Tlr7 fate-mapping model= Femelle R26LoxStopLox-tdTomato+/- Xm = XXistKO Tlr7WT Xp = XistWT Tlr7YFPCre. Les cellules exprimant Tlr7 à partir du Xp = Xi seront marquées de manière irréversible par la tdTomato suite à l’élimination du Stop par la YFPCre.