Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Etude des mécanismes de la fibrose rénale chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour tester si une protéine ralentit la cicatrisation fibreuse du rein, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Chacune subit une biopsie de la queue, sept injections quotidiennes dans l'abdomen puis une dernière avant la mise à mort, et pendant dix semaines une prise de sang à la queue et six heures d'isolement hebdomadaire en cage métabolique. Le porteur ne retient de tout cela qu'un inconfort de préhension, une douleur brève au point d'injection et un stress lié aux cages. Le seuil qui déclenche la mise à mort n'est décrit que par une grille de score, et le porteur écrit que les animaux d'élevage sont utilisés "de la naissance à la mort".
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont un enjeu majeur de santé publique. Les reins ont une certaine capacité de régénération mais suite à un stress continu et grave, le rein cicatrise mal, c'est ce qu'on appelle la fibrose. La fibrose entraine une altération structurelle et fonctionnelle du rein jusqu’à induire une insuffisance rénale chronique. La compréhension des mécanismes physiopathologiques est donc impérative en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le projet vise à étudier une protéine qui pourrait avoir une action anti-fibrosante dans le rein. L’objectif principal de ce projet est d’étudier si une dérégulation de l’expression de lcette protéine est impliquée dans la progression d’une insuffisance rénale chronique.
Bénéfices attendus
A terme ces travaux permettront une meilleure compréhension du développement de la fibrose rénale afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’insuffisance rénale chez l'homme.
Procédures
Biopsie à la queue (1 fois 10 secondes). Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours (20 sec/ jour) puis pendant 2 jours (20 sec/ jour). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). 1 prélèvement sanguin à la queue par semaine pendant 10 semaines (1min par souris). 1 injection IP avant mise à mort (20 sec).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension, douleur légère de courte durée au point d’injection et stress lié aux cages métaboliques.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Différentes approches sont utilisées pour identifier les mécanismes physiopathologiques de la fibrose rénale incluant les cultures cellulaires (in vitro). Les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu dans le développement de l’insuffisance rénale chronique. C’est un processus complexe faisant intervenir de multiples organes et intéractions cellulaires. La souris permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. L'utilisation des organes pour les différentes analyses est optimisé afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, les modèles de fibrose utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique Les animaux d'élevage sont utilisés de la naissance à la mort. Les animaux adultes sont utilisés pour les modèles expérimentaux
Elevage de deux lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des complications cardiovasculaires liées à la maladie rénale chronique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune amputée de deux millimètres de l'extrémité de la queue au sevrage, à quatre semaines, pour lire son génotype. Une des deux lignées élevées développe spontanément une maladie rénale chronique, avec une dégradation de la fonction rénale à partir de dix semaines, une perte de poids, des poils hérissés et une posture anormale. Le projet ne produit aucun résultat par lui-même, il fournit des souris adultes à un second projet mené dans un autre établissement. Le porteur qualifie le maintien de ces deux lignées d'"indispensable" et annonce que les hétérozygotes non utilisés seront proposés à d'autres équipes ou transférés vers d'autres centres.
Objectifs
La maladie rénale chronique (MRC) conduit à la rétention de toxines urémiques qui s’accumulent dans le sang et les tissus au lieu d'être excrétées par les reins. Certaines de ces toxines agissent grâce à un récepteur et sont associées à la mortalité cardiovasculaire. Notre but est de comprendre le rôle de l'activation du récepteur aux toxines in vivo dans les maladies touchant les vaisseaux et nécessite la gestion et l’utilisation de modèles animaux. Nous utiliserons un modèle génétique de MRC qui développe spontanément la maladie et un autre modèle génétique pour l’étude du récepteur aux toxines. Ces 2 lignées de souris sont disponibles commercialement et nous avons pour objectifs dans ce projet d’élever ces deux lignées. Ce projet d'élevage et de maintien de souris génétiquement modifiées permettra de mettre en œuvre des modèles in vivo pour l'étude du rôle des toxines urémiques au cours de la maladie rénale chronique. Les souris de ce projet d’élevage seront utilisées dans un projet déjà expertisé et validé (projet n°2) pour un autre établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
le maintien de ces deux lignées est indispensable car elles apporterons de nouvelles connaissances dans la compréhension du rôle des toxines urémiques et de leur récepteur dans les complications liées à la maladie rénale chronique conduisant potentiellement à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Les souris seront attrapées en les saisissant près de la base de la queue avec une main et en saisissant la peau de la nuque avec la main opposée. Pour sécuriser et contrôler l’animal, la queue sera placée entre les doigts. Afin d'identifier les animaux, un prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) à l'extrémité de la queue à l'aide de ciseaux. Cette biopsie sera conservée dans un tube à -80°C pour le génotypage ultérieur des souris par PCR. Cette intervention durera quelques secondes afin de limiter le stress et la douler des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue (codectomie) au moment du sevrage à 4 semaines (douleur et stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale à partir de 10 semaines dans le modèle génétique de maladie rénale chronique. Chez ces souris, nous nous attendons à observer une perte de poids qui est un des premiers signes de la maladie, et à une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).
Devenir
Tous les animaux seront en utilisation continue et seront gardés en vie dans ce projet qui concerne l'élevage et le maintien de lignées pour l'étude du rôle d'un récepteur aux toxines urémiques dans la maladie rénale chronique.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés car il n'y a pas de remplacemment possible sur le projet de prélèvement de tissu. De plus, Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information pour létude de la maladie rénale chronique ainsi que des ses conséquences cardiovasulaires. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès à phénotype dommageable afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.
Réduction
Dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux. La production de tous les animaux, y compris ceux avec un phénotype dommageable (KO col4a3), sera adapté et réduit au minimum nécessaire sans compromettre la puissance statistique dans les procédures du projet n°2. Des accouplememts homozygotes seront mis en place afin de réduire le nombre d'animaux hétérozygotes produits. Les animaux hétérozygotes non utilisés seront mis à disposition d'autres équipes et pourront également etre transférés dans d'autres centres de recherche s'intéressant à la maladie rénale chronique (modèle Col4a3) et/ou à AhR.
Raffinement
La procédure °1 qui correspond à un prélèvement invasif au niveau de la queue est un méthode précise et standardisée qui dure quelques secondes ce qui limite les effets indésirables liées au stress et à la douleur. En ce qui concerne la procédure n°2, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux ayant une maladie rénale chronique (modèle MRC). Ces animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal constitueront des points limites. Par exemple, une perte importante de poids constituera un point limite et nécessitera l’euthanasie de l'animal. La douleur ou la détresse de l'animal sera évaluée sur différents paramètres : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur (cf annexe), un score sera déterminé. Selon le score, nous agirons en conséquence en fournissant à l’animal une analgésie (cf annexe). L’euthanasie de l’animal sera envisagée (scores 10 à 14) voire immédiate (score supérieur à 14). Pour les souris MRC, nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale ainsi qu’à leur apparence physique et les mesures citées précédemment seront mises en œuvre en fonction du score d’évaluation de la douleur.
Choix des espèces
Les modèles animaux de maladie rénale chronique sont essentiels pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une maladie rénale chronique. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour la modification d'un gène dans le but de l'étudier dans un contexte physiopathologique. De plus les lignées de souris utilisées dans ce projet sont disponibles commercialement. Les prélèvements de tissu en vue du génotypage auront lieu entre 3 et 4 semaines de vie, au moment du sevrage. Les animaux obtenus dans ce projet seront élevés jusqu'à 8-10 semaines avant d'être utilisés dans les procédures du projet n°2 pour lequel des souris adultes sont nécessaires. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle murin au même stade.
Maintien d’une ligné de rats Stargardt.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Une biopsie de la queue est pratiquée sur chaque raton âgé de huit à dix jours, sous anesthésie locale, pour lire son génotype. 1 250 rats issus de ce programme de reproduction vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 250 étant gardés comme reproducteurs et les autres tués dès les résultats connus s'ils n'entrent dans aucun projet. Maintenir cette lignée porteuse de la mutation de la maladie de Stargardt, qu'aucun fournisseur ne propose, permet de la mettre à disposition d'équipes académiques et privées. Le porteur qualifie la biopsie d'indolore à cet âge, tout en décrivant des vocalisations possibles, un défaut de reptation, un isolement du reste de la portée et un retard à la tétée dans les jours qui suivent.
Objectifs
La maladie de Stargardt (STGD1) est une maladie des yeux qui touche environ 1 personne sur 8 000 à 10 000, affectant surtout la macula, la partie de l'œil responsable de la vision de jour. La perte des cellules visuelles appelées cônes dans cette région peut mener à la cécité. Les photopigments, formés par la vitamine A et une protéine appelée opsine, rendent les photorécepteurs sensibles à la lumière. Cependant, le processus de détection de la lumière crée des sous-produits toxiques. La protéine ABCA4 aide à transporter ces toxines pour qu'elles soient éliminées. Des mutations dans le gène ABCA4 empêchent ce transport, causant l'accumulation de toxines et la mort des photorécepteurs et d'autres cellules oculaires. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour cette maladie. Les modèles animaux actuels pour la STGD1 sont principalement des souris modifiées génétiquement, mais elles ne montrent que peu de symptômes de la maladie. Pour cette raison, nous avons décidé de créer un rat transgénique portant la mutation la plus fréquente dans la maladie de Stargardt. Utiliser des rats présente plusieurs avantages par rapport aux souris. Lors des injections dans l'œil des souris, il est difficile de contrôler la quantité de liquide injecté sans qu'il s’échappe vers d'autres parties de l'œil. Les rats ont des membranes oculaires plus robustes, ce qui permet un meilleur contrôle des injections et réduit le risque de fuite. De plus, lors de longues anesthésies, les souris peuvent développer une opacité du cristallin (semblable à une cataracte) qui complique les examens oculaires. Ce problème est beaucoup moins fréquent chez les rats. Le modèle de rat que nous avons créé reflète bien la maladie humaine sans affecter significativement le rat lui-même. Les changements observés chez ces rats sont similaires à ceux de la maladie STGD1 chez l'humain. Notre projet consiste à maintenir une colonie de rats STGD en utilisant des mâles et des femelles porteurs de la mutation (hétérozygotes, HE, ou homozygotes, KO). Les rats STGD et les rats sains issus de la même portée (appelés WT) seront utilisés pour de futures études de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique. Certains rats HE et KO seront également utilisés pour la reproduction.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce projet est la caractérisation génétique, par une méthode invasive, d’animaux génétiquement modifiés représentant un modèle de la dégénérescence maculaire ou de la maladie de Stargardt (rats STGD) dont la physiopathologie est similaire à celle observée en humaine. Cette caractérisation permettra d’optimiser la gestion d’élevage de cette colonie. Ce projet assurera ainsi le maintien de cette lignée, qui n’est proposée par aucun fournisseur à ce jour, et mettra à la disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la STGD1. Ce modèle animal servira de support pour les futures études et projets scientifiques associées.
Procédures
Une biopsie de queue sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie de Stargardt (STGD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Un génotypage sera effectué par biopsie de la queue chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, une procédure considérée comme modérée. Une anesthésie locale est prévue lors de l'intervention. Bien que peu fréquents, certains signes de douleur pourraient apparaître dans les heures ou jours suivants, tels qu'un défaut de reptation, des vocalisations, un isolement du reste de la portée ou un retard dans la reprise de la tétée après le retour au nid.
Devenir
Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats KO et WT seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des rats (environ un à deux par portée) obtenus seront conservés en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux constitue, à ce jour, l'unique approche pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine, une structure complexe formée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières, avant de passer à des études précliniques ou cliniques chez l’homme. Cette lignée de rats permettra, dans le cadre de futurs projets, d’évaluer l’effet d’un traitement à la fois dans un contexte malade (rats KO) et dans un contexte sain (rats WT), justifiant ainsi la nécessité du génotypage. Actuellement, le génotypage invasif reste une méthode simple, rapide, bien maîtrisée et capable de fournir des résultats fiables pour la caractérisation génétique des rats. Réalisée chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, cette technique est indolore. À l’inverse, le génotypage par prélèvement salivaire, bien que moins invasif, n’est pas recommandé en raison de la complexité de sa mise en œuvre (taille inadaptée des swabs par rapport à la petite bouche des ratons à cet âge) et de la faible fiabilité des résultats obtenus. Un génotypage basé sur la collecte de bulbes pileux est actuellement en cours de validation. Cette méthode, non invasive, sera adoptée au sein de notre centre une fois sa mise en œuvre finalisée, incluant la formation du personnel à cette technique et la mise au point du génotypage à partir de bulbes de poils dans notre laboratoire.
Réduction
La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat STGD. Dans ce projet, afin de générer au maximum 200 rats STGD KO et 50 rats WT par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 50 couples par an, soit un total de 250 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 1250 rats STGD et WT. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard (Cf. schéma d’accouplement en Annexe). Les accouplements seront optimisés afin de maximiser le nombre de rats KO et d'éviter les portées de rats WT uniquement. Cette optimisation privilégiera les reproductions suivantes : KO x KOet HE x HE. Une reproduction KO x KO nous permettra d’obtenir 100% d’animaux KO, une reproduction HE x HE nous permettra d’obtenir théoriquement 50% d’animaux HE, 25% d’animaux KO et 25% d’animaux WT. Il est important de noter que cette lignée a déjà été cryopréservée. Elle est conservée tant que des projets sont en cours de planification, mais son maintien sera interrompu en l'absence de nouveaux projets.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation et un suivi régulier des animaux, assuré par les techniciens animaliers (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 2. Les biopsies de la queue destinées au génotypage seront effectuées par des techniciens compétents et spécialement formés à ces procédures rigoureuses. Cette méthode de génotypage, bien établie, rapide et standardisée dans notre centre, permet de minimiser le stress des animaux. Une analgésie sera assurée à l'aide d'un anesthésique local (comme le TRONOTHANE ou l'EMLA). La cicatrisation sera également surveillée dans les jours suivant l'intervention afin de garantir une bonne cicatrisation. En cas de besoin, une injection sous-cutanée de Buprénorphine peut être administrée à une raison de 0.05 mg/kg. 3. Afin d’améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (Cf. annexe de la saisine).
Choix des espèces
Le rat est un bon modèle pour tester les traitements de thérapie génique des yeux. Son œil est assez grand pour permettre une distribution uniforme des fluides sous la rétine, avec moins de risque de fuite par rapport à la souris. De plus, lors de longues anesthésies, les rats ont moins de problèmes d'opacité du cristallin, qui peut compliquer les examens oculaires. Ce problème, qui ressemble à une cataracte, est courant chez les souris et est causé par le dessèchement de la cornée. La lignée de rats que nous avons développée imite bien la maladie de Stargardt chez l'humain sans nuire aux rats eux-mêmes. Les changements observés chez ces rats reflètent fidèlement ceux de la maladie humaine. Pour nos expériences, nous aurons besoin de jeunes rats adultes âgés de 2.5 mois pour la reproduction, ainsi que de rats adultes. Les rats modifiés génétiquement (KO) et les rats normaux (WT) seront généralement utilisés dans les expériences dès le sevrage. Selon les projets, les rats seront utilisés à différents âges, avec des justifications spécifiques pour chaque étude.
Elevage et caractérisation génétique (par des prélèvements de tissus) de souris génétiquement modifiées utilisées dans l’étude du développement leucémique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 800 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit au sevrage, trois semaines après la naissance, une biopsie de la queue ou de l'oreille destinée à lire son génotype. Le projet ne produit pas de résultat par lui-même, il alimente d'autres travaux sur la leucémie en animaux porteurs des mutations recherchées, les souris étant décrites comme "prévues pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques". Sur le remplacement, le porteur indique que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité du microenvironnement tumoral, et il dit réfléchir à des méthodes moins invasives, par le poil, la salive ou les fèces, sans les avoir mises en place.
Objectifs
L'objectif du projet est d'identifier en fonction de leur génotype les souris génétiquement altérées modèles d'étude du développement leucémique
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la leucémogénèse.
Procédures
Prélèvement de queue, une seule fois. Prélèvement possible à l'oreille, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont celles liées au prélèvement de biopsie de queue pour génotypage: douleur légère et stress lié à la contention. Ces nuisances sont passagères et n'entrainent pas de complication majeure. Par ailleurs, la biopsie est toujours effectuée par du personnel expérimenté maîtrisant le geste, assurant une limitation efficace de ces nuisances. Pour le modèle de développement leucémique, les symptomes peuvent être observés au delà de 12 semaines. Ces souris seront alors observées régulièrement afin de détecter l'apparition éventuelle de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Enfin, pour les modèles immunodéficients, les animaux sont fragilisés d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement leucémique ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) même si nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet.
Réduction
Le nombre d'animaux qui vont subir le prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'interet.
Raffinement
Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée (biopsie de queue) de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les souris présentant une immunodéficience ont besoin d'un hébergement en portoirs ventilés sous un statut sanitaire SPF. Celles-ci, ainsi que l'ensemble des élevages de cette demande sont maintenus en portoirs ventilés.
Choix des espèces
Le modèle murin est le plus utilisé actuellement pour étudier le microenvironnement tumoral. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules, et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence…). De plus le modèle que nous utilisons mime de façon remarquable le développement leucémique humain avec une acquisition de mutations secondaires identiques ou avec des effets similaires que chez l'homme. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
Elevage de souris transgéniques à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Produites pour alimenter d'autres projets du même laboratoire sur les maladies neuromusculaires, 25 400 souris de sept lignées génétiquement altérées vont être élevées et génotypées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 865 d'entre elles et modéré pour 4 535. Chaque souriceau subit entre le septième et le douzième jour de vie un prélèvement de queue et un tatouage des phalanges, l'ensemble prenant moins de cinq minutes. Les animaux porteurs des pathologies étudiées peuvent développer une atteinte locomotrice, une respiration accélérée ou des signes de déshydratation, et le porteur indique les tuer avant l'apparition des symptômes lorsqu'aucune expérience ne les attend. Les autres sont maintenus en vie pour la reproduction ou versés à des projets applicatifs, l'effectif de 25 400 étant estimé à partir de l'historique de production de l'établissement et de "besoins" susceptibles d'évoluer.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux d'élevage à des fins d'utilisation scientifique. Il permettra l’élevage de 7 souches de souris génétiquement altérées nécessaires à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines rares et orphelines de médicaments, sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de maladies neuromusculaires rares.
Procédures
Les prélèvements de tissus à partir d'un très petit morceau de queue sont réalisés sur animaux vigiles. Cet acte est réalisé en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser ces deux actes par animal. En effet, si les prélèvements de tissus s'executent en moins d'une minute, les instruments doivent être désinfectés entre chaque animal ce qui peut prendre 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu sur jeunes animaux vigiles pour le génotypage. La contention d’animaux jeunes pour se faire peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs des pathologies étudiées dans notre Laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice, polypnée ou signes de déshydratation. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux ou maintien en en vie pour la reproduction ou une utilisation continue dans des projets applicatifs.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont voire en parallèle du programme d'élevage. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions biologiques qui se posent à nous à l'aide de modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études n'est effective que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions biologiques. Par exemple, lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes liés à des troubles du comportement moteur caractéristiques des maladies neuromusculaires que nous étudions ou encore pour étudier la biodistribution d’un traitement dans l'organisme.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 25400 souris pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences pour les 5 années d'études à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2022 et 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 5080 souris par année pour les 7 lignées de souris objet de ce dossier, soit un total de 25400 souris sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.
Raffinement
Dans ce programme d’élevage, les animaux mimant les pathologies étudiées seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (maisonnette en cellulose, bâtonnets en bois, élément pour la confection des nids, copeaux, tunnel, autres éléments spatiaux d'enrichissement) et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe et ne regroupons pas les mâles (frères et germains) à plus de 2 semaines d'écart d'âge pour limiter le risque d’agressivité. De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et nourrissant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour ne plus attraper les animaux par la queue lors du change des litières, les zootechniciens utilisent leurs mains jointes en creux ou des tubes pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l'identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie par prélèvement d'un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore bien différenciées.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter les mutations génétiques responsables des différentes maladies étudiées dans notre Equipe, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques mimant ces maladies. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce pour les identifications individuelles (microtatouage) et l'identification génétique ; et à un stade plus tardif de maturité sexuelle pour le renouvellement des reproducteurs.
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres laboratoires, gardés pour un usage interne ou mis à mort selon les besoins de l'élevage, 901 000 souris et 3 000 rats immunodéficients vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur seule procédure décrite est une biopsie sur animal vigile pour le génotypage, l'essentiel de l'activité étant la reproduction, la fécondation in vitro et la cryoconservation des gamètes sur deux établissements. Ces rongeurs sont dépourvus de défenses immunitaires pour accepter sans les rejeter des greffes de tumeurs ou de cellules humaines, ce qui les rend sensibles à la moindre contamination et impose un élevage sous barrière sanitaire. Le porteur écrit avoir calculé les effectifs sur son savoir-faire et ses données historiques, et précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions sanitaires élevées afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Etude de la discrimination des perceptions dans un modèle de Schizophrénie chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à trois mois en restriction hydrique cinq jours par semaine et deux heures par jour en contention. Les procédures vont du niveau léger au niveau sévère, que subissent 440 d'entre elles. S'y ajoutent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique de trois heures pour injecter et implanter dans le cerveau, six à vingt-et-une injections intrapéritonéales, jusqu'à neuf anesthésies gazeuses et trois tests nommés, exploration, anxiété et attention, ce dernier de 45 minutes. Le porteur annonce l'identification de "cibles thérapeutiques nouvelles et précises" pour les troubles neuropsychiatriques, quand la soif et la perte de poids provoquées par la restriction en eau sont, elles, décrites au présent.
Objectifs
Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d’exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier le rôle du cerveau dans la perception. Nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement des neurones, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de cmprendre l’implication du cerveau dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales mises en jeu. Mieux comprendre ces structures permettra d’appréhender les processus de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles ils sont altérés. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Procédures
Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale et implantation, 1 fois d'environ 3 heures. Etudes du comportement, 1 fois chacun: d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes) et d’attention (45 minutes), répartis sur 2 à 3 jours. Regime hydrique: 5 jours/semaine, de 2 semaines à 3 mois. Contention pendent comportement de perception: 1 fois/jour d'environ 2 h, pour 5 jours pendent 2 semaines à 3 mois. Injection intra-péritonéale: 6-21 injections, durée 5 secondes, 1 fois/jour. Anesthesie gaseouse légér avec reveil: 5-9 fois de 15-45 minutes, 1 foi/jour.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue peut entraîner une douleur légère de courte durée. L’anesthésie peut entraîner un stress léger de courte durée. Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’analgésiques peuvent entraîner un stress léger de courte durée. Une douleur modérée peut être associée à l’acte chirurgical. Les taches comportementales peuvent entraîner un stress modéré. Le régime de restriction hydrique entraine de la soif et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permetent de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroulent dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une du serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués à leur manipulation afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les expériences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 8 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.
Maintien de deux lignées consanguines de poules pondeuses sélectionnées sur le portage des salmonelles
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les prises de sang sont réalisées à la veine alaire ou au sinus occipital, ce dernier geste comportant un risque de lésions cérébrales que le porteur dit chercher à réduire. 2 450 poules et coqs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour maintenir deux lignées consanguines dont l'une porte peu de salmonelles et l'autre beaucoup. L'élevage en groupe entraîne du picage et des blessures cutanées de gravités diverses, ainsi qu'une détérioration de l'état général de certains individus dont la cause n'est parfois établie qu'à l'autopsie. Le porteur écrit pourtant que ces animaux n'ont pas subi d'intervention majeure, ce qui le conduit à envisager de les replacer chez des particuliers ou de les valoriser pour leur viande, 1 940 étant renvoyés à l'élevage et 510 réutilisés.
Objectifs
Les lignées consanguines N et 6 ont la particularité de présenter des niveaux de portage intestinal de salmonelles différents après infection. Du fait de cette particularité et de leur consanguinité, elles constituent un modèle unique d’étude du contrôle génétique de la résistance au portage de salmonelles. Le contrôle du portage de salmonelles est un enjeu de sécurité sanitaire dans une optique « Une santé pour tous » (« One Health »), qui contribue à la durabilité des élevages dans le cadre de la transition agro-écologique Les lignées N et 6 ont la particularité de posséder un taux d’homozygotie supérieur à la normale, obtenu via des croisements consanguins frères-sœurs initiaux effectués lors de leur création et à présents achevés. Depuis qu’elles sont hébergées, elles sont simplement maintenues de façon à éviter autant que possible d’augmenter leur consanguinité pour éviter d’accentuer d’éventuels problèmes physiologiques associés (notamment problèmes de fertilité). Cette consanguinité facilite les études de génétique classique comparant les deux lignées ou exploitant les croisements entre ces deux lignées pour étudier le contrôle génétique du portage intestinal de salmonelles. En outre, nous avons pu récemment démontrer que ces deux lignées possèdent des microbiotes intestinaux de compositions très différentes, si bien que nous formulons l’hypothèse que le niveau de portage intestinal est en partie déterminé par la composition du microbiote, peut être sous influence génétique. Ces lignées ont donc pour vocation d’être utilisées dans les projets de recherche visant à comprendre le rôle de la génétique et/ ou du microbiote intestinal sur le portage de salmonelles. Le présent projet vise à maintenir un pool d’animaux de ces lignées suffisant pour servir les projets à venir visant à les étudier dans cet objectif, en prenant en compte leur faible niveau de fertilité.
Bénéfices attendus
L’étude de ces lignées permettra à terme de mieux comprendre (court/moyen terme) l’origine du niveau de portage (génétique et/ou microbiote) et de faciliter la mise au point d’approches efficaces de lutte se basant sur la modulation du microbiote et/ou la sélection génétique (long terme), en complément des méthodes prophylactiques déjà existantes, en identifiant des marqueurs génétiques ou microbiens qui pourront être utilisés en sélection ou bien pour mettre au point une modulation du microbiote intestinal par l’alimentation ou les pratiqeus d’élevage. Ces approches permettront de limiter la propagation des salmonelles en élevage et donc de limiter de nombre de troupeaux abattus en cas de détection de salmonelles, et de réduire la contamination humaine via l’ingestion de produits aviaires contaminés (viande, œufs).
Procédures
Une prise de sang, à la veine alaire ou au sinus occipital sera effectuée entre 2 et 18 semaines d'âge pour pouvoir génotyper les animaux et ainsi déterminer leur pedigree. Une seconde prise de sang sera réalisée en fin de cycle de reproduction pour évaluer la réponse vaccinale. L’intervention a une durée inférieure à une minute.
Impact sur les animaux
Les prises de sang alaires pourront être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre. Les prises de sang peuvent éventuellement engendrer des hématomes. L’élevage en groupe peut entraîner des comportements agressifs. Ces comportements présentent des risques inhérents de picage entre les animaux, ce qui peut causer des blessures cutanées de diverses gravités. Les comportements de domination sont généralement plus fréquents jusqu'à ce que l'ordre social soit rétabli. Dans les élevages de longue durée comme celui-ci, une détérioration de l'état général de certains individus peut également être observée, les causes n'étant parfois déterminées qu'après une autopsie.
Devenir
Nous utilisons ici nos individus pour permettre la production d'une descendance. Arrivés à l'âge de réforme, les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de les replacer vivants chez des particuliers ou de les valoriser pour leur viande qui est tout à fait consommable.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de maintenir deux lignées dont l’étude permet la compréhension des rôles combinés du microbiote intestinal et de la génétique de l’hôte dans la réduction du portage de salmonelles. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle alternatif permettant de remplir ces objectifs.
Réduction
Les effectifs de reproducteurs utilisés permettent en théorie de gérer la consanguinité déjà très élevées de nos populations. Par calcul, les tailles éfficaces des populations devraient être plus importantes, cependant la variabilité génétique de notre caractère est peu renseignée. L'objectif des maintiens des populations est de disposer d'animaux
Raffinement
Les poules et les coqs hébergées en groupe bénéficient d’un milieu enrichi, notamment par des perchoirs et de la proximité avec leurs congénères permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les animaux seront l’objet de surveillance classique et toute manifestation de détresse ou de maladie prise en considération pour envisager le retrait des animaux (mise à l'infirmerie) ou leur euthanasie si besoin. Dès l'éclosion, les animaux sont élevés en groupe au sol puis en cages collectives à partir de 18 semaines. Les cages collectives hébergeant les poules seront équipées de divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques et des bandelettes de tissu pour stimuler le jeu. Les coqs, hébergés également dans des cages collectives, bénéficieront eux aussi de divers enrichissements. Pour prévenir le picage, des répulsifs antipicage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision , destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite), a été développé et sera fourni aux animaliers en charge du suivi des animaux.Lorsque un ou des points limites sont identifiés , une action avec un suivi de celle-ci est mise en œuvre.Raffinement de la procédure : Cas de la prise de sang au sinus occipital : afin de réduire le risque de lésions cérébrales pouvant être associé à la réalisation d'un prélèvement de sang au sinus occipital, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille afin d'éviter tout possibilité d'enfoncer l'aiguille trop profondément. La facilité de visualisation de ce site d'injection évite l'arrachage de plumes douloureux pour les animaux. Un point de compression de 30-60s sera effectué pour limiter également la formation d'un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour une prise de sang afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital auront reçu une formation spécifique à ce geste et seront des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Cas de la prise de sang effectué à la veine alaire : un point de compression sera effectué et deux expérimentateurs seront mobilisés.
Choix des espèces
Les poulets sont porteurs asymptomatiques de salmonelles en élevage. Pour réduire le portage il faut en étudier les mécanismes sur cet animal, ce qui justifie notre choix. Les animaux seront utilisés depuis la naissance jusqu'à l'âge adulte d'environ 42 semaines pour produire les poussins destinés au renouvellement des lignées, mais aussi répondre aux besoins en individus demandés par les projets de recherche reposant sur ces lignées.
Maintien de lignée murine hémophile A et B sous forme respirante
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Un poinçon dans l'oreille au quinzième jour de vie, deux minutes de contention comprises : 312 souris nées hémophiles A ou B en passent par là. 270 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 42 un niveau modéré, 270 sont tuées et 42 réutilisées, les reproducteurs des trios renouvelés tous les quatre mois finissant en banque de tissus. L'objet est l'entretien de l'élevage lui-même, pour alimenter en souris hémophiles A et B d'autres expériences sur la destruction des articulations. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement à la forme humaine de la maladie, ne saigne pas spontanément et ne saigne qu'après un traumatisme, et que les souris de génotype non hémophile sont mises à mort.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Ce projet nous permet donc d’obtenir des souris hémophile A et hémophile B en bonne santé et sans manifestations hémorragiques pour assurer la continuité de la lignée. Ce projet nous permet également d’acquérir des informations d’élevage spécifique aux modèles employés afin de mieux répondre aux critères des 3R.
Procédures
Durant la phase de maintien de la lignée, les souris ne subissent aucunes procédures, lors du bacrossing et génotypage, un prélèvement à l’oreille est réalisé au 15ème jour de vie, durée éstimée à 2min : contention + prélèvement.
Impact sur les animaux
Au cours du maintien, le modèle est maintenu sous la forme hémophile homozygote KO pour les modèles d’hémophilies A et B et ne fait attendre aucune nuisance de type saignement, mortalité foetale ou post-natal, seul les portées des souris hémophiles A sont réduites (4-6 animaux par portée) par rapport aux souris hémophiles B (8-10 animaux par portée). Le poiçon réalisé à l'oreille à 15jours de vie des animaux, selon les bonnes pratiques vétérinaires, se superpose avec l'opération d'identification et ne nous fait attendre aucune douleur. Seule la contention des animaux peut engendrer un léger stress chez les animaux, stress compatible avec la survie des animaux.
Devenir
Au cours de la procédure 1 : les souris sont mise en reproduction et tous les 4 mois les trios sont renouvelés. Les souris issus des anciens trios sont mis à disposition pour la réalisation de prélèvement post mortem et ainsi constituer une banque de tissus contrôle. A la fin de la procédure 2, les animaux sont mis en reproduction et les animaux de génotype non hémophiles sont mis à mort.
Remplacement
Le recours aux modèles in vitro ou in silico est impossbile dans l'étude de l'arthropathie hémophilique, en effet, le modèle d'étude nécessite un système vasculaire et locomoteur fonctionnel et en lien direct.
Réduction
Les animaux nécessaires au maintien de la lignée sous forme respirante sont limités à 3 trios reproducteurs maximum par modèle d’hémophilie soit 6 trios au total la première année. A la fin de cette première année, les données acquises nous permettrons de réviser le nombre de souris.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal par l'application des points limites stricts et spécifiques du projet et l'utilisation d'anesthésie et d'antalgie lors des gestes expérimentaux.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, les souris sont maintenues en élevage jusqu’à leur puberté avant d’être mises en reproduction.
Etude métagénomique et métabolomique de la dysbiose nasale dans la maladie de Parkinson
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.
Bénéfices attendus
Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.
Procédures
Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)
Impact sur les animaux
Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.
Remplacement
Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.
Réduction
Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.
Raffinement
Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres établissements, utilisés sur place ou mis à mort au titre de la gestion de l'élevage, 904 000 rongeurs, dont 901 000 souris et 3 000 rats, sont élevés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces animaux naissent immunodéficients, donc sans défense contre les microorganismes, et sont maintenus derrière des barrières sanitaires pour que cette fragilité ne se déclare pas. Une partie subit une biopsie sur animal vigile pour génotypage, et des femelles gestantes peuvent être transportées avant le dernier tiers de la gestation. Le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer ces effectifs, et renvoie au savoir-faire de l'établissement et à ses données historiques.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions particulières de propreté afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 1000
Produits sur place, dans une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat, 20 000 souris et 1 000 rats âgés de 7 à 21 jours vont être identifiés et génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né reçoit un tatouage digital ou une puce sous-cutanée, puis l'extrémité de sa queue est amputée, sans anesthésie ni analgésie locale, le porteur indiquant qu'un produit appliqué au bout de la queue serait léché par la mère. Hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère et modification du comportement liée à la douleur figurent parmi les effets indésirables reconnus, présentés comme très rares. Les animaux au génotype recherché partent en expérimentation ou en reproduction, les autres sont réorientés vers d'autres projets ou vers la formation, et ceux qui ne trouvent aucun emploi sont tués.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans notre Etablissement Utilisateur, le génotypage permettant d'identifier les animaux porteurs d'une modification génétique d'intérêt. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital ou en l’implantation d’une puce d’identification, suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal âgé de 7 à 21 jours. Cette demande d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Cette demande couvre environ une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt, à la fois pour l'élevage, la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d'organes ou de tissus pour études ex vivo. L’identification par tatouage/pucage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux identifiés et génotypés sont soumis 1) à l'implantation en sous-cutané d'une puce ou en un tatouage digital ) 2) à une bisopsie du bout de la queue. L'implantattion d'une puce est réalisée une seule fois et le geste dure une dizaine de seconde. Le tatouage est réalisé une seule fois et la contention dure de 30sec à 1 min. La bisopsie de queue est réalisée une unique fois et dure 5sec.
Impact sur les animaux
le tatouage ou l'implantation d'une puce d'identification et la biopsie de queue peuvent entraîner une légère douleur. La contention de l'animal durant ces gestes peut être source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère, modification du comportement liée à la douleur.
Devenir
Les animaux ayant un génotype d'intérêt partirons en expérimentation ou seront utilisés pour perpétrer l'élevage. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt scientifique seront utilisés dès que possible dans d'autres projets ou pour formation. Les animaux ne pouvant être utilisés dans les projets, les formations ou l'élevage seront euthanasiés.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base de salive ou de poils ne permettent pas de procéder à l'identification d'animaux génétiquement modifiés de façon fiable. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements. Une erreur se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; la naissance d’animaux non viables ; l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages/puçage et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’Etablissement et l'équipe de zootechnie établissent les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’Etablissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’Etablissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Sur nouveau-nés pas de médication envisagée car tout anesthésique local serait difficilement applicable au bout de la queue et serait ensuite léché par la mère, ce qui engendrerait des effets indésirables. Dans la balance bénéfice risque, ce sont les gestes maitrisés et les instruments appropriés qui sont garant du raffinement de la procédure pour limiter toute douleur, souffrance et stress. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions misent en place n'ont pas les résultats escomptés, l'équipe de zootechnie prends la décision sans délai de mise à mort d'un animal. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée avec eau et nourriture ad libitum, dans des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Ils sont hébergés en groupe sociaux avec un enrichissement adapté pour reproduire les comportements naturels (tunnel/dômes pour se refugier, pelote de bois pour la nidification, bâtons à ronger) et leur bien-être est évalué quotidiennement par des personnels formés et compétents.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le modèle rongeur. La souris et le rat représentent une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux du rongeur permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus à l’espèce humaine. Par ailleurs, les rongeurs peuvent être manipulés génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Les rongeurs sont donc des animaux sur lesquels les évaluations comportementales dans le domaine des neurosciences sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille dont l'élevage est facilement réalisable et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l'animalerie de l'unité. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 21 jours, âge où les gestes sont réalisés plus facilement et plus rapidement car la contention est plus facile. La biopsie est également plus aisée à cet âge et moins douloureuse car le cartilage n'est pas encore complètement formé. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.