Maintien des lignées génétiquement modifiées

39 345 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 17 275 d'entre eux et modéré pour 22 070. Certains subissent une lésion cardiaque sous anesthésie, d'autres des injections dans le ventre ou dans l'enveloppe du cœur, d'autres encore un maintien d'une heure en eau tiède. 2 770 retournent à l'élevage, tous les autres sont tués pour analyses post-mortem. Le porteur écarte l'analgésie après la chirurgie cardiaque au motif qu'elle interfère avec la régénération, en s'appuyant sur des recommandations et des méta-analyses portant sur des patients humains opérés du cœur.

Objectifs

Les crises cardiaques sont la principale cause de décès dans le monde. Une blessure au cœur humain entraîne la perte de millions de cellules cardiaques et est remplacée par une cicatrice raide qui limite les battements du cœur. Il n’existe actuellement aucune option thérapeutique pour guérir une crise cardiaque. Le poisson zèbre, en revanche, peut se remettre efficacement d’une lésion cardiaque. L’objectif général du projet est donc d’identifier et de comprendre comment le poisson zèbre peut régénérer son cœur après une blessure.

Bénéfices attendus

Le cœur humain réagit mal à une crise cardiaque. Il n’existe actuellement aucun traitement pour traiter la cause de la maladie, mais uniquement les symptômes et les complications dus à la blessure. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies pour améliorer les résultats pour les patients. Ce projet examine comment le poisson zèbre peut régénérer son cœur de manière robuste après une blessure. Le projet identifiera les facteurs responsables de cette guérison réussie après une blessure. Ces facteurs identifiés peuvent potentiellement être utilisés dans le contexte humain pour développer de nouvelles thérapies pour traiter les patients atteints de crise cardiaque. Ce projet améliorera nos connaissances sur la façon dont le poisson zèbre peut régénérer naturellement et avec succès son cœur. Ces connaissances permettront d’expliquer pourquoi le cœur humain a une capacité de régénération très limitée. Les chercheurs bénéficieront directement de ce projet puisqu’il peut constituer la base de futures études scientifiques et peut être appliqué au domaine de la cardiologie, de la régénération tissulaire chez le poisson zèbre et de la régénération dans d’autres modèles animaux. Ce sera également un avantage à court terme. Le bénéfice à long terme sera la contribution des connaissances à la science médicale. Les résultats précliniques du projet pourraient fournir de nouvelles stratégies de traitement visant à améliorer la régénération du cœur humain blessé. De plus, ces connaissances pourraient être utilisées pour améliorer davantage les stratégies diagnostiques et thérapeutiques actuelles.

Procédures

La collecte des spermatozoïdes et des ovules implique une légère pression sur le ventre des poissons anesthésiés et la procédure prend moins d’une minute. Certains poissons zèbres subiront des blessures cardiaques sous anesthésie. La procédure prend 5 minutes. Certains poissons seront injectés dans le ventre ou le sac qui recouvre le cœur (la procédure prend moins d'une minute sur animal anesthésié), ou recevront leur traitement directement dans l’eau d’un aquarium (la procédure peut durer de 1 jour jusqu'à 60 jours) ou en maintenant le poisson dans de l'eau tiède (la procédure dure 1 heure).

Impact sur les animaux

Le poisson zèbre blessé développera une douleur aiguë directement après la blessure. La procédure prend 5 minutes et les effets de la blessure durent moins d’une heure, car le poisson zèbre présente des comportements normaux en matière de nage, d’alimentation et social après cette période. Une surveillance des comportements anormaux est donc effectuée pendant cette période. Il n’y a aucun dommage indirect après 24 heures de blessure, car le poisson zèbre peut se régénérer naturellement et le cœur se rétablira complètement dans les 60 à 90 jours suivant la blessure.

Devenir

Animaux retournés à l'élevage ou mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des études très en amont ont porté sur des cœurs de porc issus d’abattoirs. Cependant, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Les cellules cardiaques humaines cultivées dans une boîte sont une bonne source de cellules cardiaques pures. Cependant, elles se comportent comme des cellules cardiaques de bébés. Puisque les crises cardiaques sont presque exclusivement observées chez les patients adultes, il est difficile pour ces cellules cardiaques de modéliser la situation des adultes.

Réduction

Certaines expériences utiliseront tout le cœur et ne pourront donc pas être réutilisées. Lorsque les expériences n’utilisent pas la totalité du cœur, le cœur restant sera conservé indéfiniment au congélateur pour de futures expériences. Ainsi, le tissu peut être utilisé au maximum et éviter tout gaspillage inutile. Les femelles et les mâles seront utilisés pour des expériences Le nombre d'animaux requis est basé sur l'expérience antérieure et la littérature publiée. Ces chiffres sont désormais largement utilisés dans le domaine de la régénération cardiaque à des fins d’analyse statistique. La cryoconservation réduit le nombre d'animaux Afin d'identifier les modifications génétiques du poisson zèbre, la coupe des nageoires était auparavant utilisée pour prélever un petit morceau de la nageoire pour analyse (génotypage). Nous utilisons désormais la méthode du prélèvement cutané qui consiste à frotter doucement la peau et à prélever un peu de mucus pour analyse (geste non invasif). Cela ne nécessite aucune intervention et donc aucun dommage pour le poisson. Cette méthode d'identification des poisson positifs a réduit la quantité de poisson utilisée.

Raffinement

Le chercheur se tiendra au courant de la littérature pour garantir que les techniques utilisées sont appliquées de la manière la plus précise et la plus humaine possible. Par exemple, les fabricants fabriquent continuellement des aiguilles plus petites pour les injections. Ce qui crée donc des blessures plus petites. Les techniques utilisées dans ce projet ont été bien documentées, décrites et publiées. Par conséquent, les taux de mortalité, les comportements et la santé globale du poisson zèbre sont connus. Ceux-ci serviront de base au suivi et aux soins postopératoires et grâce à une grille de score déterminé pour le projet. Cette grille de score permettra de suivre objectivement l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera alors mis à mort. Pour minimiser la douleur, la souffrance et la détresse, une molécule agissant à la fois comme anesthésique et analgésique sera utilisée pendant la chirurgie ). Les analgésiques postopératoires actuels interfèrent avec la régénération et la fonction cardiaque. Pour l’Homme, la recommandation actuelle est de surveiller étroitement les patients après une chirurgie cardiaque et d'administrer des analgésiques uniquement si nécessaire (Grant et al. 2023). Seuls 1,8 % des patients ont ressenti un soulagement bénéfique de la douleur avec les opioïdes (Wagner et al. 2021), ce qui ne justifie pas le risque d'addiction (Grant et al. 2023). Une méta-analyse des données des patients a montré que le traitement par AINS (anti-inflammatoire non stéroïdien) augmente le risque d'infarctus du myocarde plus tard dans la vie (Bally 2017), annulant ainsi le bénéfice temporel de l'utilisation des AINS après la chirurgie cardiaque. Au vu de ces résultats obtenus chez l'homme, nous adopterons les mêmes mesures pour la chirurgie cardiaque chez le poisson zèbre. Le chercheur se tiendra au courant de la littérature et modifiera les procédures si le consensus change. Le génotypage des animaux sera réalisé par écouvillonnage cutané. Cette méthode est moins nocive que la coupe des nageoires, qu'elle ne nécessite pas d'anesthésie et qu'elle n’est pas invasive Avec cette nouvelle méthode de génotypage, aucun animal n’est blessé et il y a donc une réduction des contraintes sur les animaux utilisés.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (Danio rerio) est le modèle de choix pour étudier la régénération cardiaque. Des souches de poisson zèbre de type sauvage seront utilisées car ce sont les plus courantes dans le domaine de la régénération cardiaque. Le poisson zèbre génétiquement modifié sera également utilisé pour tester l’importance de signaux spécifiques dans le contrôle de la régénération. Le poisson zèbre affiche une réponse robuste et naturelle suite à une lésion cardiaque. Par conséquent, déterminer les signaux qui permettent à cette régénération naturelle de se produire sera précieux pour comprendre et potentiellement appliquer les connaissances à la situation humaine où les patients sont incapables de se remettre d’une lésion cardiaque. Le poisson zèbre adulte âgé de 6 à 12 mois est utilisé pour les études de régénération. Cet âge se situe dans la même fourchette que celle à laquelle les humains commencent à présenter des lésions cardiaques.

Les animaux utilisés sont pour partie des embryons encore dans l'utérus, des souriceaux de cinq à dix jours et des femelles gestantes. 2 952 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 820 d'entre elles et modéré pour 132. Les femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter un produit dans le cerveau des embryons et de leur appliquer un courant électrique d'une seconde. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et analyses génétiques, y compris les mères, et le bénéfice avancé se limite à mieux connaître une population de neurones qui disparaît normalement au cours du développement.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement du cerveau. Nous voulons également explorer les conséquences de la survie anormale de ces cellules sur la formation du cerveau.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la génération et la mort de nos neurones d’intérêt et quel est leur rôle dans le développement du cerveau.

Procédures

Les souriceaux des lignées subiront une biopsie à la queue pendant une contention de quelques secondes. Les femelles gestantes subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes et l'application d'un courant électrique de 1 seconde. Des animaux subiront une chirurgie terminale sans réveil.

Impact sur les animaux

La biopsie à la queue provoque une douleur légère. Les injections peuvent induire une douleur légère et brève. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance qui est minorée ou évitée par le traitement analgésique. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.

Remplacement

Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Pour le maintient des lignées génétiquement modifiées, nous nous limiterons à la production des animaux nécéssaires en limitant les accouplements au maximum. Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par nos expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors de la chirurgie les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. Une administration d'analgésique ou la mise à mort de l'animal est envisagée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. En effet, seuls les mammifères présentent un cerveau organisé en 6 couches inversées. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire où interviennent les phénomènes étudiés.

Rendues dépendantes aux opiacés par auto-administration puis observées en sevrage, 2 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Avant cela, chacune subit une biopsie de l'oreille sur animal vigile pour identification, une chirurgie d'une heure sous anesthésie, et jusqu'à quarante tests comportementaux de six minutes à une heure. Le porteur indique que les symptômes d'addiction et de sevrage entraînent une douleur qu'il qualifie de modérée, et que les souriceaux séparés de leur mère subissent un stress. Le traitement espéré en est au stade de la recherche de molécule, quand la dépendance, elle, est provoquée chez chacune des 2 120 souris.

Objectifs

Ce projet vise à tester des nouvelles molécules ciblant un récepteur spécifique dans le cerveau, GPR88, dans des modèles animaux de dépendance aux opioïdes. GPR88 est un récepteur dit orphelin, c'est à dire qui n'a pas de ligand endogène connu. Récemment, nous avons développé un modèle d'auto administration pour évaluer les effets de ces molécules sur les comportements liés à la dépendance aux drogues d’abus. Ainsi, nous souhaitons trouver une nouvelle molécule ciblant GPR88 pour diminuer les troubles liés à l'usage des drogues d’abus.

Bénéfices attendus

À l'issue de ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle de GPR88 dans les comportements de type addictif. Nous souhaitons identifier une molécule capable de réduire de manière significative les comportements addictifs. Les molécules ciblant GPR88 peuvent être bénéfiques pour plusieurs drogues d'abus telles que les opiacés, cocaïne, l'alcool et la nicotine. Ce programme de recherche permettera de découvrir un nouvel agent thérapeutique pour le traitement des troubles de l'usage de drogue d’abus.

Procédures

Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre l’identification des animaux transgéniques (30 secondes). Une chirurgie unique sur animaux anesthésiés, d’une durée de 1 heure maximum chacune. De un à 40 tests comportementaux de 6 minutes à une heures (avec un minimum de 24 heures entre chqaue test). Une injection sur animal vigile de molécules qui dure 30 secondes.

Impact sur les animaux

-Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, et une douleur légère due à la biopsie. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. -Chirurgie : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. -Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Une inflammation due aux injections répétées est possible.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de verifier l'emplacement des implants quand cela est nécéssaire et pour faire des analyses moléculaire sur les cerveaux.

Remplacement

"Remplacement" Ce projet consiste à valider et caractériser des agonistes de GPR88 dans le cadre de troubles de l'usage des opiacés. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.Les modèles cellulaires ne nous permettraient pas de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle (multiples structures cérébrales impliquées et réseaux neuronaux). L'addiction affectant en particulier les réseaux neuronaux, il est malheureusement jusqu'à présent impossible de modéliser l'addiction avec des modèles cellulaires et in silico.

Réduction

"Réduction" : Les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 12 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.

Raffinement

"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien). De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations en étant enveloppées dans du papier afin d’être branchées à la fibre optique. Enfin, elles seront branchées à la fibre laser et seront libre d’explorer leur cage, afin d’être habituées à la sensation.

Choix des espèces

La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome . De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, les souris MOR-Cre, agées de 8 semaines, permettront de cibler et manipuler spécifiquemenent les neurones aux opiacés. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.

Une première procédure produit les souris transgéniques qui alimentent ensuite toutes les autres du projet, où elles ne peuvent plus être réutilisées. 3 441 souris vont être utilisées au total, dont 3 306 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes finissent tuées pour l'analyse de leur réponse immunitaire hors de l'organisme. Elles reçoivent un agent infectieux ou un agent inflammatoire par injection intramusculaire ou sous-cutanée, puis passent une chirurgie sans réveil pouvant durer six heures pour l'observation de leurs cellules au microscope. Le porteur compare la douleur au site d'injection à celle d'une vaccination chez l'humain, et indique que cultures cellulaires et organoïdes servent à caler les doses avant le passage à l'animal, sans pouvoir "récapituler la complexité des réponses immunitaires".

Objectifs

La réponse immunitaire contre un agent infectieux consiste à mobiliser, de manière ciblée et séquentielle, les cellules capables de lutter contre cette agression, limitant ainsi sa propagation. La vaccination, de son côté, "éduque" le système immunitaire pour qu'il puisse réagir efficacement à une future infection. Ces deux mécanismes sont complexes et impliquent le recrutement coordonné de différents types cellulaires à travers divers sites anatomiques. L’objectif de ce projet est de décortiquer ces différentes étapes du mécanisme immunitaire au niveau des tissus et des organes lymphoïdes drainants lors de la présence de microorganismes invasifs ou pendant la vaccination par une technologie émergente qui permet le développement d’un vaccin rapidement. Nous souhaiterions nous appuyer sur des modèles murins génétiquement modifiés, et des techniques d’imagerie afin d’améliorer notre connaissance de la mise en place de la réponse immunitaire précoce et plus tardive. Ce projet se décompose en 3 étapes: o Étape 1 : identification des souris transgéniques nécessaires afin d’étudier différents types cellulaires, acteurs de « l’immunité », ainsi que certaines voies de signalisation. o Étape 2 : A. Inoculation « du microbe invasif » ou de l’« agent inflammatoire » induisant des processus inflammatoires aïgus » afin de réaliser une étude de quantitative et qualitative des cellules immunitaires recrutées pendant la réponse immunitaire. B. Vaccination par une nouvelle technologie et étude de la réponse immunitaire induite. La réponse immunitaire sera comparée à une vaccination plus classique. o Étape 3 : Visualisation par imagerie des tissus hôtes « du microbe invasif » et des ganglions drainants ces tissus afin d’analyser les interactions ou la communication entre les cellules du système immunitaire. Ce projet de recherche devrait permettre d’identifier les acteurs cellulaires participant à une réponse inflammatoires précise dans le cas d’un agent infectieux, d’un agoniste ou d’une vaccination. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait d’optimiser les stratégies thérapeutiques en clinique.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette recherche est cruciale pour mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de la réponse immunitaire face aux infections et aux vaccins. En combinant des approches génétiques et de microscopie intra-vitale, nous avons la possibilité d’étudier en temps réel les interactions cellulaires au sein d’un organisme vivant, offrant ainsi une vision dynamique et globale des processus immunitaires. Ces recherches permettront non seulement d’identifier les gènes et cellules clés impliquées dans la défense contre les agents pathogènes, mais aussi de déchiffrer les étapes critiques de la coordination spatio-temporelle de la réponse immune. Ce savoir pourra par la suite être utilisé afin de mettre au point de nouvelles thérapies ciblées, capables de moduler la réponse immunitaire de manière plus précise et efficace, comme la vaccination. En effet, la vaccination est un pilier essentiel de la santé publique, car elle permet de prévenir la propagation de maladies infectieuses potentiellement graves, voire mortelles. En "éduquant" le système immunitaire à reconnaître et à combattre des agents pathogènes spécifiques, les vaccins protègent non seulement les individus vaccinés, mais aussi la collectivité dans son ensemble. Nos résultats pourront donc ouvrir de nouvelles pistes dans le domaine de l’élaboration de vaccins.

Procédures

Les animaux seront soumis : - Pour le génotypage : un prélèvement sanguin au niveau de la queue d’une courte durée (quelques secondes) par prélèvement. - Une injection intramusculaire ou en sous-cutanée en début de procédure d’une durée de quelques secondes ou une injection intramusculaire ou en sous cutanée en début de procédure (quelques secondes) puis une chirurgie sous anesthésie d’une durée maximale de 6 heures. - La chirurgie pour la microscopie est sans réveil.

Impact sur les animaux

Ce projet sera attentif aux cinq libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines des procédures pourraient avoir un effet indésirable sur l’animal. Certains animaux seront prélevés au niveau de la veine caudale ce qui pourrait entrainer une légère douleur au site de prélèvement. Certains animaux pourraient ressentir une douleur modérée au site d’injection, qui ne devrait pas dépasser celle ressentie chez l’homme lors d’une vaccination. Le site d’injection pourrait devenir inflammatoire pendant les 3 premiers jours et inconfortable pour l’animal. Dans ce cas, l’environnement de sa cage pourra être adapté (changement de litière pour de la cellulose, alimentation humide) Certains animaux recevront une injection qui pourra entrainer une légère douleur avant d’être anesthésiés.

Devenir

Les animaux générés par la procédure 1 seront utilisés pour toutes les procédures décrites dans ce projet. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour l’étude de la réponse immunitaire ex-vivo et ne pourront donc pas être réutilisés.

Remplacement

De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires ou des organoïdes (Structures 3 dimensions mimant certaines des communications inter cellulaires in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier la réponse immunitaire dans le cas d’une infection ou d’une vaccination. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer la complexité de la réponse immunitaire.

Réduction

Ce projet de recherche propose de réduire le nombre d’animaux utilisé si les différences à différent temps ou entre les sexes n’est pas importante. Par ailleurs, l'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, différents tests seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. Les effectifs par groupe (3-4) sont cohérentes avec les tailles d'effet très fortes attendues, correspondant à des différences très marquées entre les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils auront reçus un agent infectieux ou une vaccination et seront mis à mort à la fin de la procédure. Enfin, si les premiers tests ne donnent pas les résultats attendus, les autres expériences ne seront pas réalisées. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet seront réduits.

Raffinement

Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour les prélèvements sanguins, la queue sera désinfectée avant et après afin de minimiser les risques d’infections. Concernant l’injection d’agent inflammatoire, l’animal pourrait ressentir une gêne au site d’injection. Des analgésiques lui seront immédiatement administrés dans son eau de boisson. Concernant l’intervention chirurgicale, un analgésiant sera administré à l’animal en amont de l’anesthésie et de la chirurgie. Une plaque thermo contrôlée sera utilisée pendant l’imagerie pour limiter la perte de chaleur corporelle.

Choix des espèces

La complexité du système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Toutes les souris utilisées seront d’âge adulte entre 6 et 16 semaines afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine.

Toutes tuées à l'issue, 1 700 souris déficientes en lipase acide lysosomale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, quatre injections espacées de vingt-quatre heures destinées à détruire son système sanguin, une greffe de cellules souches sous anesthésie, puis jusqu'à trente-six prises de sang. Le porteur indique que l'échec de la greffe empêchera définitivement ces souris de produire du sang et les tuera, tout en classant 1 500 animaux sur 1 700 en souffrance légère. Ces souris sont construites pour accumuler des graisses dans les organes comme les nourrissons atteints de la maladie de Wolman, qui meurent entre trois et huit mois. L'effectif retenu repose sur des groupes de huit souris, sans que le RNT explique le passage de ce chiffre au total de 1 700.

Objectifs

Le déficit en la protéine : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La gravité de l'affection dépend de la quantité d'enzymes. La forme la plus sévère de la maladie (maladie de Wolman), absence totale de l’enzyme (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer un traitement curatif pour la déficience en protéine LAL qui pourra être utilisé pour d'autres maladies.

Procédures

Les souris auront un petit prélèvement à l'extrémité de la queue pour analyser leur profil génétique. Les souris recevront 4 injections de traitement pour supprimer leur système sanguin, espacées de 24 heures, chaque injection prenant environ 10 minutes. 24 heures après la dernière injection, elles recevront une injection de cellules souches sous anesthésie, ce qui prendra aussi environ 10 minutes. Quatre semaines plus tard, un prélèvement de sang sera effectué, sous anesthésie gazeuse, pendant environ 10 minutes. En tout, les souris auront 5 injections et plusieurs prises de sang (au maximum 36).

Impact sur les animaux

Les souris déficient en lipase acide lysosomale vivent moins longtemps (environ 8 à 10 mois) et ont un excès de plaquettes dans le sang, mais cela n'affecte pas leur développement ni le bon fonctionnement de leurs organes, car aucune caillot de sang n'a été observé. Le prélèvement à l'extrémité de la queue provoque une douleur passage (

Devenir

Toutes les souris du projet seront euthanasiées.

Remplacement

Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches de patient pour la déficience en lipase acide lysosomal, nous devons d’avoir étudier la transplantation de cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectif sont basées sur des calculs de statistiques comparant la prise de greffe à notre valeur observée de référence. Pour cela, nous avons utilisé un test statistique et selon ces calculs, il faudrait inclure 8 souris par groupe d'études.

Raffinement

Les souris déficientes en lipase acide lysosomale sont plus petites que les souris saines, mais n'ont pas de problèmes de motricité ou de douleur, donc aucune condition particulière d’hébergement n'est nécessaire. Après le prélèvement nécessaire à l'identification des souris, celles-ci seront surveillées pendant une demi-heure afin de s'assurer qu'il n'y a pas de complications. Lors de la réalisation des gestes techniques, les souris seront anesthésiées. Tout au long des études, l'état général des souris (apparence, posture, comportement, etc.) ainsi que leur poids seront surveillés une fois par semaine. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin d'éviter toute souffrance des animaux. En cas de plaies, un traitement local sera appliqué. Si les plaies ne cicatrisent pas dans un délai d'une semaine, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris déficientes en lipase acide lysosomal car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. De plus, la protéine lipase acide lysosomal humaine est fonctionnelle sur les souris, donc permet d’étudier l’effet thérapeutique in vivo de notre approche. Le prélèvement de queue sera réalisé 7 jours après la naissance des souris. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte. L’efficacité du traitement nécessitera un suivie de 16 semaines et de 9 mois (36 semaines).