Enseignement supérieur

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées comme animaux de réforme ou pour d'autres travaux pratiques. Hébergées seules pendant cinq jours en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite, elles reçoivent un diurétique dans leur nourriture pour que des étudiants de Master mesurent la fonction rénale. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel génère des nuisances, tout en jugeant le traitement sans gravité. Il indique que l'usage de rongeurs reste "nécessaire" à la formation, l'étude des effets du diurétique ne pouvant selon lui se faire que sur un animal.

Objectifs

Ce projet est dispensé sous la forme de séances de travaux pratiques pour des étudiants de première année de Master. Il a pour objectif de les initier à l'expérimentation en cage à métabolisme pour évaluer les fonctions rénales à l'aide d'analyses statistiques à partir de données biologiques qu'ils auront collectées. Plus particulièrement, les étudiants seront amenés à tester les effets d'un diurétique (le furosémide) utilisé couramment en médecine humaine pour diminuer le volume sanguin, chose souhaitable dans le cadre de certaines maladies à oedèmes, l'hypertension artérielle ou les insuffisances cardiaques. D'un point de vue pratique, le furosémide est adapté à une expérimentation courte car ses effets sont rapides. Celui-ci provoque une augmentation du volume des urines, et donc une diminution du volume sanguin.

Bénéfices attendus

Ces séances de travaux pratiques visent à familiariser les étudiants de première année de Master à l'analyse in vivo de la fonction rénale de souris placées en cage à métabolisme, ce qui permet également de les sensibiliser aux problèmes méthodologiques de ce type d'expérimentation qui a pris une place centrale dans les stratégies d'élucidation de mécanismes physiopathologiques à la suite du développement de modèles animaux transgéniques. Plus globalement, ces séances de travaux pratiques permettent de familiariser les étudiants à l'utilisation des animaux à des fins scientifiques et à leur manipulation dans des conditions réglementaires.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cages à métabolisme individuelle durant une période de 5 jours. Durant cet hébergement, une diète alimentaire standard sera présentée aux animaux sous forme de nourriture en poudre, avec eau déminéralisée ad libidum. Le furosémide sera additionné à la nourriture en poudre en fin de matinée du 4ème jour jusqu'au 5ème jour. Durant les 5 jours, les urines seront collectées, et la prise d'eau et de nourriture seront mesurés. Ces analyses ne nécessitent pas la manipulation des animaux. En revanche, le poids des animaux sera déterminé quotidiennement et nécessitera la sortie des animaux de leur cage à métabolisme le temps de leur pesée (30 secondes à 1 minute). Pour cette mesure, les animaux seront manipulés à l'aide d'un tube en polycarbonate.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cages à métabolisme. Celles-ci sont transparentes et disposées les unes à côté des autres. Cela permet le maintien du contact visuel, olfactif et acoustique entre les congénères. Les cages seront placées dans une pièce dédiée, calme, avec une température contrôlée à 22°C +/-2°C et bénéficiant d’une périodicité jour/nuit de 12h/12h. Cependant, ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement, et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Hormis l'hébergement en cage à métabolisme, le traitement au furosémide durant une journée ne relève d'aucune gravité. Celui-ci provoque transitoirement l'augmentation de la diurèse des animaux, mais celle-ci ne s'accompagne pas d'une déshydratation car les animaux ont libre accès l'eau de boisson durant toute la procédure expérimentale.

Devenir

Le traitement au furosémide des animaux durant une journée n'entraîne aucun phénotype dommageable. En conséquence, tous les animaux pourront être réutilisés par l'EU comme animaux de réforme, ou pour d'autres types de séances de travaux pratiques (démonstration de la préhension/contention d'animaux, ...).

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (études de films, analyses d'articles scientifiques, méthodes in vitro, ...) est préféré. Toutefois, l'un des objectifs de la formation en Master à laquelle les étudiants sont inscrits est notamment de les former à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les différentes fonctions physiologiques et pathologiques chez les animaux ou l’humain. De ce fait, l'utilisation de rongeurs reste nécessaire : l'étude des effets d'un diurétique (furosémide) sur la fonction rénale ne peut se faire que sur un animal. Durant les expérimentations, une attention particulière sera portée aux points limites nécessitant une euthanasie de l'animal.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et est dispensé une fois par an. Chaque année, l'effectif est volontairement limité à 24 étudiants répartis en 4 groupes afin de tenir compte des exigences liées à la surface d'expérimentation de la pièce dédiée à l'hébergement en cage à métabolisme. Les résultats de chaque groupe seront analysés séparément. Ce projet nécessite 6 souris par groupe d'étudiants, soit un total de 120 souris (4 groupes d'étudiants x 6 souris par groupe x 5 ans). Par ailleurs, nous limiterons le nombre d'animaux en réalisant les expériences sur un même animal, car les mêmes animaux fourniront les données contrôles (jours 10 et 11) et les données provenant du test au furosémide (jour 12). Par ailleurs, le traitement au furosémide des animaux durant une journée n'entraîne aucun phénotype dommageable. En conséquence, tous les animaux pourront être réutilisés comme animaux de réforme, ou pour d'autres types de séances de travaux pratiques (démonstration de la préhension/contention d'animaux, ...).

Raffinement

Préalablement à leur hébergement en cages à métabolisme, les animaux en provenance du fournisseur agréé subiront une période d'acclimatation de 7 jours en stabulation (accès libre à la nourriture et à de l'eau filtrée) dans des cages ventilées (maximum 5 animaux par cage) dans les locaux de l'établissement utilisateur, et selon les normes en vigueur dans cet établissement utilisateur (température de 22-24 °C, éclairage de 7h à 19h, régime standard, litière : rafle de maïs, change une fois par semaine). Par ailleurs, l'environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal et des cylindres en carton. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur, et selon les mêmes normes que celles liées à l'hébergement en cages ventilées (température de 22-24°C, et éclairage de 7h à 19h). Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Le taux d’encadrement des étudiants sera d’un enseignant par groupe d’étudiants (soit 6 étudiants), ce qui est élevé dans les conditions standards de travaux pratiques (1 enseignant pour 20 étudiants). Cela permettra d’assurer une vigilance constante sur la mise en œuvre des bonnes pratiques d’expérimentation par les étudiants.

Choix des espèces

Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris en raison de l'existance de nombreuses données publiées dans la littérature concernant les effets du furosémide sur la fonction rénale de ces animaux. Nous utiliserons des souris adultes jeunes âgées de 8-10 semaines dans le but d'évaluer les effets du furosémide sur le phénotype rénal à un stade pour lequel la fonction rénale n'est pas physiologiquement altérée par l'âge.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour l'enseignement en BUT. On leur injecte du cyclophosphamide pour provoquer une inflammation de la vessie et une hypersensibilité, testée par stimulation mécanique de l'abdomen au filament, puis un traitement, avant prélèvement des organes pour des travaux pratiques d'histologie et de biochimie. Chaque binôme d'étudiants prend en charge trois souris pour comparer les situations traitée et non traitée. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne remplace ce protocole car l'intégration de la douleur implique tout le système nerveux.

Objectifs

Le projet comprend l'utilisation d'un modèle animal d'inflammation viscérale qui sera utilisé de manière transversale dans la SAE (situation d'apprentisage et d'évaluation) 3.02 par les étudiants inscrits en BUT du département de Génie Biologique. Une fois l'inflammation induite, un traitement pharmacologique sera adminsitré au temps 4 heures post induction. Les animaux seront évalués sur leur phénotypoe douloureux puis mis à mort pour prélèvements d'organes cibles qui seront utilisés pour des analyses immunohistochimiques et biochimiques et moléculaires ultérieures. Cette formation a été validées par le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Les DUTs sont régis par un Programme Pédagogique National (PPN) et la Licence professionnelle BIB a une formation acréditée dans le cadre de son dossier d'enseignement.

Bénéfices attendus

Ce modèle d'inflammation aigue réalisé chez la souris permet de mettre en pratique les notions sur la physiopathologie et la pharmacologie de l'inflammation et de la douleur vues en cours par les étudiants. Les prélèvements réalisés en point final serviront à des travaux pratiques d'histologie, de biochimie et de biologie moléculaire permettant un enseignement pluridisciplinaire sur un même modèle d'étude pertinent cliniquement.

Procédures

Le jour de l'expérimentation, les animaux subiront une injection intra-péritonéale de cylophosphamide ou de Nacl0.9, puis, 4 heures après une injection sous cutanée de prégabaline ou de Nacl0.9. Il seront testés trois fois, une fois avant chaque injection, et une fois 30 minutes après l'injection de prégabaline avec un test permettant d'évaluer leur sensibilité à une stimulation mécanique.

Impact sur les animaux

Ce modèle induit une inflammation localisée au niveau de la vessie entraînant une hyperactivité de cet organe et une hypersensibilité qui peut être révélée par stimulation mécanique de l'abdomen de l'animal. Ce modèle répond bien au traitement à la prégabaline.

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux pour prélèvements de tissus et de sang pour des analyses de biochimie, d'immunohistochimie et de biologie moléculaire ultérieures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Chaque binome d'étudiant aura trois souris en charge (une traitée avec le véhicule, une avec le cyclophopshamide à 150mg/kg, ip et une avec du cyclophosphamide à 150mg/kg, ip et de la prégabaline à 30 mg/kg, sc) afin de comparer les divers paramètres phénotypiques, biochimiques et de biologie moléculaire entre une situation normale et pathologique avec et sans traitement et de présenter in fine ces résultats sous forme d’un mini-article scientifique. Les résultats seront groupés pour que les étudiants puissent réaliser des analyses statistiques, mettre en forme et discuter les résultats obtenus. Avec ce projet, les étudiants auront accès à des tissus sur lesquels plusieurs intervenants de disciplines variées leur permettront de pratiquer des techniques de biochimie, de biologie moléculaire et d'immunohistochimie, permettant au final de réduire considérablement le nombre d'animaux qui aurait été nécessaires pour tous ces enseignements s'ils n'étaient pas mutualisés. Par ailleurs, dans la mesure du possible, les animaux utilisés dans ce projet pourront être des animaux utilisés préalablement au sein de l'IUT à visée de prise en main par les étudiants afin de réduire le nombre global d'animaux utilisés au sein de la structure.

Raffinement

Le test de von frey est réalisé avec un filament fin (0.16g) appliqué sur un temps court permettant une évaluation de la sensibilité mécanique de l'animal sans induire de souffrance . Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h à la salle d'expérimentation. Des points limites, précoces et spécifiques sont définis qui conduisent si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Les étudiants auront préalablement été formés en BUT1 et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Un enrichissement du milieu est apporté (tunnel en plastique et des briquettes en bois à ronger) afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux.

Choix des espèces

La souche CD1 est utilisée au sein du département de Génie biologique depuis de nombreuses années. C'est un bon modèle pour les études comportementales, qui est par ailleurs peu stressé, donc facile d'utilisation par les étudiants de notre formation. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines), comme généralement utilisés par la communauté scientifique

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de thioglycolate qui provoque une inflammation du péritoine, puis sont tuées quatre jours plus tard pour un lavage péritonéal et un prélèvement d'organes. L'objectif relève de l'enseignement, fournir des cellules immunitaires à des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur invoque la "stricte nécessité" réglementaire et affirme que ces objectifs ne peuvent être atteints sans recours à un "animal modèle de l'Homme".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans une démarche pédagogique visant à former des étudiants sur les approches en biologie. Ce projet a pour but de récolter des cellules immunitaires pour mettre en culture primaire. Donc pour améliorer la production il est indispensable d'augmenter le nombre de cellules immunitaires prélevables par animal suite à une injection intrapéritonéale d'un activateur de la production de cellules immunitaires. Les cellules prélevées permettront de réaliser des cultures primaires afin de montrer aux étudiants les différentes approches de biologie cellulaire réalisables pour étudier les réponses immunitaires. Il n'existe à ce jour pas de bon modèle de cellules issues de lignées pour étudier les réponses immunitaires sans avoir recours aux prélèvements chez les animaux. Le but de ces travaux pratiques est également de le démontrer en comparant les réponses immunitaires obtenues sur lignées et sur les cellules issues des animaux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette expérimentation est de de former les étudiants en leurs présentant des techniques qui permettent de limiter le nombre d'animaux mais également que les lignées cellulaires peuvent ne pas suffire pour étudier certains domaines de la biologie Cette technique d'induction nous permettra d 'utiliser moins de souris et d'avoir suffisement de cellules circulantes de la réponse immunitaire (macrophages) pour mettre à la disposition des travaux pratiques. En effet, les prélèvements sanguins chez la souris ne permettent pas d'obtenir suffisamment de cellules pour réaliser des expériences ex vivo sur cellules isolées, et surtout, les cellules visées ne sont pas des cellules circulantes (macrophages). Selon les données de la littérature et nos observations depuis que nous utilisons ce protocole pour les travaux pratiques l'injection intrapéritonéale de milieu thioglycolate à 3% stérile permet d'augmenter le rendement des cellules collectées.

Procédures

les souris seront soumiess à une seule injection (une minute environ) et euthanasiées 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

La procédure a été classée en "modérée" car l'injection de milieu au thioglycolate vise à induire un recrutement de macrophages en provoquant une inflammation péritonéale modérée, qui est cependant à différencier d’une péritonite aigüe en raison de l’absence d'agent infectieux et d’un profil d'activation des cellules recrutées différent (selon les données de la littérature).Les effets indésirables potentiels décrits dans la littérature sont les suivants: léthargie, perte de poids, perforation intestin ou vessie, péritonite, dommages aux organes internes. Ces 3 derniers points étant dus à une mauvaise injection , l'injection ne se fera que par un manipulateur chevronné et expert dans ce geste.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser un lavage intrapéritonéal pour collecter les cellules recrutées suite à l'injection et prélever les organes nécessaires aux expériences réalisées en TP sur 2 jours.

Remplacement

En conformité avec l’article R214-104 du code rural et de la pêche maritime, « les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information ». Le projet s’inscrit en effet dans le cadre d'activités d'enseignement visant à démontrer l'intérêt des études pré-cliniques dans un contexte de prévention de pathologies humaines et nécessite pour cela, l'utilisation de cellules immunitaires non isolables sans technique invasive. Les objectifs du projet ne peuvent donc être atteints sans recours à un animal modèle de l’Homme, en particulier pour des analyses sur des organes et cellules cibles.

Réduction

L'injection intrapéritonéale de milieu thioglycolate permet d'augmenter la quantité de cellules d'intérêt collectées et ainsi de réduire le nombre de souris utlisées. La procédure expérimentale est conçue pour être favorable sur le plan statistique en mettant en commun les suspensions cellulaires de cellules intrapéritonéales obtenues par séance de TP, ce qui permet de réaliser des triplicats avec un même nombre de cellules à partir d'un nombre limité d'animaux (6 par séance de TP soit 1 animal par étudiant pour l'intérêt pédagogique de la procédure).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions favorables à leur bien être en cage collective répondant aux normes en vigueur ( 6 animaux par cage ) . L'enrichissement sera réalisé avec des cachettes en plexiglass rouges (nid et tunnel) et des bâtons en cellulose à ronger.

Choix des espèces

La souris est un modèle universellement reconnu en immunologie. De nombreux outils et réactifs permettant d'étudier les réponses immunitaires spécifiques et fonctionnelles ainsi que pour caractériser les cellules sont disponibles pour la souris. Nous avons une bonne connaissance pratique de ces animaux et particulièrement de la souche de souris utilisée (C57/BL6) compte-tenu de leur utilisation fréquente au laboratoire pour nos études nutritionnelles. Age jeune adulte : 6 semaines (5 semaines à reception). Fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études où la réalisation d'isolement de cellules immunitaires est effectuée.

128 souris vont être utilisées, gardées en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent de support à des étudiants apprenant les prélèvements sanguins, chaque animal subissant quatre prélèvements sur quatre sites différents sous anesthésie, l'exercice étant répété une semaine plus tard puis une seconde fois avec un autre groupe. Le porteur indique que la répétition des gestes par des novices et le couplage à l'anesthésie font passer la sévérité de légère à modérée, et prévoit une réutilisation ultérieure des animaux. Il justifie l'anesthésie par le stress qu'induirait autrement la contention, et présente cette formation comme la source de techniciens "très recherchés".

Objectifs

Durant leur cursus, nos étudiants suivent une formation qui qualifie le personnel appliquant des procédures expérimentales aux animaux, spécifique aux modèles rongeurs. Cette formation réglementaire nous permet de former des techniciens hautement qualifiés en expérimentation animale, qui sont des professionnels très recherchés dans notre bassin d’emploi. Le programme de la formation inclut l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Parmi ces manipulations à maîtriser figure la réalisation de prélèvements sanguins, chez le rongeur de laboratoire. Pour permettre l’acquisition de cette compétence, les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des étudiants avec ces techniques. Durant les travaux pratiques précédents, les étudiants ont appris à réaliser la contention des animaux, des injections, leur anesthésie. Ils ont également suivi des enseignements d’éthique, de réglementation et savent évaluer le bien-être animal afin d’être en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent. Les objectifs pédagogiques de cette séance de travaux pratiques sont multiples : -Connaissance de la diversité des voies de prélèvement veineux, recommandations, méthodes, avantages et inconvénients de chacune - Connaissance des recommandations en termes de volumes maximaux et de fréquence des prélèvements sanguins -Apprentissage des règles d’asepsie, propres à la pratique de prélèvements sanguins. - Connaissance du matériel nécessaire aux prélèvements, préparation de ce matériel -Acquisition des compétences techniques de prélèvement sur veines caudale et saphène - Etude de la régulation de la glycémie, par analyse des prélèvements sanguins réalisés - Renforcement de l’apprentissage du contrôle des paramètres physiologiques et du respect du confort de l’animal durant une anesthésie

Bénéfices attendus

Au cours d’une procédure expérimentale, le technicien doit être en mesure de limiter le degré de mal-être généré à l’animal, en apportant des réponses adéquates afin de restreindre celui-ci. Ceci nécessite un apprentissage, réalisé durant des séances de travaux pratiques. Ce projet permettra à nos étudiants, futurs techniciens pratiquant l'expérimentation animale, d'acquérir la compétence de réalisation de prélèvements sanguins chez la souris, tout en veillant à respecter son bien-être. La liste plus précise des compétences acquises est décrite dans la partie Objectifs.

Procédures

Anesthésie par voie gazeuse (isoflurane) : deux anesthésies par animal, espacées d'une semaine minimum. Prélèvements sanguins : 4 prélèvements de faible volume (de l'ordre de 10 microlitres), réalisés sur des sites de ponction disctincts (2 veines sapheines et 2 veines caudales) chez la souris anesthésiée et analgésiée (buprénorphine). Ces prélèvements seront répétés une semaine plus tard, dans les mêmes conditions. La durée de l'anesthésie, durant laquelle se réaliseront les prélèvements, ne dépassera pas 1h.

Impact sur les animaux

Les actes pratiqués ici sont individuellement d’un degré de sévérité léger mais leur répétition (4 prélèvements sanguins par animal), leur réalisation par des étudiants novices et le couplage à une anesthésie pourraient les classer dans un degré de sévérité modéré. Les effets indésirables possibles, qui seront recherchés et évalués à l'aide d'une grille de scoring et conduiront à la réalisation d'un traitement antalgique adapté, sont : - une perte de poids (évaluée en pourcentage et par jour), - un comportement inadapté (comportement des animaux sans intervention du manipulateur – contractions, boiteries des pattes postérieures, position antalgique, prostration - et en réponse au geste du manipulateur : agressivité ou passivité) - une déshydratation (détectée par l’apparence physique telle que yeux plissés, enfoncés, pli de peau moins élastique …), -un aspect physique altéré (poil hérissé, sale), -une hyperventilation

Devenir

Il n'est pas justifié d'euthanasier les animaux suite à cette procédure et cela irait à l'encontre de la règle des 3R. Les animaux seront réutilisés pour d’autres projets se déroulant à l’IUT, après vérification du rétablissement total de ceux-ci si jamais ils avaient présenté des signes de souffrance.

Remplacement

Nous commençons l’apprentissage sur support non vivant, avons recours à des vidéos plutôt qu’à une démonstration sur animal.

Réduction

Réduire le nombre d’animaux : Nous commençons l’apprentissage sur support non vivant, avons recours à des vidéos plutôt qu’à une démonstration sur animal, ne recourons qu’à une souris pour deux étudiants, par séance, tout en permettant à chacun de s’entraîner au prélèvement sanguin sur deux voies distinctes, nous utilisons le sang prélevé pour étudier l’évolution de la glycémie des souris durant la séance, sans recourir à un autre TP spécifique et donc à d’autres animaux. Par ailleurs, nous aurons 7 groupes d’étudiants mais n’aurons recours au maximum qu’à quatre lots de 8 souris, chaque lot étant utilisé 2 fois, par deux groupes d’étudiants dont la séance de TP sera espacée d’au moins une semaine, de manière à permettre une totale récupération de l’animal. Après ces séances, les animaux pourront être réutilisés dans d’autres TP de notre établissement, correspondant à des procédures sans réveil ou de gravité légère (autres projets autorisés).

Raffinement

Nous aurons recours à une analgésie centrale, au moyen d’une prémédication à la buprénorphine à 2 mg/kg. Après réveil, les zootechniciens surveilleront le réveil des animaux et leur bien-être durant quelques heures puis quotidiennement à l’animalerie. Il est important qu’ils soient informés des actes réalisés sur les animaux durant les TP, de façon à connaître les douleurs potentiellement occasionnées. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux est couramment employée pour ce type d’acte. Prenant en compte des critères objectifs, elle servira à adapter un traitement antalgique. Si le traitement n’aboutit à aucune amélioration (suite à évaluations, plus fréquentes si une douleur a été détectée), l’euthanasie de l’animal sera réalisée après anesthésie (injection létale d'Exagon après anesthésie à l'isoflurane). Les animaux sont amenés en salle de TP une heure avant le début de la séance, afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Des recommandations sont données, rappelées aux étudiants à chaque séance afin que la manipulation ait lieu dans le calme. Le recours à l’anesthésie des animaux, pour des actes de prélèvement sanguin périphériques, peut sembler exagéré et nous pourrions nous contenter de placer les souris dans des tubes à contention en les maintenant en veille. Cependant, pour permettre à chaque étudiant de pratiquer ce geste tout en réduisant le nombre d’animaux, nous allons réaliser 4 prélèvements sanguins sur le même animal. Nous pensons que ceci pourrait générer, chez la souris vigile, un stress supérieur à celui induit par une anesthésie à l’isoflurane. Les animaux seront maintenus sur tapis chauffants reliés à des sondes thermiques durant l’anesthésie et seront réveillés au calme et au chaud.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en expérimentation, il est donc logique que nous formions nos étudiants à la manipulation de cet animal. Les actes de prélèvements sanguins sont fréquemment réalisés chez cette espèce. Adultes de plus de 7 semaines, habitués à la préhension et la contention, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants de master. Chaque binôme opère une souris en chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un traceur dans le cerveau, l'animal étant ensuite tué et son cerveau prélevé. Le porteur décrit la stéréotaxie comme une compétence "essentielle" à la poursuite du cursus et à l'insertion professionnelle. Il justifie le nombre d'animaux par le nombre d'étudiants, une souris pour deux.

Objectifs

L’objectif du projet est de former les étudiant.e.s aux techniques de stéréotaxie et de neuroanatomie qui sont primordiales pour leur formation en Neurosciences. La stéréotaxie est une technique largement utilisée dans les laboratoires de Neurosciences permettant de localiser précisément des régions cérébrales sur un animal anesthésié comme la souris. Cette localisation est calculée à l’aide de coordonnées données par un atlas des régions du cerveau. Ces coordonnées sont ensuite reportées sur l’appareil stéréotaxique afin de localiser la région sur le cerveau de l’animal. Cette localisation sert à injecter un traceur dans une région cérébrale d’intérêt. Les techniques neuroanatomiques permettent de visualiser ce traceur et donc les réseaux neuronaux d’intérêt dans le cerveau de souris. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser la progression d'un traceur injecté dans la structure cérébrale d’intérêt. La technique de visualisation qui sera utilisée est une technique largement utilisée dans les laboratoires publics et privés dans le domaine des neurosciences pour mettre en évidence les connexions neuronales entre différentes structures cérébrales. L'acquisition de ces compétences techniques est donc essentielle pour permettre aux étudiants la poursuite de leur cursus universitaire et pour l’apprentissage de leur futur métier.

Bénéfices attendus

La stéréotaxie est une technique d’expertise utilisée en laboratoire de recherche dans le cadre d’études neuroanatomiques, électrophysiologiques ou de le cadre du développement de stratégies thérapeutiques dans les pathologies du cerveau (principalement maladies neurodégénératives ou cancer). La technique de visualisation anatomique qui sera utilisée est une technique largement utilisée dans les laboratoires publics et privés dans le domaine des neurosciences pour mettre en évidence les connexions neuronales entre différentes structures cérébrales. Les étudiants de Master pourront donc acquérir ces compétences techniques importantes à la poursuite de ce cursus universitaire et à leur insertion dans le monde professionnel.

Procédures

Chaque animal subira une procédure chirurgicale stéréotaxique (20 min) et sera pesé 2 fois (2 min).

Impact sur les animaux

- léger inconfort lié à la procédure chirurgicale, minimisé par l'administration d'antalgique - léger stress lié à la pesée individuelle des animaux

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront euthanasiés. Le cerveau sera ensuite prélevé afin d’en identifier les réseaux neuronaux d’intérêt.

Remplacement

L’objectif du projet est de caractériser anatomiquement des réseaux neuronaux dans le cerveau de souris. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser la progression d'un traceur injecté dans la structure cérébrale d’intérêt.

Réduction

Toutes nos études utilisent des méthodes expérimentales validées et utilisées dans notre laboratoire. Nous nous affranchirons ainsi des étapes de mise au point qui auraient nécessité l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux. Cette étude sera conduite par un enseignant formé à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Le nombre d'animaux utilisé est déterminé par le nombre d'étudiants participant à cet enseignement. Nous avons réduit le nombre d’animaux à 1 animal pour 2 étudiants. C’est le nombre minimum pour assurer un enseignement efficace et exécuter l’expérimentation dans de bonnes conditions. Compte tenu du nombre d’étudiants dans la formation (20 étudiants par an), pour réaliser ces travaux pratiques, nous diminuerons le nombre de souris à 1 pour 2 étudiants soit : 20/2=10 souris par an, soit 40 souris pour la totalité du projet (4 ans).

Raffinement

Nous prendrons des mesures pour réduire la douleur, la souffrance et/ou l’angoisse des animaux par l’administration de produits anesthésiants et/ou antalgique/analgésiant. L’angoisse des animaux sera réduite car la chirurgie sera réalisée par un enseignant formé à l’expérimentation et à la chirurgie animales et compétent pour réaliser ces gestes de manière sûre, rapide et efficace. Chaque groupe d’étudiants sera encadré par l’enseignant à tour de rôle. Durant les travaux pratiques, afin de réduire le stress des animaux, ceux-ci seront hébergés dans une salle de classe sans passage d’étudiants ou de personnel et mitoyenne à celle des étudiants. Les souris de souche SWISS seront utilisées car cette souche est relativement calme et modérément sensible au stress ce qui en fait un modèle pertinent pour la formation des étudiants. La chirurgie aura lieu dans un espace dédié en fond de salle sans passage d’étudiants ou de personnel. Le bien-être des animaux sera pris en compte à chaque étape par une surveillance pendant la chirurgie : l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale seront mis en place. L’hypothermie des animaux sera limitée par l’utilisation d’une couverture chauffante reliée à une sonde rectale ce qui permettra de contrôler la température corporelle de l’animal pendant la chirurgie par le groupe d’étudiants concerné. Immédiatement après la chirurgie, les animaux seront surveillés par le groupe d’étudiants concerné puis quotidiennement par l’enseignant encadrant. Les animaux seront hébergés en groupe de deux avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et à un enrichissement (papier de nidification) leur permettant de se cacher et d’enrichir leur milieu de vie.

Choix des espèces

Les souris de souche SWISS seront utilisées car cette souche est relativement calme et modérément sensible au stress ce qui en fait un modèle pertinent pour la formation des étudiants. Les animaux utilisés seront des souris adultes (âgées de 8 semaines). L'injection du traceur se fait grâce à un équipement adapté à la souris adulte. De plus, le cerveau adulte étant plus gros cela permet de réaliser plus de coupes à partir d'un animal donc d’avoir plus de matériel d’analyse par animal et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fenêtre d'observation implantée dans le crâne sous anesthésie, puis jusqu'à neuf séances d'habituation à la contention et cinq à sept séances d'imagerie maintenues de une à trois heures, pour former une quinzaine d'étudiants par an à la technique. Le porteur revendique qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'il est "essentiel" que la formation implique des animaux vivants. Les bénéfices évoqués contre les pertes sensorielles restent lointains, l'objet réel du projet étant l'apprentissage d'un outil d'imagerie.

Objectifs

Le but général du projet est d’entrainer annuellement une quinzaine d’étudiants, sous supervision d’un spécialiste, à mesurer de manière extensive et précise les représentations sensorielles de stimuli complexes dans le cerveau de souris vigiles. Ces mesures extensives sont rendues possibles par l’utilisation de techniques d’imagerie à haute densité permettant l’enregistrement simultané de plus de 1000 neurones par expérience. La formation d’étudiants dans ce domaine permettra la généralisation de cette méthodologie qui permet d’obtenir beaucoup plus de données cruciales pour la compréhension des circuits neuronaux du cerveau pour un nombre réduit d’animaux utilisées. Dans ce projet, nous mettons en place une procédure expérimentale permettant aux étudiants, sous la supervision d’un spécialiste de prendre en main les instruments nécessaires à la réalisation de l’expérience en situation réelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’acquisition par une quinzaine d’étudiant annuellement d’une méthode qui représente une nouveauté technologique pour l’observation de l’activité cérébrale à la résolution neuronale. Le développement de cette méthode permettra de progresser dans la compréhension des mécanismes de la perception sensorielle et ainsi de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le domaine des pertes sensorielles.

Procédures

Les animaux sont soumis à 1 chirurgie d’implantation d’une fenêtre d’observation permanente sous anesthésie et analgésie puis à 9 séances maximum d’habituation à la contention (0.5 à 3h par séance). Enfin 5 à 7 séances d’imagerie en contention de 1 à 3 heures sont réalisés.

Impact sur les animaux

Ce projet inclut une préparation chirurgicale des souris occasionnant des douleurs et un inconfort modéré dans la période de récupération de 2 jours. Par la suite les souris sont habituées à la contention ce qui entraine un stress et un inconfort qui s’amenuisent après 3 jours d’habituation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour accéder à l’activité de milliers de neurones opérant le traitement de l’information sensorielle. Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux étudiants d’apprendre la méthodologie d’imagerie et la manipulation de l’équipement en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants.

Réduction

Grâce à l’utilisation des méthodes d’imagerie optiques modernes permettant d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal, et ainsi atteindre des échantillons de plusieurs milliers de neurones, permettant une précision statistique jamais atteinte. Il est donc important de développer ces techniques pour améliorer la réduction des nombres d’animaux utilisés en neuroscience. 20 animaux sont nécessaires par ans pour obtenir les dix animaux nécessaires pour le cours (4 à 5 animaux utilisés par jours et repos de 2 jour) en comptant 50% d’animaux non utilisables du fait d’aléas expérimentaux, soit 100 animaux par an.

Raffinement

La procédure expérimentale de ce projet implique une antalgie et des temps de repos appropriés pour minimiser la souffrance, un suivi quotidien des animaux, et la définition de points limites précis basés sur des indicateurs de poids, (toute perte de poids >20% est un point limite), d’aspect général et de comportement, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort s’il n’est pas possible de pallier immédiatement la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle animal en raison de l’ensemble des outils génétiques (souris transgéniques, injections virales AAV) qui sont bien établies chez cet animal, et qui permettent d’une part de manipuler différents éléments du système nerveux de manière ciblée, d’autre part de garantir une expression large et stable de certaines protéines, comme des senseurs calciques fluorescents ou des opsines (par ex. channelrhodopsin). Dans ce projet nous utiliserons les lignées GAD2-Cre, AI14D-TDT et leur croisement qui permet le marquage spécifique des interneurones dans le cortex. Pour toutes les expériences, nous utiliserons des souris adultes (de 3 à 6 mois) afin d’étudier la perception sensorielle dans un système nerveux mature.

100 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour former des étudiants. Chaque étudiant explore l'équilibre et l'audition d'une souris d'un modèle du syndrome de Usher, avec des tests comportementaux puis des tests auditifs sous anesthésie profonde. Le porteur indique qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les souris retournent ensuite dans les cages de reproducteurs de la colonie. Il affirme que l'oreille interne ne peut s'étudier in vitro et que le modèle animal reste le "seul outil disponible".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de former les étudiants sélectionnés dans le cadre de notre cours sur l’Audition à la réalisation de tests d’équilibres et de tests auditifs sur des souris adultes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à former nos étudiants aux bonnes pratiques de laboratoire dans le domaine de l’exploration des fonctions audio-vestibulaires.

Procédures

Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Chaque étudiant étudiera l’équilibre et les capacités auditives d’une souris. Un maximum de 20 étudiants sera sélectionné chaque année. Vingt souris seront de fait utilisées chaque année, soit 100 souris sur 5 ans. D’un point de vue pratique, les étudiants seront divisés en 2 groupes. Pour le groupe 1 (10 souris), les tests auditifs auront lieu le 1er jour et les tests d’équilibre le 2ème jour. Pour le groupe 2 (10 souris), les tests d’équilibre auront lieu le 1er jour et les tests auditifs le 2ème jour.

Impact sur les animaux

Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Aucun effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie.

Remplacement

Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux neurones spiraux ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et les troubles de l’équilibre.

Réduction

Chaque étudiant du cours se verra confier une souris sur laquelle il réalisera ses tests comportementaux et auditifs. A la fin des tests, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie. Les données générées pendant ce cours viendront compléter d’autres produites dans le cadre d’un projet de notre laboratoire, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes creux en carton et de bâtonnets en bois. Une roue sera disposée dans les cages de souris mâles pour limiter les risques de bagarres. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet. L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins bien établis. Mâles et femelles seront utilisés, les déficiences auditives et vestibulaires étant similaires dans les deux sexes.