Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 04/11/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-691953)
168 souris âgées de 20 à 24 mois vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour prélèvement d’organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant dix-huit semaines, chaque souris reçoit deux injections sous-cutanées par semaine, des prélèvements sanguins et des mesures répétées d’électroneuromyogramme et d’impédancemétrie, pour tester une molécule contre la fonte musculaire liée à l’âge. Le porteur indique des indurations possibles aux points d’injection et une perte de poids liée à l’âge ou à des tumeurs. Il affirme que le test de force ne peut se reproduire sur modèle cellulaire et que le recours à l’animal est un « prérequis réglementaire », les retombées visant les personnes âgées.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Au cours du vieillissement, la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement de façon involontaire. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : la sarcopénie (forme d’ atrophie musculaire liée au vieillissement). La sarcopénie est à l’origine d’une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d’autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. Les évènements biologiques contrôlés par le GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) sont connus pour être activés dans certaines conditions conduisant à une atrophie musculaire (écrasement du nerf par exemple): leur activation permet de contrer les effets de la fonte musculaire. Dans le cas du vieillissement, il a été montré que l’expression de GDF5 diminue dans les muscles, et que la sur-expression locale de la protéine recombinante rGDF5 dans un muscle de souris âgée augmente la masse musculaire. Des études de preuve de concept réalisées à une concentration unique de rGDF5 ont permis de mettre en évidence une amélioration du poids et de la force musculaire chez des souris âgées, ce qui permet d’envisager une transposition clinique de cette molécule chez des patients atteints de sarcopénie. Dans cette optique, ce projet aura pour but de définir la dose minimale efficace de rGDF5 nécessaire pour améliorer le poids et la force musculaire dans un modèle murin de souris âgées.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris devraient consister en une stabilisation ou une augmentation du poids des muscles, une amélioration de la composition corporelle (ratio masse grasse/masse maigre), de la communication nerf-muscle (mesurée par un test de l’activité électrique transmise du nerf au muscle) et de la force globale et spécifique des muscles, ainsi qu’une amélioration de la survie à 24 mois. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace de la molécule thérapeutique rGDF5 afin d’envisager dans un second temps une transposition en clinique chez le sujet âgé. Plus de 25% des personnes âgées de plus de 70 ans étant affectées par la sarcopénie, le bénéfice en termes de santé, et par voie de conséquence en termes de financement des soins liés à cette pathologie, est potentiellement très important.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris subiront deux injections sous-cutanées par semaine pendant une durée de 18 semaines. Chaque injection dure environ 1 minute. Des prélèvements de sang seront réalisés à 4 points de temps: au moment de l’inclusion des souris, puis 15 jours et un mois après l’administration, et en fin de protocole. Chaque acte ne durera pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures d’électroneuromyogramme espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 5 mesures d’impédencemétrie, espacées chacune de 1 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l’euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées en fin de mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous utiliserons des souris âgées de 20 à 24 mois qui peuvent présenter une perte de poids possible due à l’âge ou développer des tumeurs. L’injection de protéine rGDF5 par voie sous-cutanée deux fois par semaine pourrait entrainer la formation d’indurations aux points d’injection.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Euthanasie pour prélèvements des organes et évaluation de l’efficacité du traitement.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le projet a pour but de mesurer l’effet thérapeutique de la molécule rGDF5 au niveau de la musculature dans un modèle de vieillissement, notamment par des mesures de force musculaire: le test de force ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n’existe pas de modèle cellulaire ou d’organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle dans toute leur complexité. De plus, le recours à l’animal est un prérequis réglementaire pour les études d’efficacité non-cliniques. L’utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.
2. Réduction
Afin de respecter le principe de réduction du nombre d’animaux, nos prévisions d’effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une augmentation de la force musculaire de 14% minimum. Le calcul permet de conclure que 8 animaux sont nécessaires par groupe. Considérant l’expérience de nos collaborateurs, une mortalité élevée de 35% en moyenne a été observée chez les souris entre l’âge de 20 et de 24 mois: pour cette raison, l’effectif a été majoré, soit 8 animaux + 4 animaux supplémentaires = 12 animaux par groupe de souris par condition afin de permettre une analyse statistique fiable et d’éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo n’empêche la bonne exploitation des résultats.
3. Raffinement
Les souris étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s’avéraient nécessaires. Les animaux étant âgés, ils seront observés attentivement 2 fois par semaine. Tous les tests fonctionnels seront réalisés dans une pièce dédiée isolée du lieu d’hébergement, dans un environnement calme. Les grip tests ne sont pas source de stress pour l’animal, qui s’agrippe naturellement à la grille. Pour l’ENMG ou la mesure de la force sur le TA, afin d’éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse pour l’ENMG et sous anesthésie générale pour la mesure de force sur le TA. La mesure d’impédencemétrie n’est pas douloureuse (courant de très faible intensité), mais les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour permettre le placement des électrodes et les mesures. Au cours des différentes procédures, les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leurs corps A l’exception du test de mesure de force sur le TA qui est terminal, en fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu’à leur réveil. Après l’ENMG, ils recevront par voie sous-cutanée un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h. Ils seront ensuite surveillés très attentivement et pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de relever le moindre signe de souffrance. Les prélèvements de sang se feront par voie sous-mandibulaire durant le protocole et par voie rétro-orbitale au moment de l’euthanasie. Dans le cas du prélèvement sous-mandibulaire, l’animal sera maintenu par contention, des lancettes à usage unique seront utilisées puis une compresse sera appliquée quelques secondes au point de prélèvement pour stopper le saignement. Les souris seront surveillées individuellement après les prélèvements pour s’assurer que le saignement ne reprend pas, et un nouveau point de compression sera réalisé le cas échéant. Dans le cas du prélèvement rétro-orbital, le sang sera prélevé à l’aide d’un capillaire sur animal anesthésié par la voie générale, puis la souris sera euthanasiée. Les actes seront rapides (moins d’une minute).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment la sarcopénie liée au vieillissement, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l’efficacité d’approches thérapeutiques sur ces pathologies. De plus, ce modèle permet une évaluation fonctionnelle très complète à de multiples niveaux, comme mis en évidence lors de sa caractérisation (Grip test, mesure de force sur TA in situ, impédencemétrie, ENMG). Les souris C57BL/6 seront des adultes âgées de 20 mois en début de protocole et de 24 mois en fin de protocole afin que la sarcopénie soit à un stade avancé. Ces âges ont préalablement été définis par nos collaborateurs lors de la preuve de concept de l’efficacité de rGDF5. La caractérisation du modèle à donc également été réalisée à ces âges.