Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 18/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-505222)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La modulation des réponses immunitaires par les lymphocytes T grâce aux immunothérapies est à présent mise en place comme un traitement standard contre divers cancers. Dans ce contexte, l’activation des lymphocytes T dépend d’une régulation hautement dynamique des programmes génétiques pour la production de molécules effectrices qui éliminera les cellules tumorales. Nos données préliminaires montrent que les fonctions effectrices et régulatrices des lymphocytes T sont modulées par les protéines de liaison à l’ARN (RBPs). Nous émettons l’hypothèse que les RBPs sont essentielles pour le développement de la réponse antitumoraux par les lymphocytes T. Avec l’utilisation de modèles de souris transgéniques, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l’amplitude et l’étendue des réponses immunitaires contre les tumeurs. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 – Comprendre la fonction des RBPs pour la maintenance de populations de lymphocytes T saines. 2 – Étudier l’importance de ces protéines pour l’activation des lymphocytes T effectrices et régulatrices dans la tumeur.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous avons sélectionné les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 comme modèles pour évaluer l’importance des mécanismes post-transcriptionnels clés des ARNm jusqu’à la synthèse des protéines. Pour certains cancers, l’expression de TIA1 et TIAL1 dans les lymphocytes T a été utilisé comme un marqueur pronostique, mais sa fonction moléculaire reste inconnue. G3BP1 et G3BP2 sont des protéine impliques dans l’apparition de cancer. Donc, nos études apporteront d’importantes connaissances sur la biologie de ces protéines et sur le fonctionnement des lymphocytes T qui permettra de mieux optimiser les stratégies pour la détection ou traitement de cancers.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux sont soumis à une contention de 3-5 minutes pour un prélèvement de tissu (queue) lorsqu’elles ont 6 jours pour le génotypage (détermination des modifications génétiques) et, dans certains cas, un prélèvement du sang. Les animaux transgéniques n’expriment pas les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 dans les lymphocytes T après un traitement spécifique par injection intra-péritonéale ou gavage oral (chaque intervention dure 2 minutes) pendant 5 jours, ou par régime alimentaire (sans manipulation). Ils serviront comme modèles tumoraux ou de donneurs de cellules T pour nos expériences de transfert cellulaire. Le transfert de cellules se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par une injection de 100-200μL en voie intraveineuse, par injection rétro-orbitale. Certains animaux seront irradiés, une fois pendant maximum 10 minutes, avant la reconstitution du système immunitaire avec le transfert de cellules souches par injection intraveineuse de 100-200μL dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes. Dans les modèles de cancers murins, l’implantation des cellules tumorales se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par injection sous-cutanée (sc) au niveau du flanc. Les animaux sont soumis à une contention de 2-3 minutes pour mesurer la tumeur tous les 2-3 jours (pendant 2-8 semaines selon les expériences) jusqu’au point d’analyse. Toutes les souris seront euthanasiées avant le prélèvement des organes le jour du point d’analyse.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour minimiser les effets indésirables, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales, puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de une taille tumorale maximale. Parfois, des nécroses peuvent apparaître au centre de certaines tumeurs et commencer à s’ulcérer ou à saigner. Si se le cas, les souris seront suivies par le/la vétérinaire. L’apparatition d’écoulement de sang ou d’ulcère avec un écoulement de liquide est un point limite, et le souris seront euthanasiées. Pour les animaux transgéniques qui n’expriment pas nos protéines d’intérêt dans les lymphocytes T, il y a la possibilité de développer un épisode d’auto-immunité associé à une perte de lymphocytes T régulateurs. L’auto-immunité peut être caractérisée par un amaigrissement, une inflammation cutanée, une peau rugueuse et/ou squameuse, une déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés, une absence de toilettage, ou une absence d’activité sévère. Si les animaux présentent un des phénotypes cités en amont, ils seront euthanasiés et nous remplacerons le traitement continu par un traitement limité à cinq doses de médicament (1 par jour durant 5 jours) où la perte de poids sera inférieure à 5 %, sans aucune inflammation cutanée et une activité physique normale. Nous n’avons observé aucun autre phénotype dommageable lié aux croisements de lignées génétiquement modifiées. Dans tous les cas, la santé de l’ensemble de nos souris sera surveillée au minimum 3 fois par semaine et les souris seront euthanasiées si elles perdent plus de 20% de leur poids initial ou présentent une posture voutée ou prostrée, des poils hérissés, des salissures ou écoulements ou une absence de toilettage. La souffrance, la douleur et le stress associés à la manipulation d’animaux, l’injection de substances et cellules (nuisances légères), l’irradiation de souris (nuisance modérée), et de prélèvement de sang et/ou d’une biopsie pour le génotypage (nuisances légères) sont limités en raison de la formation constante de notre personnel.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés à la fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les réponses immunitaires contre le cancer sont des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains et permettent l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures se limiteront à la description des interactions moléculaires entre nos RBPs et l’ARN.
2. Réduction
Nous suivons les directives ARRIVE afin de garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d’animaux. La stratégie d’élevage produit le même nombre des souris tests et contrôles. Les souris sont classées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d’animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. Sur la base de nos données préliminaires, pour avoir la plus grande puissance statistique, nous aurons besoin de 7 souris par groupe. Pour la reproductibilité de résultats concluants, nous répéterons chaque expérience 3 fois pour permettre un test statistique et une bonne reproductibilité. Finalement, dans certains cas, le transfert des lymphocytes T matures ou la reconstitution du système immunitaire avec des cellules souches permettra la reconstitution des lymphocytes T chez plusieurs souris réceptrices non-transgéniques, réduisant ainsi l’élevage des animaux transgéniques.
3. Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 maximum dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. Les souris ne seront jamais laissées seules dans leur cage. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. De l’essuie-tout, des copeaux et du rouleau en carton et une maison en plastique rouge sont rajoutés en tant qu’enrichissements pour permettre aux souris de se détendre. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens dès leur naissance. Les animaux disposent d’une semaine d’acclimatation avant le début du protocole. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Dans chaque procédure, nous avons mis en place des points limites (activité, posture, aspect et/ou respiration anormale, amaigrissement, inflammation cutanée, présence d’une anomalie ou avec une tumeur de taille anormale [ayant atteint 1500mm3], ulcère ou sanglante). Si l’un de ces critères est atteint, les souris seront euthanasiées. Les utilisateurs ont reçu des formations spécialisées et officielles qui leur permettent l’évaluation des souris et le raffinement des procédures. Les zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que les grimaces, l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage. L’anesthésie gazeuse (2% isoflurane + mélange air/oxygène, débit : 2 L/min pour la boîte et 0.2 L/min pour le masque) sera utilisée pendant le prélèvement du sang ou l’injection des cellules pour réduire le stress.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les mécanismes moléculaires régulés par les protéines de liaison à l’ARN étudiées dans ce projet, ainsi que la dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris sont similaires à celle observées chez l’homme. Donc, nos modèles de souris nous permettent d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Tout particulièrement, nous pouvons évaluer le maintien et le fonctionnement des cellules lymphoïdes dans un environnement tumoral complexe et difficile à modéliser in vitro, et ainsi analyser l’impact des réponses immunitaires systémiques en dehors du site tumoral. Toutes les procédures seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant.