Enseignement supérieur

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique pour l'implantation d'un organoïde cérébral humain, puis sont tuées deux à quatre semaines plus tard pour prélèvement du cerveau, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants, à raison d'un animal par étudiant et par instructeur. Le porteur décrit longuement les mini-cerveaux humains cultivés in vitro, tout en affirmant qu'ils cessent de croître après cinq semaines faute d'irrigation. Il justifie l'implantation chez la souris par la nécessité de leur fournir sang et nutriments.

Objectifs

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes utilisées dans le domaine de la neuroscience. Pendant cette formation, nous travaillerons sur les organoïdes cérébraux, une masse de cellules mimant la structure et les fonctions principales du cerveau. Les organoïdes sont cultivés en laboratoire et Ils sont composés de tissus hétérogènes complexes, similaires au cortex cérébral immature. Pour faciliter leur maturité, ils sont transplantés dans le cerveau des rongeurs ce qui les permettre de développer leur système vasculaire. Cette technique permet de modéliser les affections cérébrales congénitales et les troubles neuropsychiatriques. La technique a aussi favorisé l'étude du développement du cerveau. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie leur permettra de réduire le nombre d’animaux lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilises lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

Les animaux suivront une chirurgie stereotaxique pour implanter une organoïde cérébral. Entre deux - quatre semaines plus tard, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques. Tous les animaux suivront donc 2 procédures: Chirurgie stereotaxique (Durée prevue: 1 heure) + euthanasie.

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post-opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice, perte de poids. Dans des cas très rares, le couvercle en verre peut se décoller.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Les mini-cerveaux humains sont produits à partir de cellules souches humaines qui vont se différencier en cellules cérébrales et se développer en une structure mesurant quelques millimètres et imitant la structure physique et cellulaire d’une version complète du cerveau humain. Avec la culture in-vitro, les structures cessent de croître au bout de cinq semaines, car l’oxygène et les nutriments nécessaires n’arrivent pas à atteindre les cellules les plus internes. L’implantation d’organites du cerveau humain dans un cerveau de souris leur donne en revanche tout ce dont ils ont besoin pour grandir et se développer. Le cerveau hôte fournit effectivement suffisamment de sang et de nutriments aux mini-cerveaux pour les maintenir en vie et leur permettre de se développer pendant des mois. En l’espace de deux à 12 semaines, les organoïdes faisaient germer des neurones supplémentaires, y compris ceux trouvés dans des régions très spécifiques du cortex humain : des cellules gliales (y compris les astrocytes) et des cellules souches neurales. Au bout de 14 jours, presque tous les organites développent un riche réseau de vaisseaux sanguins transportant des nutriments et de l’oxygène, leur permettant de survivre jusqu’à 233 jours. Leur structure et leur maturation cellulaire étaient celles d’un nouveau-né.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs. Nous utiliserons un animal par étudiant et par instructeur soit 30 souris/an.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score entre 6 - 16, une injection de carprofène s.c. (dose 5 mg/kg pour souris) sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation est supérieur à 11 durant 2 jours consécutifs l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Avec la culture in-vitro, les organoides cessent de croître au bout de cinq semaines. L’implantation dans un cerveau de souris leur donne tout ce dont ils ont besoin pour grandir et se développer. Le cerveau hôte fournit suffisamment de sang et de nutriments aux mini-cerveaux pour les maintenir en vie et leur permettre de se développer pendant des mois. En l’espace de deux à 12 semaines, les organoïdes faisaient germer des neurones supplémentaires, y compris ceux trouvés dans des régions très spécifiques du cortex humain. Au bout de 14 jours, presque tous les organites développent un riche réseau de vaisseaux sanguins transportant des nutriments et de l’oxygène, leur permettant de survivre jusqu’à 233 jours. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

300 rongeurs, 150 souris et 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés d'une séance à l'autre. Les animaux sont utilisés lors de travaux pratiques où des stagiaires apprennent la préhension, la contention, les injections sous-cutanées et intra-gastriques et la surveillance sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique une douleur légère liée aux injections et un stress de manipulation, les gestes étant d'abord répétés sur mannequins et cadavres. Il présente cette formation réglementaire à l'expérimentation comme "indispensable" et met en avant la sensibilisation au "bien-être" des animaux non-humains.

Objectifs

Notre formation a pour vocation à former des personnels à la manipulation et la réalisation de procédures expérimentales sur animaux de laboratoire. Cette formation est ouverte aux techniciens des laboratoires publics et privés dans le cadre de la formation continue, ainsi qu’à des étudiants en cursus initial de licence professionnelle. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Au cours d’une procédure, le technicien doit ainsi être en mesure d’évaluer le degré de mal-être causé à l’animal et d'adapter ses pratiques afin de prévenir et de limiter ce mal-être au maximum. Cela nécessite un apprentissage, réalisé durant plusieurs séances de travaux pratiques. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont multiples : familiarisation des stagiaires avec les animaux et sensibilisation au respect du bien-être animal ; apprentissage des règles d’hygiène et de sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale ; apprentissage des calculs de dilution et de dose à injecter, connaissance du matériel nécessaire aux injections et aux prélèvements, préparation de ce matériel, notions d’asepsie ; acquisition des compétences techniques de préhension, contention et d'injections (sous-cutanée, intra-gastrique) ; acquisition de connaissances théoriques sur l’anesthésie et apprentissage des paramètres à prendre en compte et à surveiller pour assurer le confort de l’animal sous anesthésie ; acquisition de connaissance sur les cycles de reproduction et les méthodes d'élevage des rongeurs et lagomorphes. Pour répondre à ces objectifs, les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des techniciens avec les rongeurs de laboratoire. Ils sont réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants qualifiés et expérimentés portant grande attention au bien-être animal. Des enseignements plus théoriques de réglementation et d’éthique, d’éthologie, de physiologie du stress et de la douleur viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent.

Bénéfices attendus

A l’issue de notre formation, il est attendu que les stagiaires se soient familiarisés avec les rongeurs de laboratoire (souris et rats), et qu’ils aient acquis des gestes techniques couramment utilisés en expérimentation animale (préhension/contention, injections, surveillance et soins pendant l'anesthésie). Nous souhaitons avant tout les sensibiliser au bien-être animal et à l’importance de l’éthique en expérimentation animale.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. La première consistera uniquement à de la préhension-contention, et les stagiaires se seront préalablement entraînés sur des mannequins rats. Pour ce faire, chaque animal sera manipulé par un stagiaire quelques minutes, pour familiarisation, puis redéposé dans sa cage. Après un temps de pause, l’animal sera à nouveau manipulé, cette fois dans le but d’acquérir la technique de contention. Cette nouvelle manipulation pourra durer plus longtemps que la première, mais sans toutefois excéder 10 min, dans l’éventualité où le stagiaire éprouverait des difficultés à réaliser le geste correctement dès le premier essai. La seconde intervention impliquera jusqu’à deux types d’injection : sous-cutanée et intra-gastrique. Chaque injection ne sera réalisée que si la contention de l’animal est maîtrisée, et sous supervision par l’enseignant. Seule l’injection sous-cutanée sera obligatoire. Les stagiaires s’entraineront une première fois sur cadavre (lors de la séance de TP anatomie), puis pratiqueront le geste sur l’animal une première fois avec une seringue sans aiguille, avant de réaliser l’injection. L’injection intra-gastrique sera facultative, en fonction des attentes et des besoins de formation des stagiaires. Les stagiaires s’entraîneront préalablement sur des mannequins rats. Dans les deux cas, la réalisation de la procédure (contention suivie de l’injection) ne devra pas dépasser 1 min. Enfin, un nombre très limité d’animaux subira une anesthésie gazeuse, qui constituera la troisième intervention. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par l’enseignant et les stagiaires seront chargés de surveiller l’animal et de tester ses réflexes pendant la narcose (sous la supervision de l’enseignant). L’anesthésie gazeuse ne sera pas maintenue au-delà du temps nécessaire pour que chaque stagiaire puisse réaliser les contrôles, et sera limitée à 20 min maximum. Chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des interventions, à l’exception de la contention dont l’apprentissage pourra nécessiter que certains stagiaires réalisent plusieurs tentatives avant de maîtriser la technique.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures appliquées lors des séances de TP sont de degré de sévérité modéré. Pour chaque procédure, il est prévu que l’enseignant en explique le principe et les étapes, puis qu’il réalise une démonstration avant que les stagiaires s’y exercent, toujours sous sa surveillance. Il n’est donc pas attendu que les animaux souffrent au-delà du stress induit par la manipulation et de la douleur légère liée à une injection. Si un accident venait toutefois à se produire, lors d’une mauvaise manipulation par un stagiaire malhabile et/ou stressé par exemple, l’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal et les zootechniciens le prendront en charge. Ils surveilleront quotidiennement les animaux à l’animalerie, via l’emploi d’une grille d’évaluation du bien-être, et un traitement antalgique sera administré si besoin.

Devenir

Les procédures réalisées étant de sévérité modérée, les animaux peuvent être réutilisés au sein de ce même projet d'une séance de TP à l'autre (TP préhensions/contention, puis injections, puis anesthésie), après rétablissement complet (délai de quelques jours entre les séances de TP), ou pour d’autres projets se déroulant au sein de notre établissement (TP d'apprentissage de préhension/contention et d’injections, TP de physiologie-pharmacologie), après vérification de leur rétablissement complet si jamais ils avaient présenté des signes de souffrance.

Remplacement

Le recours à la pratique de l’expérimentation animale est nécessaire à la formation des personnes qui appliqueront des procédures expérimentales sur animaux, et conforme à l’agrément de cette formation réglementaire. Il apparaît indispensable que les stagiaires se familiarisent avec les animaux et qu'ils maîtrisent des gestes techniques classiquement utilisés lors de procédures expérimentales. Toutefois, les stagiaires commenceront par s’entraîner aux gestes techniques sur des modèles inertes (cadavres et/ou mannequins), afin de remplacer l’animal au stade le plus critique de l’apprentissage.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est limité au strict nécessaire, à savoir un animal de chacune des deux espèces considérées (c'est-à-dire un rat et une souris) par stagiaire et par séance, afin que les stagiaires soient en mesure de s'entraîner et d'acquérir les gestes techniques dispensés au cours des séances de TP de la formation. Cependant, les mêmes animaux seront réutilisés d'une séance à l'autre, afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. De plus, chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des procédures (à l’exception de la contention), et le nombre de procédures est très limité (certains actes ne sont abordés que par des vidéos de démonstration).

Raffinement

Le respect du bien-être animal est au cœur de l'approche pédagogique employée pendant les séances de TP, et les encadrants veillent à enseigner les bonnes pratiques pour la réalisation des gestes techniques dans un cadre éthique et réglementaire. Avant de pratiquer les procédures sur les animaux, les stagiaires doivent s’entrainer en répétant les gestes sur des mannequins (contention, injection intra-gastrique) ou des cadavres (injection sous-cutanée). Dans le cadre des injections, ils doivent également réaliser le geste une première fois sans aiguille ou sans sonde, avant de procéder à l’injection. Enfin, dans le cadre de l’anesthésie, le bien-être de l’animal est assuré par l’application d’un gel hydratant sur les yeux et l’utilisation d’un tapis chauffant pour prévenir l’hypothermie.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux de laboratoire les plus utilisés. La souris et le rat représentent ainsi les modèles animaux que les stagiaires seront le plus susceptibles de rencontrer dans leurs activités professionnelles. Nous utiliserons des adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux. Pour les rats, nous utiliserons des femelles afin de permettre la réalisation de frottis vaginaux lors de la 3ème séance de TP. Pour les souris, nous utiliserons également des femelles, plus dociles que les mâles.

3 porcs vont être utilisés dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés. Chaque animal est placé sous anesthésie générale profonde pendant deux heures, non pour produire des connaissances mais pour tester une nouvelle technique d'anesthésie et y former le personnel. Le porteur présente ce projet comme un raffinement destiné à améliorer le "bien-être" des animaux non-humains et la récupération après opération. Il décrit le porc comme un sujet "indispensable" de ses expérimentations, dont le personnel doit maîtriser les spécificités.

Objectifs

L’objectif premier est l’amélioration du bien-être animal en raffinant la procédure d’anesthésie utilisée dans le cadre de la chirurgie expérimentale. Celui-ci intègre l’utilisation de molécules halogénées plus récentes, avec moins d’effets secondaires en particulier au moment du réveil. L’objectif second s’intègre dans la formation continue et du maintien des compétences des personnels utilisateurs dans le cadre de la mise en place de cette nouvelle procédure. Ceci constituant des éléments indispensables et réglementaires dans le cadre européen et français de la recherche animale (directive européenne 2010/63/UE).

Bénéfices attendus

La finalité de ce projet est l’amélioration du bien-être animal et du respect de la règle des 3R en particulier sur le raffinement des procédures d’anesthésie profonde. Celui-ci a pour but de permettre un réveil plus rapide et une meilleure récupération post-opératoire des animaux.

Procédures

Procédure unique sous anesthésie générale profonde-Durée maximale 2 heures

Impact sur les animaux

Procédure sous anesthésie générale longue de 2h pouvant causer un stress

Devenir

Cette procédure expérimentale est classée en classe modérée permettant une potentielle réutilisation des animaux.

Remplacement

Préalablement à la mise en pratique des acquis sur modèle porcin, une session de mise à jour des connaissances théoriques en anesthésie et de formation au nouveau matériel anesthésique sera réalisée pour l’ensemble du personnel.

Réduction

Le nombre maximum estimé d’animaux nécessaire à cette mise en place et cet enseignement est de 3. De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires, une mise en pratique anesthésique sera suivie par plusieurs membres du personnel. En l’absence d’événement anesthésique secondaire au cours de la procédure et cas d’une acquisition des compétences par l’ensemble du personnel, l’ensemble des animaux ne seront pas inclus.

Raffinement

Ce nouveau protocole d’anesthésie constitue un raffinement et une amélioration du bien-être des animaux puisqu’il permet un réveil plus rapide et améliore ainsi la récupération post-opératoire de l’animal quelque soit la procédure chirurgicale réalisée et sa durée. Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale. La fréquence d'observation des animaux est doublée au réveil, passant de 3 à 6 fois par jours, et consiste en des examens cliniques de l’animal vigile, permettant une prise en charge individuelle et adaptée. Les animaux seront hébergés avant protocole expérimental en groupe en box (par 1, 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce), de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités seront hébergés en box séparés, mais au sein d'une même pièce permettant la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire.

Choix des espèces

Notre laboratoire travaille sur le grand animal dont le porc. Il nous semble donc indispensable de pouvoir adapter cette nouvelle procédure à cette espèce et proposer sa formation au personnel pour appréhender les spécificités de l'espèce et améliorer leur bien-être.. Porcs : Jeune adultes, 6-8 mois, 80Kg. Principaux sujets utilisés dans nos expérimentations.

360 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le cadre de travaux pratiques d'un cursus universitaire. Elles reçoivent deux à quatre injections intrapéritonéales et servent à des tests comportementaux, dont une échelle des grimaces, en étant manipulées par des étudiants que le porteur décrit lui-même comme non formés. À la différence de la plupart des projets, elles sont proposées à l'adoption à l'issue plutôt que tuées. Le porteur reconnaît qu'un remplacement total n'est pas possible pour l'apprentissage des gestes sur animal vivant mais prévoit des vidéos en complément.

Objectifs

Au cours de cette formation, les étudiants doivent ainsi être sensibilisés à l'expérimentation animale voire plus. En effet comme mentionné dans le programme national de cette formation, "les étudiants pourront être accompagnés, au cours de leur formation, dans la préparation de tout ou partie du certificat d'expérimentation animale, niveau applicateur." Ce projet comptabilisant 3 expérimentations différentes permettra aux étudiants, en complément des autres enseignements théoriques et pratiques, d'aborder plusieurs notions liées à l'expérimentation animale à savoir la réglementation, l'éthique, le bien-être, les gestes expérimentaux basiques avec des rongeurs de laboratoire (contention, injection, etc). Plus spécifiquement, au travers de ces 3 expérimentations, les étudiants : i) appréhenderont ce qu'est le métier de technicien animalier par le suivi et le soin aux animaux, ii) apprendront à manipuler et à réaliser des injections aux souris et iii) à étudier les comportements des souris en activité normale mais aussi dans le cadre d'une étude de l'effet de substances actives pharmacologiquement aux moyens de tests comportementaux, d'échelle des grimaces, etc.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre de cette formation. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence, : i) Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques. Cet AC sera abordé via les expérimentations n°2 et 3 ; ii) Acquérir les gestes expérimentaux basiques sur l'animal de laboratoire. Cet AC sera abordé via les 3 expérimentations de ce projet. Le contenu de ce projet répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques de la Ressource "Physiologie et Expérimentation animale" et de la SAé associée. Pour résumé, au travers des enseignements théoriques et pratiques (entre autres par ce projet), les étudiants auront ainsi une vision d'ensemble sur ce qu'implique l'expérimentation animale (réglementation en vigueur, éthique, bien-être, gestes de base, dispositif expérimental, pharmacologie...).

Procédures

Les animaux utilisés dans cette procédure ne seront pas soumis à ce type d'interventions. Ces animaux seront soumis uniquement à 2 (voire 4 injections pour les souris participant 2 fois à la expérimentation n°3) en intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux seront confrontés à différentes nuisances : 1) le maniement par des personnes non formées et inconnues (ce dernier point sera amoindri au cours du temps car les souris seront toujours suivis par les mêmes étudiants. Nous essaierons également en TP qu'ils aient les mêmes souris que pendant le suivi; 2) l'utilisation dans 3 expérimentations différentes mais cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés 3) injections de substances thérapeutiques à dose active mais ces substances ont une durée de vie courte dans l'organisme donc les effets s'estomptent quelques heures après l'injection.

Devenir

Pour le bien-être animal, l'adoption est à privilégier dans notre cas, d'autant plus que les étudiants les ayant suivies 3 semaines y sont attachés. Il est à noter que lors des adoptions, un sachet de granulés ainsi qu'un peu de litière de leur cage d'origine sont donnés aux adoptants pour l'acclimatation de l'animal dans son nouvel environnement et des recommandations telles que l'introduction progressive de la nouvelle alimentation sont données. Pour finir, les étudiants comme les associations permettant la réhabilitation des animaux de laboratoire, reçoivent le certificat sanitaire de notre vétérinaire référent et l'autorisation triennale de la DDPP.

Remplacement

Il est difficile d'acquérir des compétences en expérimentation animale sans l'utilisation de l'animal in vivo c'est pourquoi un remplacement total n'est pas possible mais un remplacement partiel l'est. En complément de ces expérimentations in vivo et dans un objectif de remplacement, des vidéos seront mises à disposition des étudiants pour qu'ils puissent en plus des enseignements théoriques et pratiques, préparer au mieux leurs interventions / expérimentations avec les animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisé est réduit au minimum. Chaque année, 72 souris seront utilisées et seront subdivisées en 2*36 souris réparties dans 8 cages (voire 9 cages selon la corpulence des souris "vieilles") : 36 souris jeunes versus 36 souris 'vieilles'. D'autre part, nous avons choisi de faire travailler les étudiants par groupe de 3 ou 4 étudiants réduisant ainsi le nombre de groupe d'étudiants à 4 par TP. Ces 8 cages seront ainsi suivis par 12 groupes d'étudiants différents impliquant que 4 cages seront suivies par 2 groupes en TP différents. D'autre part, ces 72 souris serviront à 3 expérimentations. Les résultats des différents groupes de TP seront poolés et exploités lors de TPs de statistique. Ceci permettra de comparer les groupes de souris "jeunes" versus "vieilles". Ils pourront ainsi voir la variabilité des données selon le nombre d'animaux par lot utilisé.

Raffinement

Durant tout leur séjour au sein de notre établissement, les souris auront à disposition et sans restriction de la nourriture et de l'eau. Elles seront également visités tous les jours soit par la personne habilité pour cela au sein de l'établissement soit par les étudiants dans le cadre de l'expérimentation n°1. Selon l'âge et la corpulence des souris "vieilles", elles pourront être répartie non pas dans 4 cages mais dans 5 cages (4 cages de 7 souris + 1 cage de 8 souris). Au cours de ces visites, les animaux seront observés pour détecter tout comportement de souffrance, d'anxiété, etc... De plus, notre établissement a acquis des objets d'enrichissement tels que des tubes/ tunnel, ruban de carton. De la même façon les étudiants au cours de leur suivi pourront eux mêmes apporter des objets d'enrichissement.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude pour ce projet pour plusieurs raisons : 1- c'est l'un des modèles les plus utilisés en recherches bio-médicales et pharmacologiques (75%) 2- c'est un modèle (globalement) représentatif de la physiologie humaine (proximité phylogénétique entre les espèces). 3- leur comportement face à la manipulation, aux injections de molécules est bien documenté et des dispositifs expérimentaux sont disponibles pour le mesurer. 4- c'est une espèce facile à maintenir en captivité Les animaux utilisés auront au moins 2 mois. Il s'agira donc d'adultes car ils possèdent, théoriquement à ce stade, toutes les capacités exploratrices, psychiques et locomotrices. Cependant comme évoqué précédemment, nous aurons 2 groupes d'âge : souris "jeunes" environ 2 mois et souris "vieilles" d'au moins 4 mois et ayant eu déjà au moins 1 gestation (souris de réforme). Ce choix permettra aux étudiants d'observer le comportement de souris d'âge et de vécu différents.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants de BUT aux techniques d'expérimentation. Chaque souris reçoit quatre injections d'une neurotoxine provoquant une neurodégénérescence dopaminergique, avant une perfusion transcardiaque réalisée par l'enseignant puis le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle s'accompagne de troubles moteurs, réduction et lenteur des déplacements, qu'il juge modérés au vu de la dose et de la durée. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle non animal capable de mimer cette neurodégénérescence et justifie le projet par la "nécessité" pédagogique de la formation.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de permettre à nos étudiants, futurs techniciens de laboratoire de recherche, de faire l’apprentissage de la mise en place d’une procédure expérimentale dans un contexte physiopathologique sur animaux de laboratoire, et ce dans le respect de la réglementation et des lois d’éthique sur l’utilisation d’animaux vivants. Ce projet comprendra la caractérisation d'un dysfonctionnement moléculaire et cellulaire dans ce contexte physiopathologique qui est celui de la neurodégénerescence dopaminergique induite par l'administration systémique d’une neurotoxine chez la souris. Il permettra aux étudiants de maitriser certaines techniques d'études de ces dysfonctionnements cellulaires. Les méthodes choisies pour évaluer la perte neuronale seront des techniques immunologiques avec un immunomarquage sur coupes de cerveaux et un immunoblot sur extraits cérébraux.

Bénéfices attendus

Le projet proposé étant à visée pédagogique, les bénéfices attendus sont ceux de permettre l'acquisition de compétences telles que définies dans le programme du BUT-BMB. Ainsi, dans le cadre général de la réalisation d’une procédure expérimentale chez l'animal, tous les aspects allant de sa mise en place à sa validation auront été abordés lors d'enseignements dirigés avant d'être pratiquement effectués avec les étudiants (mise en pratique des techniques de contention et d'administration chez la souris - respect du bien-être animal - analyse comportementale des animaux - prélèvement de tissu). Ce projet permet aussi de sensibiliser les étudiants à la nécessité d'une recherche bibliographique pour faire un choix pertinent de modèle expérimental mimant une pathologie humaine (en mettant l'accent sur la connaissance des limites des modèles expérimentaux). Il permet aussi d'aborder les diverses techniques utilisées pour étudier un processus physiopathologique et/ou pour valider un modèle expérimental et éventuellement l'efficacité d'un traitement.

Procédures

Les substances testées seront administrées par voie intrapéritonéale de manière répétée (4 fois) à intervalle d'une heure. Cinq jours après ces administrations, les souris recevront une injection sous cutanée d'analgésique suivie 20 min plus tard d'une injection intrapéritonéale d'une solution anesthésiante afin de procéder à la perfusion transcardiaque d'une durée d'environ 10 min (réalisée par l'enseignant) de sérum physiologique puis de solution fixatrice avant le prélèvement du cerveau. Chacune des administrations intrapéritonéales et sous cutanées est d'une durée maximale de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Ce modèle expérimental de neurodégénérescence dopaminergique s'accompagne d'une réduction progressive de la motricité qui dépend de la dose de neurotoxine administrée. Les troubles moteurs sont donc les effets indésirables attendus (réduction et lenteur des déplacements). Cependant, l'importance de ces troubles devraient être modérée au regard de la dose de neurotoxine choisie et de la durée de la procédure expérimentale (5 jours). Afin de palier l'éventuel impact de ces troubles moteurs sur la prise alimentaire de la souris, des croquettes seront directement mises à disposition de l'animal dans sa cage. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée par l’enseignant pendant les 5 jours précédents la mise à mort : surveillance de l'aspect général de la souris, de sa prise alimentaire et hydrique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure expérimentale lors de la perfusion transcardiaque réalisée par l'enseignant avant le prélèvement du cerveau. Le cerveau est l'organe cible de la neurotoxine sur lequel sera réalisé l'évaluation de la neurodégénérescence dopaminergique.

Remplacement

Le projet s’inscrivant dans le cadre d’une SAÉ (Situation d'Apprentissage et d'Évaluation) consacrée à la réalisation d’une étude moléculaire et cellulaire dans un contexte physiopathologique (SAÉ 3.BMB.02), il permet de répondre aux objectifs et problématique professionnelle de la SAÉ : « inscrire les expérimentations dans un contexte physiopathologique pour caractériser et ou proposer un modèle d’étude ». De plus, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux car il n’existe pas de modèle expérimental non animal capable de mimer la neurodégénerescence dopaminergique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum tout en considérant un nombre suffisant pour permettre aux étudiants de tester chaque condition expérimentale. Ainsi, la promotion de 2° année de BUT étant divisée en 4 groupes de TP, les étudiants de chaque groupe travailleront en trinôme avec un total de 4 trinômes par groupe de TP. Chaque trinôme testera chaque condition expérimentale (au nombre de 2) sur une seule souris (condition contrôle, injections de sérum physiologique versus condition perte neuronale dopaminergique, injections de MPTP).

Raffinement

Ce protocole a été adapté pour limiter l'inconfort et le stress des animaux. Une phase d'acclimatation des animaux à leur nouvel environnement (animalerie du département Génie biologique de l'IUT) est instaurée une semaine avant la mise en oeuvre de l'expérimentation au cours de laquelle les animaux sont manipulés par le personnel technique et l'enseignant (préhension et déplacement des cages). Toutes les administrations de substances effectuées par l’étudiant sont pratiquées sous le contrôle de l’enseignant encadrant la SAÉ dans une salle de travaux pratiques du département dédiée à la réalisation de ce projet. Une formation pratique à l’administration de substances aura déjà été faite en 1° année et consolidée au début du semestre au cours duquel sera réalisée cette étude afin de rappeler les consignes de contention de la souris et d’administration par voie i.p. La perfusion transcardiaque étant techniquement plus délicate sera quant à elle réalisée par l'enseignant sous analgésie et anesthésie profonde induites par les étudiants. Une surveillance des animaux sera instaurée après administration des substances jusqu’à la mise à mort (2x par jour pendant 5 jours post-injection (troubles moteurs – troubles du comportement – contrôle de la prise alimentaire et hydrique – contrôle de l’aspect général). Cette surveillance sera effectuée par l’enseignant responsable du projet. Les souris sont placées dans des cages enrichies avec divers objets (copeaux et tunnel en carton). Enfin, les étudiants sont sensibilisés au bien être animal et à la règle des 3R depuis la 1° année de leur formation. L'ensemble du personnel (enseignants - technicien animalier) dispose d'une formation et qualification adéquate à l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Outre le primate non-humain, la Souris est l’espèce animale la plus utilisée pour réaliser ce modèle expérimental. De plus, il s'agit plus particulièrement de la souche C57Bl/6J qui est utilisée pour induire la perte neuronale dopaminergique à l’aide de la neurotoxine MPTP. En effet, cette souche est sensible à cette neurotoxine de manière dose-dépendante, ce qui permet de contrôler l'intensité des troubles moteurs et de mimer divers stades de la pathologie humaine. De plus, une administration systémique peut être réalisée chez la Souris car la neurotoxine passe la barrière hématoencéphalique chez cette espèce alors qu'une administration intracérébrale est requise chez le Rat en raison de sa très faible biodisponibilité cérébrale (dégradation enzymatique de la substance par l'endothélium avant son passage de la barrière hématoencéphalique). Les souris utilisées sont des individus adultes qui doivent avoir atteints leur maturité cérébrale (environ 6 semaines)