Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-664660)
180 seiches juvéniles (Sepia officinalis) vont être utilisées, tuées sans avoir subi d’intervention préalable. Les œufs sont prélevés dans la nature, puis les juvéniles sont mis à mort par refroidissement progressif sur glace pour prélever leurs organes, cerveau, lobe optique et yeux, et étudier l’expression de gènes de l’horloge biologique sur vingt-quatre heures. Le porteur indique qu’aucun prélèvement partiel n’est possible sans « dommages irréparables », d’où la mise à mort, et qu’il n’existe « pas d’alternative in vitro ». La recherche est fondamentale, avec des bénéfices annoncés pour la compréhension de l’évolution des rythmes et l’élevage de la seiche.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est de déterminer si le juvénile de seiche Sepia officinalis montre après éclosion un rythme interne dit circadien correspondant à une « horloge biologique ». Ce projet consiste ainsi à caractériser le niveau d’expression des gènes impliqués dans le contrôle du cycle au cours d’un cycle jour/nuit, soit sur 24H. Le rythme circadien contrôle de nombreux mécanismes physiologiques liés au comportement, au sommeil, au niveau d’hormones entre autres. Presque tous les organismes vivants sont concernés. Il est en correspondance avec les alternances jour/nuit, soit selon un rythme 12h/12h. De nombreux organismes montrent un rythme journalier avant la naissance. Il est régulé par des gènes dont l’expression oscille au cours de la journée. Une régulation entre ces gènes a été mise en évidence chez les mammifères et la mouche. Chez certains mollusques marins de la zone de balancement des marées, il a été montré que l’expression de ces gènes suivait un rythme lié à la marée (rythme tidal), et non un rythme 12/12. Les seiches sont des espèces côtières et sont soumises particulièrement en Manche et Atlantique aux marées. Des expériences de rythmicité (comportemental) ont montré qu’elles avaient un rythme journalier avec une activité locomotrice et alimentaire plus importante la nuit. Nous avons montré que les gènes cibles sont exprimés dans l’embryon à un stade tardif, avant éclosion, et dans différents tissus dont les yeux. Par ailleurs, une première étude récente faite par l’équipe sur les embryons n’a pas permis de déterminer la présence d’un rythme avant éclosion dans les organes cibles. Il s’agit ici d’évaluer si une cyclicité peut être mise en évidence chez le juvénile et mise en relation avec leur physiologie et l’environnement (cycle tidal ou cycle jour/nuit) en déterminant la dynamique d’expression des gènes d’intérêt sur 24h.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats aideront 1) à approcher la diversité des rôles des gènes “circadiens” dans le rythme, gènes dont l’importance a récemment été reconnue par le prix Nobel de médecine (2017) 2) à la caractérisation d’un éventuel rythme interne, important pour l’optimisation des conditions d’élevage de la seiche mais aussi 3) à une meilleure compréhension de l’histoire évolutive des rythmes et de leur contrôle pour tous les animaux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur euthanasie. Lorsqu’ils sont retirés de l’aquarium, ils sont immédiatement transférés dans un récipient et euthanasiés
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux ne subissent pas de nuisances avant la mort, aucun effet indésirable n’est attendu car les animaux sont maintenus dans des conditions proches du milieu naturel.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique l’euthanasie des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréparables (pas de survie après prélevement des yeux, du cerveau entre autres).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’existence d’un rythme interne dans les organes (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.
2. Réduction
Le nombre d’œufs prélevés dans la nature est minimisé à 180 oeufs en tenant compte des 10% d’oeufs qui ne sont pas fécondés naturellement. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre tient compte de la variabilité biologique entre individus, de la puissance statistique pour des résultats robustes et des problèmes de qualité biologique qui peuvent advenir. Afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique, 10 individus juvéniles seront donc fixés pour chaque point horaire choisi, soit au total 160 juvéniles.
3. Raffinement
Afin d’éviter le stress des embryons, la grappe d’œufs est saisie entre les doigts puis retirée de son support en étirant les ligaments d’accroche jusqu’à la détacher délicatement. Les œufs récoltés sont transportés en eau de mer et placés dans des paniers flottants dans un aquarium de 200L, ce type de stabulation permet de maintenir des conditions optimales d’oxygénation pour les embryons dans l’oeuf. L’aquarium (200L.) est alimenté en circuit ouvert d’eau de mer filtrée (100µm.) non thermorégulée, c’est-à-dire à la température naturelle environnementale. Les œufs sont donc dans des conditions proches du milieu naturel du point de vue physicochimique : conditions « naturelles » de température (entre 16 et 18°C), de salinité (entre 35 et 36 g/L.), et de pH (8 à 8.2), et en conditions lumineuses du jour (éclairement normal). Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. Une observation quotidienne permet de s’assurer de l’état sanitaire des pontes mises en paniers. Lorsque les embryons ont éclos (naturellement), les juvéniles ressemblent alors à un adulte et adoptent immédiatement le mode de vie des adultes. Un enrichissement environnement sous la forme de cachette diverses (tube de et pièces de PVC, « cabanes…) est alors proposé aux animaux. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée. Les animaux qui présenteraient des anomalies comportementales (flottaison, immobilisme, blessure), seront écartés et immédiatement euthanasiés par surdose d’éthanol. Au bout d’une semaine, toutes les 1h30 sur 24h, 10 juvéniles sont pris à l’épuisette et placés dans un bécher d’un litre contenant de l’eau de mer du système d’élevage puis transportés jusqu’à une salle adjacente où l’euthanasie sera réalisée. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans l’eau de mer. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire, relâchement des chromatophores), les juvéniles sont placés dans le fixateur (froid également).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La seiche européenne est le seul mollusque possédant un cerveau et des yeux performants, qui ponde des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (