Maintien des lignées génétiquement modifiées

Nées dans les lignées génétiquement modifiées de l'établissement, 2 000 souris subissent l'amputation de deux millimètres de leur queue ou de leur oreille, à l'âge de deux à quatre semaines, pour que leur génotype soit identifié. La procédure dure cinq secondes et se fait sans anesthésie, le porteur estimant qu'une anesthésie générale ajouterait une nuisance non justifiée au regard d'un niveau de souffrance qu'il déclare léger. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet. Leur sort se décide au vu du résultat du génotypage : entrée dans l'expérience d'un autre projet, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement d'organes.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles d'animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. La gestion de l'élevage de l'ensemble des lignées génétiquement modifiées de notre établissement utilisateur répond à des programmes établis en amont par les responsables des projets dans lesquels elles sont nécessaires. Les programmes de reproduction (effectifs de reproducteurs, rythme de production) sont adaptés aux besoins des équipes de recherche en prenant en compte les caractéristiques propres à chaque modèle pour l’obtention des cohortes nécessaires (taux de fertilité, tailles des portées, résultats des génotypages). Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés en utilisation continue et ceux nécessaires au maintien des lignées lorsqu’elles sont régulièrement utilisées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des biopsies de tissus selon des méthodes non invasives ou couplées à une méthode d’identification des animaux. L’objectif de ce projet est de présenter les méthodes de biopsie utilisées au sein de notre équipe pour le génotypage des lignées d'animaux génétiquement modifiés à phénotype non dommageable, utilisées à des fins scientifiques dans le cadre de nos projets et thématiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles d'animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour des projets autorisés dans le cadre d’une utilsation continue. De plus le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue ou au niveau de l’oreille constitue une méthode de génotypage de gravité légère, fiable et minimisant les risques de contaminations entre échantillons.

Procédures

Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue ou de 2mm de tissu à l’oreille x 5 secondes x 1 par animal

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement de tissus.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de ces uniques procédures. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé dans le cadre d’une utilisation continue b/ Utilisés pour le maintien de la lignée c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.

Remplacement

Il n’existe aucune alternative à la biopsie de tissus pour avoir accès au matériel génétique afin de le caractériser in vitro. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation continue dans d’autres projets.

Réduction

L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire, à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement en individu de même génotype). - Développer et favoriser le recours à des méthodes de biopsies non invasives chaque fois que cela est compatible avec les impératifs scientifiques des projets.

Raffinement

Les méthodes utilisées sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiée au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements à l’oreille sont réalisés en routine sur des animaux de 2 à 4 semaines. Le développement de l’oreille n’atteint sa forme définitive qu'a l'age de deux semaine, permettant de réaliser des biposies sans risques hémorragiques. Les prélèvements de l’extrêmité de la queue peuvent être réalisés jusqu'a 4 semaines après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.

Sur les 14 400 poissons zèbres génotypés en cinq ans, 1 440 seront tués faute de génotype intéressant, 2 880 partiront vers d'autres projets, 1 440 deviendront géniteurs. Ces poissons sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun est pêché à l'épuisette, anesthésié, amputé d'un fragment de nageoire caudale d'un millimètre, puis isolé jusqu'à trois jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress chez une espèce grégaire. Les 8 640 restants, plus de la moitié de l'effectif, sont annoncés comme "écartés à différentes étapes", entre vieillissement naturel et "gestion standard de la colonie".

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés pour étudier le rôle des gènes dans la santé humaine, animale et l’environnement. Ces animaux sont élevés dans des conditions spécifiques pour répondre aux besoins de la recherche scientifique. Ils sont sélectionnés pour des caractéristiques précises, comme leur fertilité et leur capacité à produire des portées, afin de fournir des groupes d’animaux adaptés aux objectifs des projets. Dans ce projet, les animaux sont étudiés pour mieux comprendre le rôle de certains éléments génétiques dans des maladies comme le cancer, le vieillissement et les troubles du comportement. Pour cela, des échantillons de nageoires sont prélevés sur les poissons pour analyser leur génétique et déterminer la présence de mutations ou de gènes modifiés. Les recherches portent sur trois grands axes : comprendre l'impact de certains gènes sur le cancer de la peau (mélanome), étudier leur rôle dans le vieillissement, et explorer comment des changements génétiques influencent la santé intestinale et le comportement des poissons. Ces études aideront à faire avancer nos connaissances dans des domaines comme la lutte contre le cancer, le vieillissement et l’étude des interactions entre gènes et microbiome intestinal.

Bénéfices attendus

Ce projet de prélèvement de tissus pour identification permet de sélectionner les poissons génétiquement modifiés et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des animaux destinés aux expérimentations futures. Le prélèvement de nageoires pour l'identification est une méthode simple, fiable et minimise les risques de contamination entre les échantillons. Lorsqu'elle est scientifiquement justifiée, cette approche constitue un bon compromis, respectant les principes de réduction et de raffinement dans la recherche.

Procédures

Les animaux seront d'abord soumis à une anesthésie, d'une durée estimée à 1 à 2 minutes. Ensuite, un prélèvement de tissus sera effectué, à savoir un échantillon d'environ 1 mm de diamètre à l'extrémité de la queue, et cette procédure prendra moins de 5 minutes. Après le prélèvement, les animaux seront temporairement isolés pour garantir leur sécurité et leur bien-être, avec une durée maximale d'isolement de 3 jours. Cette période permet également de déterminer leur génotype tout en réduisant au minimum le stress pour les animaux.

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées pour pêcher le poisson, telles que l'utilisation d'une épuisette et le transfert dans un nouveau bac, induisent un stress léger. Le prélèvement d'un fragment de nageoire caudale (environ 1 mm de diamètre) entraîne une douleur légère. L'isolement des poissons pendant un maximum de trois jours pour la procédure de génotypage provoque un stress ou une angoisse légère chez cette espèce grégaire.

Devenir

Dans ce projet, nous maintiendrons 48 lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés. Chaque année, des prélèvements de nageoires seront réalisés sur 60 poissons par lignée, soit 2 880 poissons génotypés par an (48 × 60), et 14 400 poissons génotypés sur 5 ans. À l’issue du génotypage, les poissons seront répartis de la manière suivante : 576 poissons par an (soit 2 880 sur 5 ans) seront gardés en vie pour être utilisés dans des procédures expérimentales relevant d'autres demandes d'autorisation. 288 poissons par an (soit 1 440 sur 5 ans) seront gardés en vie pour devenir géniteurs, afin de maintenir les lignées. 288 poissons par an (soit 1 440 sur 5 ans) seront mis à mort, en raison d’un génotype sans intérêt scientifique ou pour la gestion de l’élevage, avec ou sans prélèvements post-mortem. Ainsi, au total, 5 760 poissons sur 5 ans seront directement affectés (utilisés expérimentalement, conservés pour la reproduction, ou euthanasiés). Le reste des poissons génotypés (soit 8 640 poissons sur 5 ans) correspond aux animaux écartés à différentes étapes (non sélectionnés pour la reproduction ou les expériences, vieillissement naturel, gestion standard de la colonie).

Remplacement

Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition pour des projets scientifiques d’animaux modèles génétiquement modifiés. Le remplacement ne se situe donc pas directement à ce niveau mais en amont lors du choix du modèle par les chercheurs. Nous privilégions le génotypage des larves de moins de 5 jours, car elles ne sont pas considérées comme des animaux au sens réglementaire. Cela permet d’éviter le recours aux animaux adultes et constitue une stratégie de remplacement en soi. Toutefois, lorsque des analyses génétiques plus complexes nécessitent une quantité d’ADN plus importante, nous procédons à un prélèvement de nageoires sur les adultes. Afin de limiter l’impact sur ces derniers, ces prélèvements sont réalisés de manière ciblée et optimisée : nous ne prélevons que le nombre strictement nécessaire d’adultes et effectuons un seul prélèvement par individu. Bien que l’utilisation des larves représente une alternative intéressante, elle n’est pas toujours applicable à toutes les expérimentations. En effet, les prélèvements sur ces jeunes stades peuvent présenter des risques de contamination, des résultats moins reproductibles ou affecter leur survie. C’est pourquoi, dans les cas où la fiabilité des analyses l’exige, le prélèvement sur adultes reste nécessaire mais est strictement encadré afin de minimiser son impact.

Réduction

La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. Le chiffre de 2 880 poissons par an (soit 60 poissons par lignée), estimé au minimum, permet de maintenir un effectif suffisant pour garantir la diversité génétique tout en limitant la production d’animaux au strict nécessaire pour les projets scientifiques et le maintien des lignées.

Raffinement

Dans ce projet, les éléments de raffinement mis en œuvre visent à limiter le stress et la douleur des animaux. Les biopsies sont réalisées individuellement, et la méthodologie pour le prélèvement de nageoire a été améliorée en réduisant la taille de l'échantillon prélevé (environ 1 mm de diamètre) par rapport aux méthodes habituelles. Les conditions d'isolement ont également été adaptées pour permettre aux animaux de maintenir des échanges visuels avec leurs congénères. Enfin, les procédures sont réalisées par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.

Choix des espèces

Sa petite taille permet des manipulations aisées comparé à d’autres espèces de poissons. Ces dernières années, un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées, s’avérant être des outils pertinents et efficaces pour l’étude du vieillissement. Bien que le poisson-zèbre puisse vivre jusqu'à 5 ans, notre modèle tert ne dépasse pas les 20 mois. Les animaux seront utilisés aux stades larvaires et adultes. La taille du prélèvement de nageoire (environ 1 mm de diamètre) sera moins dommageable, en termes de surface prélevée et douleur, chez des adultes que chez des stades juvéniles, qui sont de plus, plus difficiles à manipuler. Cependant, l’utilisation des larves de moins de 5 jours prend en compte l’une des règles des 3R (remplacement).

52 000 souris et rats nouveau-nés vont être utilisés pour un génotypage, chacun pour une minute de prélèvement au maximum, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souriceaux jusqu'à douze jours et les ratons jusqu'à sept jours sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes, tenus en contention et amputés d'un fragment de queue sur animal vigile, la mère restant dans sa cage couvercle fermé pour l'isoler des vocalisations de ses petits. Au-delà de ces âges, le prélèvement se fait à l'oreille sous anesthésie, que le porteur juge "moins délabrant" qu'une amputation de la queue. Les animaux au génotype voulu partent vers d'autres projets ou deviennent géniteurs, les autres sont "prioritairement réutilisés pour la formation ou le prélèvement de tissus ou d'organes post-mortem", ou tués dans le cadre de la gestion des élevages.

Objectifs

Les animaux génétiquement altérés produits sont destinés à être utilisés dans les projets scientifiques car ils représentent des modèles pertinents pour aborder les questions scientifiques posées au sein de ces projets dans des domaines variés comme les neurosciences , la chronobiologie, la cancérologie, le système immunitaire, la nociception/ douleur, le métabolisme, les fonctions physiologiques comme la reproduction..Les rats et souris génétiquement altérés doivent être identifiés de manière unique afin de pouvoir associer à chaque numéro un génotype spécifique. Cette identification est réalisée par tatouage des doigts des nouveaux-nés et le génotypage par une méthode invasive de prélèvement tissulaire : biopsie de queue ou d'oreille. Ces prélèvements tissulaires fournissent un matériel biologique permettant de génotyper chaque animal de manière fiable et reproductible, quelles que soient les techniques d’extraction et d’amplification du matériel génétique. L'objectif de ce projet est donc de pouvoir prélever du tissu (queue et oreille) pour caractériser génétiquement les animaux produits.

Bénéfices attendus

La caractérisation fiable du génotype des animaux génétiquement altérés est nécessaire afin de produire les animaux au génotype d'intérêt pertinent pour les projets de recherche, qui seront en utilisation continue si ces projets de recherche nécessite une DAP"expérimentale", tout en limitant au minimum le nombre d’animaux de génotype non conforme.

Procédures

Les animaux sont soumis à un prélèvement tissulaire (queue) d'une durée d'une minute maximum réalisée sur animal vigil avant 7j maximum chez le rat et 12j maximum chez la souris. Au-delà de ces âges les animaux seront prélevés sous anesthésie et la biopsie sera réalisé à l'oreille (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

La procédure de prélèvement tissulaire nécessite une séparation de la mère (maximum 10 minutes) et une contention douce, génératrices de stress et d'une douleur légère de courte durée. Le prélèvement tissulaire en lui-même dure moins d’une minute par animal. L’anesthésie à l’isoflurane en cas de prélèvement sur un animal âgé de plus de 7 jours (rats) ou 12 jours (souris) entraîne aussi un stress léger et passager, elle durera 3 à 4 minutes par animal.

Devenir

Les animaux identifiés et génotypés dont le génotype est considéré d'intérêt seront alors utilisés dans les projets de recherche auxquels ils sont destinés et inclus dans une DAP si ces projets en requiert une. Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés comme géniteurs pour assurer le maitien des colonies. Parmi les animaux qui ne seront pas utilisés dans les projets de recherche ou pour maintenir les colonies, ils seront prioritairement réutilisés pour la formation ou le prélèvement de tissus ou d' organes post-mortem ou sinon ils seront mis à mort dans le cadre de la gestion des élevages.

Remplacement

La stratégie de remplacement est envisagée dans les projets autorisés utilisant les animaux génétiquement modifiés élevés dans nos locaux. Dans ces projets, la nécessité d'utiliser l'animal pour atteindre les objectifs des projets ainsi que la pertinence des lignées génétiquement modifiées choisies a été précisée. Les animaux inclus dans cette demande sont donc considérés comme indispensables pour la réalisation des projets autorisés et ne peuvent être remplacés.

Réduction

Le nombre d’animaux génétiquement modifiés produits pour utilisation dans les projets autorisés est calculé au plus près des besoins. Le nombre d’animaux non utilisés et de génotype non conforme est suivi par la SBEA afin de repérer les colonies où la gestion peut être optimisée. Les animaux surnuméraires ou de génotype non conforme peuvent être utilisés pour les formations, les prélèvements de tissus ,ou d'organe post-mortem . Les lignées qui ne sont plus utilisées sont cryoconservées ou éliminées.

Raffinement

Afin de réduire le nombre de manipulations et de séparations des nouveau-nés de leur mère, l'identification et la biopsie de queue sont effectuées en même temps. Les souriceaux ou ratons sont placés dans un bac propre et leur mère laissée dans sa cage, couvercle fermé pour l’isoler des vocalisations des petits et donc limiter le stress de séparation. La procédure de prélèvement est très rapide, moins d’1 minute par animal lorsque l’opérateur est expérimenté, et ne provoque pas ou très peu de saignement (chez le rat notamment). La portée est rendue à la mère à l’issue du prélèvement de tous les nouveau-nés (ou en 2 temps pour les portées de plus 12 animaux) et il est vérifié le jour suivant lors du suivi quotidien si tous les petits sont bien dans le nid. Le cannibalisme maternel après biopsie chez le nouveau-né est très rare. Pour limiter ce comportement lorsque les nouveau-nés doivent être prélevés avant 6 jours chez la souris ou 3 jours chez le rat, l’opérateur frottera ses mains dans la litière de la cage afin de limiter le dépôt d’odeurs étrangères sur les petits. Tout prélèvement pour génotypage réalisé sur un animal de plus de 7 jours chez le rat et 12 jours chez la souris sera mis en œuvre sous anesthésie à l’isoflurane et intéressera un prélèvement du bord de l'oreille. Ce prélèvement n’induit pas de saignement et est considéré comme moins délabrant qu’une caudectomie. Néanmoins ce prélèvement n'est pas possible sur des animaux plus jeunes (oreilles plaquées contre le crâne). Enfin, le génotypage précoce permet de supprimer les nouveau-nés qui ne seront pas utilisés dans la semaine précédant le sevrage et ainsi de soulager la mère allaitante, parfois déjà gestante. De plus, l'établissement utilisateur en lien avec sa SBEA met au point la méthode de génotypage sur poils et chaque fois que cette méthode aura été validée et sera reproductible elle remplacera sur la durée du projet la biopsie de queue et d'oreille.

Choix des espèces

Les modifications génétiques portées par les souris et rats élevés permettent d’identifier des populations cellulaires spécifiques dans le système nerveux central, sont impliquées dans les rythmes biologiques, dans des pathologies neurodégénératives, du système immunitaire, d’ordre métabolique, la régulation de la douleur, les sécrétions neuroendocrines. Aucune autre espèce de mammifères ne peut ainsi être modifiée génétiquement. Les souris seront identifiées et biopsiées vigiles le plus souvent entre 6 et 8 jours et jusqu’à 12 jours maximum, et les ratons entre 3 et 4 jours, 7 jours maximum. Au-delà de ces âges maximum, les animaux seront anesthésiés Une intervention à un âge plus précoce s’accompagne d’un risque accru de cannibalisme. Néanmoins dans les cas exceptionnels où les nouveau-nés seraient utilisés avant l’âge de 6 jours chez la souris, ou 3 jours chez le rat, la biospie de queue sera réalisée à partir de l’âge de 2 jours chez la souris ou 1 jour chez le rat. La connaissance précoce du génotype est nécessaire pour les projets utilisant des nouveau-nés et permet de sélectionner au plus tard au sevrage les animaux à conserver.

Les reproductrices sont tuées après six à huit portées, les femelles sans mutation au sevrage, et la moitié des mâles produits, porteurs de la myopathie de Duchenne, sont gardés en vie pour d'autres projets. 9 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit à sept jours une biopsie de queue pour le génotypage, geste que le porteur situe avant l'ossification de la vertèbre caudale. Il précise que les mâles malades seront utilisés avant l'âge de six mois, donc avant l'apparition des troubles musculaires, et présente cette production comme une "source précieuse" pour d'autres laboratoires et collaborateurs.

Objectifs

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 naissances, causée par des mutations dans le gène des dystrophines. En plus d’une dégradation progressive des muscles squelettiques, des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques touchent une grande partie des patients DMD, mais les relations entre des types spécifiques de mutations et les symptômes sont encore peu claires. En effet, le profil cognitif des patients diffère en fonction de la position des mutations et du nombre de protéines perdues, ce gène produisant en effet plusieurs dystrophines à partir de plusieurs promoteurs internes. Par ailleurs, les avancées récentes dans notre compréhension des mécanismes dépendants des dystrophines et responsables de la DMD ont conduit au développement d’outils innovants en thérapie moléculaire, thérapie génique et neuropharmacologie. Cependant, leur capacité à corriger toutes les altérations cognitives associées à cette maladie reste limitée. Une large part de nos connaissances actuelles ont été acquises grâce à l’étude comparative de plusieurs souris modèles porteuses de différentes mutations mimant les différents cas de figure observés chez les patients. De même, les approches thérapeutiques sont initialement développées dans le cadre d’études précliniques chez la souris. Le projet consiste à produire l’ensemble des souris modèles de cette pathologie, afin de disposer des animaux expérimentaux nécessaires à l'étude du rôle des dystrophines dans le système nerveux et pour développer différentes approches thérapeutiques pour remédier aux troubles cérébraux.

Bénéfices attendus

La production de souris modèles de myopathie de Duchenne permet de développer de nombreux projets visant à comprendre les causes des troubles cognitifs, comportementaux, sensoriels et neuropsychiatriques associés à cette maladie, avant que la maladie musculaire n’impacte ces fonctions. Elle permettra en particulier d’identifier les causes des variations des symptômes dans cette maladie, en fonction de la position de la mutation dans le gène responsable, et de tester différents types d’approches thérapeutiques (génétique, pharmacologique, comportementale). Les projets associés permettront de déterminer s’il y a un bénéfice potentiel pour les patients à recevoir ces traitements. La procédure de croisement des reproducteurs utilisée permet de contrôler efficacement les facteurs génétiques et environnementaux, et d’effectuer des comparaisons avec des souris saines issues des mêmes parents. Cette production est par ailleurs une source précieuse pour d’autres laboratoires et collaborateurs souhaitant développer des études sur cette maladie. Le projet est optimisé afin d’éviter que des problèmes moteurs sévères ne se manifeste, en utilisant des reproducteurs asymptomatiques et en utilisant les souris produites avant l’âge d’apparition d’une myopathie invalidante.

Procédures

Une biopsie de queue est faite à l’âge de 7j pour réaliser le génotypage. La moitié des souris mâles produites seront hémizygotes avec un phénotype dommageable qui se traduit par une dégénérescence progressive et lente des muscles squelettiques, cardiaques et du diaphragme (myopathie).

Impact sur les animaux

La biopsie de queue effectuée à l’âge de 7j peut provoquer une légère douleur. Les symptômes des souris mâles modèles de myopathie se manifestent progressivement après l’âge de 6 mois et il a été montré qu’ils sont dommageables après l’âge d’un an. Ils sont alors caractérisés par une baisse de la locomotion et des difficultés respiratoires et cardiaques, en général largement après l’âge de 6 mois.

Devenir

Les reproducteurs seront euthanasiées en fin de procédure (au plus tard 27 semaines ou 6-8 portées), ou avant s’ils ne produisent pas de portées. Les mâles hémizygotes produits et leurs frères non mutés seront gardés en vie pour une utilisation continue dans des demandes d’autorisation de projet d’expérimentation. Les femelles sans mutation (WT) seront euthanasiées au sevrage ; quelques mâles non mutés (WT) seront gardés pour servir de reproducteurs.

Remplacement

Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine. Ces projets impliquent des tests fonctionnels (comportementaux) qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et pouvant se comporter librement. La production de ces modèles n’existe pas dans les centres référencés Français, et certains de ces modèles ne sont pas du tout commercialisés.

Réduction

Le nombre d’animaux issus de cette production est estimé sur la base des années précédentes et des projets en cours et à venir. Une estimation précise est effectuée dans le cadre des demandes d’autorisation de projets expérimentaux du laboratoire. Le nombre d’animaux susceptibles de présenter des signes de souffrance (la moitié des mâles) varie en fonction des projets en cours ; son estimation précise est effectuée dans le cadre des demandes d’autorisation de projets du laboratoire. Ainsi, certaines lignées peuvent être amplifiées pendant une période donnée, ou au contraire réduites à un maintien minimal, en fonction des besoins. Les naissances sont répertoriées et le responsable de projet ajuste le nombre de couples nécessaires à une production satisfaisant les besoins des projets en cours. Le nombre de souris présentant des signes de souffrance devrait être égal à, ou proche de zéro, vu que l’euthanasie avant l’âge de 6 mois évite que ces signes liés à la maladie musculaire se manifestent.

Raffinement

Le projet est conçu de manière à pouvoir étudier le phénotype « comportemental » des souris produites bien avant la survenue du phénotype « musculaire » dommageable (myopathie). La procédure de production des souris est également en accord avec ce principe, avec l’utilisation de reproducteurs qui ne développent pas la maladie (femelles porteuses et mâles sains) et des euthanasies avant l’âge de 6 mois. Les animaux sont en couples stables, ce qui réduit considérablement le stress et l’agressivité. Les souris susceptibles d’exprimer la maladie musculaire sont maintenues par fratrie pour limiter le stress social. Pour réaliser une identification du génotype des souris nouvellement nées, une biopsie de queue est réalisée à l’âge de 7-10 jours, donc avant l’ossification de la vertèbre caudale afin de réduire au maximum la douleur. Une analyse rétrospective du bien-être animal a statué l’absence de signe dommageable dans les conditions de production et de maintien de ces lignées. Le bien-être des souris est évalué par l’observation quotidienne par l’équipe zootechnique, y compris le week-end. En cas de signe de détresse ou souffrance, une action corrective est effectuée si cela est jugé bénéfique par l’équipe zootechnique et le vétérinaire, avec un suivi accru de l’individu concerné. Notamment, si une souris présente des signes de souffrance liés à sa maladie musculaire, avec des difficultés à se nourrir ou à prendre du poids, des croquettes mouillées ou un gel alimentaire supplémenté sera placé au sol pour un accès plus facile. Si cette action est inefficace, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. De plus, l’apparition des problèmes moteurs est tardive chez la souris. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur ces souris déficientes en dystrophine, chez lesquelles nous identifions des perturbations comportementales qui s’expriment avant l’apparition de troubles moteurs liés à la myopathie. Nous évaluons ensuite l’efficacité de traitements visant à compenser ces perturbations comportementales. Dans les conditions de reproduction choisies, la myopathie ne s’exprime pas pour les reproducteurs. Les mâles susceptibles de développer la myopathie seront utilisés comme animaux expérimentaux dans le cadre de demandes d’autorisation de projet, à un âge inférieur à 6 mois, donc avant que se manifestent les problèmes musculaires et moteurs.

Nées sur place de croisements organisés pour la lignée, avec des paillettes de sperme congelées pour éviter d'avoir à recommencer, 1 580 souris immunodéficientes entrent dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue de moins d'un millimètre pour génotypage, avant l'ossification. La lignée développe spontanément une inflammation continue du côlon et du rectum, et le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la complexité des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin humaines. 54 souris sont gardées vivantes pour l'élevage et le maintien de la lignée, les 1 526 autres sont tuées, dont celles dont le génotype ne sert pas et celles qui expriment le phénotype dommageable.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des souris capables de développer spontanément une inflammation intestinale semblable aux MICI (Maladie inflammatoire chronique de l’intestin) humaines. Les MICI, comme la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, qui affectent environ 300 000 personnes en France, sont des maladies auto-immunes où le système immunitaire attaque par erreur certaines parties du système digestif. La maladie de Crohn peut toucher tout le système digestif, alors que la colite ulcéreuse se limite au côlon et au rectum. En effet, le modèle de souris utilisé pour ce projet a une altération de leur système immunitaire, les rendant par conséquent susceptibles à certains pathogènes eu au développement spontané́ d’une inflammation continue au niveau du côlon et du rectum semblable à la pathologie humaine. Nous souhaitons donc pour ce projet, reproduire cette lignée et la maintenir dans des conditions d’hébergement sans pathogène pour l’étude des MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de gérer au mieux l’élevage de souris génétiquement altérées à phénotype dommageable par l’hébergement des souris en milieu dépourvu de pathogène, et de sélectionner les souris de bon génotype pour l’expérimentation. Le schéma de croisement défini permettra de générer un minimum de souris, tout en réduisant les nuisances.

Procédures

Une biopsie de la queue sera effectuée une fois par animaux, après désinfection de la queue sur animaux vigile. Le geste est estimé à moins de 30 secondes par animaux. Cette technique permet d’identifier les animaux porteurs de notre mutation génétique d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les souris sont sensibles aux infections bactériennes et aux développements de pathologies intestinales. Le maintien en milieu dépourvu de pathogènes les préservent du développement de maladies. La récupération d’un petit bout de la queue pour l’identification des souris peut causer des douleurs légères momentanées chez la souris.

Devenir

Les souris de génotypes non pertinents seront mises à mort. De plus, si les points limites sont atteints ou si les souris expriment le phénotype dommageable alors celles-ci seront aussi mises à mort. Les animaux utilisés pour l’expérimentation, la gestion des accouplements et le maintien de la lignée seront gardés en vie.

Remplacement

Ces dernières années, différents modèles in vitro ont été développés et optimisés afin de mimer au mieux l’environnement intestinal en condition d’inflammation pour tester l’efficacité thérapeutique de futurs traitements potentiels. En revanche, aucun de ces modèles ne représentent complètement la complexité de la physiopathologie des MICI humaines. Ainsi, il n’existe pas d’alternative non animale pour mimer l’environnement cellulaire complexe et l’état d’inflammation intestinale présente dans la pathologie MICI.

Réduction

Nous allons identifier et former le plus rapidement les couples portant notre mutation d’intérêt. Les descendants obtenus seront donc utilisés pour nos études. De plus, pour chaque expérience, nous avons le souci permanent d'utiliser un nombre minimum d'animaux tout en ayant le maximum de chances d'obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles. Enfin, des paillettes de sperme seront réalisées afin de s’affranchir de nouveaux croisements en cas de nécessité de réutilisation de la lignée.

Raffinement

Les souris seront manipulées sous hotte afin de limiter les risques d’infection. Un suivi régulier des souris sera effectué. Toutes les mesures nécessaires seront prises pour s’assurer du maintien du bien-être animal. Les souris seront suivies par les zootechniciens qui ont l’expertise de ce type de souris. La biopsie de la queue sera réalisée avant l’ossification de la queue (avant 12 jours), ce qui permettra de diminuer les nuisances chez l’animal. La taille de la biopsie sera réduite à son minimum (inférieur à 1 mm). De plus, le développement du protocole de génotypage à partir de follicule pileux sera mise en place. Dès que des résultats satisfaisants seront obtenus, le génotypage à partir de biopsie de la queue sera arrêté. Enfin, les points limites seront évalués quotidiennement, afin de détecter l'apparition de soufrance de l'animale, à partir de la naissance des souris de la lignée. Ces points limites seront évalués selon une grille de score : il varie de 0 à 4 (4 étant la limite). Le détail de cette grille est explicité dans les procédures. De plus, les critères comportementaux et d’apparences seront aussi pris en compte.

Choix des espèces

Les souris utilisées pour l’étude sont privilégiées pour mimer les maladies inflammatoires intestinales humaines. Ce modèle présente un phénotype inflammatoire spontané́ par la prise d’anti-inflammatoire non stéroïdien pendant neuf jours. Les souris femelles et mâles seront utilisées pour l’ensemble de cette étude. Les souris seront âgées de 9 semaines, car ce sont les souris âgées de moins de 3 mois qui sont le plus susceptible de développer une inflammation intestinale. Les animaux seront hébergés en module dépourvu de pathogènes spécifiques pouvant leur être nuisibles depuis leur naissance jusqu’à leur utilisation. Les croisements seront effectués lorsque la maturité sexuelle sera atteinte (environ 6 semaines). Les croisements seront effectués lorsque la maturité sexuelle sera atteinte (environ 6 semaines). Les souris femelles âgées de 9 semaines seront utilisées pour ce projet, car les souris femelles âgées de moins de 3 mois sont plus susceptibles de développer une inflammation intestinale.

Pour étudier une maladie génétique rare des vaisseaux, 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués pour analyse moléculaire et histologique. Le protocole se limite à une biopsie de l'oreille pour le génotypage, à des pesées et à des mesures mensuelles de pression artérielle au brassard sur la queue, entre deux et six mois. Les rats hypertendus se montrent stressés dès qu'on les saisit ou qu'on les immobilise, ce que le porteur relève sans en tirer de conséquence sur le nombre de mesures. Il justifie le passage de la souris au rat par le peu de matériel disponible chez la souris, volume d'aorte et d'artères, et par l'absence de lignée de souris hypertendue.

Objectifs

L'objectif de ce projet est l’étude physiopathologique de modèles rats d'une maladie génétique rare. Nous souhaitons étudier l’effet de la mutation créée dans un fond génétique pur normotendu et dans un fond génétique hypertendu.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette maladie vasculaire et de proposer des thérapies ciblées pour améliorer le diagnostic, le traitement et le confort de vie des patients.

Procédures

La biopsie à l’oreille pour le génotypage dure quelques secondes et est pratiquée une fois. Les pesées et mesures de pression artérielle au brassard à la queue durent quelques minutes et sont pratiqués une fois par mois entre 2 et 6 mois. L'injection d'antalgie et le placement en cage pour l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort sont pratiqués une fois et durent quelques secondes.

Impact sur les animaux

La biopsie à l’oreille pour le génotypage et la pose de bague induisent un léger stress et une douleur ponctuelle légère. Les pesées, les mesures de pression artérielle au brassard à la queue et la mise dans une cage d’induction à l’isoflurane en fin de procédure peuvent causer un léger stress. Les rats hypertendus présentent un stress lors de leur préhension ou contention.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour analyse moléculaire et histologique

Remplacement

L’étude sur cellules en culture ne permet que d’explorer des modifications limitées à un modèle cellulaire dans des conditions de culture particulière. L'étude sur animal entier est donc indispensable pour la compréhension physiopathologique et pour des tests thérapeutiques. Nous venons de montrer l’intérêt de cette recherche translationnelle de la souris à l’homme. L’étude de rats modèles sur fond normo et hypertendu pourra apporter des éléments supplémentaires à cette analyse.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au nombre nécessaire déterminé par les résultats d’analyses statistiques.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des grilles de score de surveillance avec des points limites suffisamment prédictifs seront renseignées. Les rats hypertendus présentent un stress lors de leur préhension ou contention. La pression artérielle et la fréquence cardiaque seront mesurées de façon non-invasive par un brassard à la queue de l’animal placé sur un plateau chauffant dans une boite de contention adaptée. Afin de diminuer le stress de la contention et de la mesure, les animaux seront habitués chaque jour pendant 4 jours à l’âge de 8 semaines. A la fin de la procédure une exsanguination par prélèvement intracardiaque sans ouverture de la cage thoracique sera pratiquée sous surdosage d’anesthésie gazeuse et analgésie.

Choix des espèces

Même si l’analyse de souris transgéniques modèles a été très instructive dans cette pathologie, la limitation du matériel disponible (volume de l’aorte et des artères pour analyse immunohistologique et moléculaire, difficulté d’analyse in vivo par échographie) et l’absence de modèle de souris hypertendue nous a conduit à faire le choix de développer un modèle de rats. Les animaux seront étudiés à l'âge adulte entre 2 et 6 mois pour que le développement de l'organisme notamment au niveau hormonal soit finalisé.

Les souris porteuses de la mutation recherchée passeront dans d'autres procédures autorisées, les autres, génotype sans intérêt et géniteurs, sont tuées. 45 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit avant le sevrage, entre cinq et dix jours de vie, un prélèvement de cinq millimètres de queue qui dure moins de trente secondes. Le porteur affirme qu'une soixantaine de lignées génétiquement altérées sont "indispensables" à l'activité de la plateforme, et que travailler in vivo reste "indispensable" faute de modèle capable de reproduire un cerveau entier.

Objectifs

L’objectif du projet est d’identifier et de génotyper les animaux génétiquement modifiés ne présentant pas d'atteintes dommageables qui sont élevés au sein de l’animalerie. En effet, notre plateforme héberge une soixantaine de lignées génétiquement altérées qui sont indispensables à une activité de recherche pluridisciplinaire. Ces modèles murins permettent notamment de caractériser anatomiquement des voies neuronales, de faire de l'imagerie ou des enregistrements de l'activité des neurones in vivo ou ex vivo afin de mieux comprendre le fonctionnement normal et/ou pathologique du système nerveux. L’étape d’identification et de génotypage est indispensable pour sélectionner les animaux d'intérêt qui seront par la suite utilisés à des fins expérimentales dans des procédures autorisées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre la mise à disposition d’animaux du bon génotype des lignées de souris transgéniques nécessaires pour la compréhension de certains mécanismes du vivant et, plus particulièrement, le fonctionnement normal et/ou pathologique du système nerveux central.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement de queue de 5mm. L'ensemble de la procédure dure moins de 30s.

Impact sur les animaux

Le prélèvement à la queue (moins de 5mm) peut quelque fois engendrer un léger saignement.

Devenir

Les animaux comportant la mutation ou transgène d’intérêt entreront selon le protocole d'utilisation continue dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le MESRI. Les autres animaux (génotype sans intérêt, géniteurs pour le maintien des lignées) sont mis à mort.

Remplacement

Bien que des méthodes in vitro et in silico se développent de plus en plus, elles ne sont pas encore capables de modéliser fidèlement un organe complet comme le cerveau et encore moins un organisme. A ce jour, il reste donc indispensable de travailler sur des modèles in vivo afin de poursuivre la compréhension des mécanismes mis en jeu dans la plupart des pathologies et en particulier les maladies neurologiques (affections vestibulaires, maladies neurodégénératives...) ou psychiatriques (stress et résilience, addiction …).

Réduction

L’élevage est raisonné et adapté à façon en fonction des projets de recherche. Nous connaissons bien les lignées transgéniques qui sont établies depuis de nombreuses années au sein de la plateforme (taille des portées, âge optimal des géniteurs, fond génétique…) ce qui est un fort avantage pour réduire au minimum le nombre d’animaux produit . Le nombre d’accouplements est calculé au plus juste pour satisfaire aux besoins des projets expérimentaux. Les animaux sont génotypés avant le sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêt pour les autres procédures expérimentales.

Raffinement

Ni douleur, ni souffrance particulière ne sont attendus dans ce présent projet d’élevage. Afin de réduire la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties, nous réalisons la biopsie de queue entre 5 et 10 jours, selon les recommandations et la bibliographie actuellement disponibles. Les bébés sont rendus le plus rapidement possible à leurs géniteurs. L’état de santé des animaux sont vérifiés quotidiennement par le personnel qualifié. Une adoption par une autre mère allaitante peut être réalisée si besoin. Tout animal dont l’état général serait manifestement altéré sera euthanasié immédiatement.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. C’est un des modèles de mammifères les mieux connus sur beaucoup de plans (anatomie, physiologie, histologie, comportement,...). C'est un bon modèle préclinique puisque sa physiologie est assez proche de celle de l'homme. De nombreuses techniques de génétique permettent de modifier son génome à façon. Cela autorise la création de modèles de pathologies humaines mais également l'expression contrôlée de gênes indispensables à l'étude d'organes complexes comme le cerveau. Enfin, nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge si besoin. Les animaux seront identifiés et prélevés pour génotypage entre 5 et 10 jours, c'est-à-dire bien avant le sevrage. Cela permet de déterminer le plus tôt possible le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux.

Les souris de ce projet voient leur accès à l'eau restreint pour les contraindre à apprendre des règles, une puce ayant d'abord été implantée sous leur peau sous anesthésie. 879 souris porteuses de mutations liées à l'autisme vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur revendique un "intérêt majeur au niveau éthique" pour son dispositif, qui éviterait le stress de l'isolement et de la restriction alimentaire, tout en décrivant des souris retirées de l'expérience quand elles ne boivent plus pendant vingt-quatre heures et un modèle qui se blesse la peau à force de se toiletter. Toutes sont tuées à la fin, pour prélèvement et analyse post-mortem.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer le comportement et les capacités cognitives des souris modèles d'autisme avec une approche plus éthologique, en plaçant des groupes sociaux dans une grande cage d’élevage dans laquelle les animaux peuvent apprendre différentes tâches pendant plusieurs semaines, à différents moments du cycle circadien, et sans intervention d’un expérimentateur car les tâches sont programmées et la quantification des performances est automatisée.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à redéfinir le rôle du cervelet et à élargir les perspectives de la recherche sur l'autisme pour mieux répondre aux besoins de la société. Longtemps considéré comme une structure dédiée au contrôle des mouvements, le cervelet apparaît aujourd’hui comme un centre clé de l’intégration des informations sensorielles et des fonctions cognitives complexes, remettant en question les idées reçues en neurosciences. En étudiant l'impact de certaines modifications génétiques liées à l'autisme sur des circuits spécifiques du cervelet, ce projet explore des mécanismes encore méconnus qui pourraient expliquer les troubles sensoriels et cognitifs associés à l'autisme. Il apporte ainsi un éclairage novateur sur les bases neurobiologiques de ce trouble. L’évaluation automatique des comportements et des capacités cognitives dans notre dispositif permettra d a aussi un intérêt majeur au niveau éthique, car il permet de tester les souris dans leur lieu d’hébergement familier, enrichi par le contexte social et par une activité naturelle de recherche de boisson dans des zones différentes de la cage, en évitant tout stress lié à l’isolement, à la restriction en aliment, à l’anxiété induite par un environnement nouveau, ou à la manipulation par l’expérimentateur. Ce dispositif permet aussi l’obtention rapide de résultats sur des cohortes conséquentes de souris dans des conditions expérimentales stables, à la fois pendant les périodes diurnes et nocturnes.

Procédures

Une implantation sous-cutanée de transpondeurs (puce éléctronique) sera réalisée pour chaque souris au moyen d'une anesthésie gazeuse (durée inférieure à 2 minute par souris). Des groupes de 8 à 16 souris agées de 2 mois à 5 mois maximum seront hebergées pendant 2 à 4 semaines dans une grande cage automatisée permettant de mesurer differents comportements spontanés et différents apprentissages Les animaux seront testés pour leur capacité d’apprentissage et de mémoire (mémoire de travail, mémoire spatiale et mémoire associative) et auront pour cela accès à des récompenses (eau sucrée) ou des contraintes limitant de manière temporaire leur accès à l’eau de boisson.

Impact sur les animaux

Une légere gène pourrait être ressentie suite à l'implantation sous-cutanée de la puce nécessaire au suivi des animaux dans le dispositif. Certaines souris pourraient avoir des difficultés d’accès à la boisson du fait de la pression sociale susceptible de s’instaurer dans un grand groupe, ou dans certains protocoles impliquant une compétition sociale ou quand la règle à apprendre pour accéder à la boisson s’avère trop compliquée pour certaines souris modèles présentant un sévère déficit cognitif. L’un de nos modèles de souris peut parfois développer des plaies cutanées dues à un comportement exacerbé d’auto-toilettage. Par ailleurs, un autre modèle présente une sensibilité́ accrue aux bruits

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem : cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire le lien entre des mutations génétiques de gènes liés à l'autisme et les troubles comportementeaux qui en découlent. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre ces liens au travers différentes observations comportementale. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain. La souris représente un choix privilégié en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Humain.

Réduction

En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux réalisés en en milieu semi-naturalisé et des analyses statistiques similaires, nous estimons le nombre nécessaire de souris par groupe à 16 souris. Des tests statistiques seront réalisés afin d'avoir une interprétation stable des résultats. Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble du projet, 879 souris seront nécessaires.

Raffinement

Une semaine avant le début de l’étude, une courte anesthésie (moins de 2 minutes) permet d’injecter sous la peau une petite puce. Une analégsie sera réalisée avant l'injection de la puce. Cette puce sert à suivre l’activité de chaque souris. L’intervention est réalisée par du personnel qualifié et formé à cette procédure. Ensuite, les souris évoluent dans un dispositif expérimental qui leur sert aussi d’habitat. Cet environnement est conçu pour limiter leur stress : elles y vivent en groupe, sans être isolées ni manipulées, et y recherchent leur boisson de manière naturelle, dans différentes zones de la cage. La lumière et la température sont contrôlées pour rester identiques aux conditions habituelles de l’animalerie. Le dispositif comprend quatre abris où les souris peuvent se reposer ou se regrouper. Elles y sont progressivement familiarisées en y vivant en continu pendant plusieurs semaines. Un logiciel surveille leur accès à l’eau et alerte en cas de problème. La quantité de boisson consommée par chaque souris est contrôlée chaque jour pour s’assurer qu’elle boit suffisamment (au minimum 2 à 3 ml par jour pour les protocoles les plus stricts). Si une souris ne boit pas pendant 24 heures, elle est immédiatement retirée de l’expérience pour être hydratée. Si cela arrive pendant la phase de familiarisation, elle peut être réintroduite après une heure si elle ne montre aucun signe de souffrance et a bien bu. En revanche, si elle ne boit toujours pas dans les 12 heures suivantes, elle est retirée définitivement et euthanasiée. Le bien-être des souris est suivi attentivement après l’anesthésie et en cas de retrait du dispositif, grâce à des grilles d’observation spécifiques.

Choix des espèces

La souris représente un choix privilégié pour étudier les alterations comportementales liés à l'autisme en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Humain. Il s’agira de souris adultes âgées de 2 à 6 mois nous permettant d’étudier le comportement sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous arrêtons les tests avant l'effet du vieillissement cérébral (6 mois)

Gardées vivantes après l'unique procédure, les souris de ce projet voient leur sort dépendre du résultat du génotypage et de leur sexe : utilisation dans un autre projet autorisé, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement. 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Sur chacune, entre 13 et 28 jours de vie, deux millimètres de l'extrémité de la queue sont coupés sur animal vigile sous contention, geste que le porteur situe à un âge où la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, avec un risque de saignement et, rarement, de rejet par la mère. Le bénéfice avancé se limite à la gestion de l'élevage, en sélectionnant les animaux porteurs du gène recherché, et le chiffre de 2 500 individus est annoncé sans être ventilé entre les lignées concernées.

Objectifs

Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les projets et pour le maintien des lignées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasive. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée pour le génotypage des lignées utilisées.

Bénéfices attendus

Ce projet permets de selectionner les animaux ayant un gène d'intéret afin d'optimiser la gestion de l'élevage.

Procédures

Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage et/ou de leur sexe parmi les cas suivants : a) Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé, b) Utilisé pour le maintien de la lignée, c) Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.

Remplacement

A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.

Réduction

L’enjeux et l’objectif majeur de la réduction consiste ici à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au stricte nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, si phénotype non dommageable) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir.

Raffinement

La méthodes utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (tels que l'épilepsie, l'autisme, ...). Les prélèvements seront réalisés entre 13 et 28 jours après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémoragiques extrêmement réduits.