Maintien des lignées génétiquement modifiées

10 000 souris génétiquement modifiées vont être triées selon leur génotype, entre celles qui serviront aux protocoles ou à l'élevage et celles dont personne n'aura l'usage. À vingt et un jours, chacune se fait couper moins d'un millimètre du bout de l'oreille, sur animal vigile et sans anesthésie, dans une procédure classée au niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'anesthésier les petits "ajouterait une nuisance non nécessaire", et que cette méthode restera en usage jusqu'à la validation d'un génotypage sur des poils. Les souris jugées non utiles sont mises à mort et proposées aux membres du laboratoire pour des prélèvements d'organes, le chiffre de 10 000 sur cinq ans n'étant rattaché à aucun besoin chiffré.

Objectifs

Ce projet vise à assurer la conservation des lignées de souris modifiées génétiquement présentes dans notre laboratoire et que nous utilisons dans nos différents projets de recherche. Avant de les utiliser pour des expériences ou pour créer de nouvelles générations, il est important de les caractériser précisément. Pour cela, nous devons identifier et prélever un échantillon sur chaque souris dans notre animalerie en utilisant une méthode qui nous permet de connaître très précisement les mutations dont ils sont porteurs.

Bénéfices attendus

La caractérisation génétique permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux d’intérêt, c’est-à-dire nécessaire au maintien de la lignée et/ou aux protocoles expérimentaux.

Procédures

Pour chaque animal vigile (21 jours +/- 1 jour), 1 prélèvement de bout d’oreille inférieur à 1 mm sans anesthésie. Extrêmement rarement, pour vérifier des résultats ou en cas d'échec du génotypage, un prélèvement de bout d'oreille (

Impact sur les animaux

Le prélèvement d’un bout de l’oreille sur animal vigile est réalisé sur moins de 1mm et et par un personnel expérimenté pour limiter la douleur et le stress. En cas d’un deuxième prélèvement en dehors de l’âge limite (>21 jours +/- 1 jour) en cas d'échec du génotypage, l’individu est anesthésié profondément à l’isoflurane.

Devenir

Dés résultat de génotypage, les animaux non utiles seront mis à mort. Les animaux utiles pour les projets ou l'élevage seront maintenus en vie et seront en utilisation continue pour des expériences qui seront décrites dans des DAP spécifiques. Dans la mesure du possible, les animaux génotypés non utilisables sont proposés aux membres du laboratoire pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissus pour génotypage tant que la méthode de génotypage par prélèvement de poils n'est pas validée sur nos lignées. L’approche de remplacement est prise en charge dans chaque DAP expérimentale.

Réduction

La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévue dans la DAP d’expérimentation considérée ou la DAP d’élevage nécessaire au maintien de la lignée. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques, ratio homozygote/hétérozygote…) sont prises en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements.

Raffinement

Les gestes invasifs tel que la pose d’une bague et la biopsie sont réalisés par des personnels expérimentés, selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée, limitant stress, douleur et saignement. L'anesthésie n'est prévue que sur les animaux de plus de 21 jours. L'anesthésie chez les petits ajouterait une nuisance non nécessaire. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation sont réalisés dans les jours suivant le prélèvement. Cette méthode de prélèvements de tissus sera utilisée jusqu’à validation des procédés de génotypage à partir de prélèvements de poils, procédure moins invasive.

Choix des espèces

Les lignées en élevage sont définies par les besoins des projets autorisés. Les animaux seront prélevés d’un bout d’oreille (

Des tumeurs hépatiques apparaissent d'elles-mêmes à partir de six mois chez ces souris, sans qu'aucun geste expérimental ne leur soit infligé. 20 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignée à phénotype dommageable, dans une procédure classée au niveau de souffrance léger. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que l'accumulation de graisse dans leur foie ne nuit pas à leur bien-être et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît jusqu'à douze mois. Les souris utiles à la reproduction sont gardées en vie, les autres tuées avant l'apparition du carcinome, et le projet se limite à faire vivre la lignée, le croisement qui doit répondre à la question scientifique relevant d'une autre autorisation.

Objectifs

Le cancer du foie est la troisième cause de décès par cancer dans le monde. Avec 8500 nouveaux cas par an en France et plus de 7000 morts par an, le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer hépatique le plus fréquent. Le CHC survient à cause d’une accumulation excessive de gras qui favorise le développement tumoral en induisant des modifications majeures dans le métabolisme des cellules du foie. Malgré les progrès thérapeutiques, l’incidence du CHC est en constante augmentation, ce qui constitue un réel problème de santé publique. Les mécanismes moléculaires menant au développement du CHC nécessitent donc d’être plus amplement caractérisés. Des études précédentes ont démontré qu'une protéine est impliquée dans la suppression des métastases lors du développement de la maladie. Récemment, une nouvelle fonction de cette protéine a été découverte. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de la nouvelle fonction de notre protéine d'intérêt dans le développement du CHC. Afin d’atteindre cet objectif, il nous faudra ultérieument croiser des souris qui n'expriment pas notre protéine d'intérêt avec des souris qui développent spontannément des tumeurs dans le foie (phénotype dommageable). La DAP ci-présente concernera uniquement l'élevage des souris qui développent le CHC.

Bénéfices attendus

L'élevage de la lignée murine qui développe spontannément des tumeurs dans le foie nous permettra de les croiser ultérieument avec d'autres souris. Ce croisement nous permettra d’élucider le rôle de la nouvelle fonction de notre protéine d'intérêt dans la physiologie et le cancer du foie. Comme notre protéine d'intérêt a des propriétés anti-métastatiques, elle constitue par conséquent une cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par ailleurs, cette protéine joue un rôle important dans l'homéostasie du foie et pourrait être impliquée dans l'obésité et le diabète.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention puisqu'il s'agit d'une procédure d'élevage de souris à phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

De 0 à 6 mois, certaines souris accumuleront progressivement du gras au niveau du foie ce qui d’après la littérature ne nuit pas à leur bien-être. Dans ce modèle, le cancer du foie commence à apparaître à partir de 6 mois. Jusqu’à 12 mois d’âges, les animaux ne présenteront aucun signe de souffrance et leur qualité de vie ne sera pas impactée. Les animaux ne seront pas utilisés au delà de 12 mois.

Devenir

Les animaux nécessaires à l'élevage seront gardés en vie tandis que les autres seront euthanasiés. Les souris au phénotype dommageable seront euthanasiées avant le développement du cancer du foie.

Remplacement

Bien que nous ayons commencé à étudier les propriétés de notre protéine d'intérêt dans des cellules cancéreuses humaines, il n’est pas possible de reproduire tous les mécanismes sur lesquels nous travaillons dans ces modèles. En effet, la diversité des types cellulaire ainsi que la communication entre les différents organes présente à l'échelle d'un organisme entier ne sont pas reproductible in vitro. Par rapport au modèle de culture de cellules cancéreuses, le modèle souris permet donc d’appréhender l'ensemble des intéractions entre différent types cellulaires et organes qui sont essentielles dans le développement du cancer de foie.

Réduction

Pour réduire au maximum la survenue de petits qui développent des tumeurs hépatiques (phénotype dommageable), les individus seront génotypés puis les reproducteurs optimaux seront sélectionnés en fonction des besoins. Au cours de l’élevage, le nombre minimal d’animaux à phénotype dommageable sera généré pour assurer l'élevage de la lignée.

Raffinement

Les souris seront observées tous les jours afin de contrôler leur mobilité, l’apparence de leur fourrure ainsi leur comportement dans la cage. Concernant l'hébergement, les femelles seront regroupées ensemble tandis que les mâles seront isolés le moins possible. Les animaux seront euthanasiés avant l’apparition du CHC.

Choix des espèces

La souris est un modèle très pertinent pour l'étude du cancer du foie. En effet, le développement de tumeurs chez la souris est facilement réalisable, reproductible et constitue un modèle de référence dans le domaine de l’oncologie. Pour tester nos hypothèses de travail, l'élevage de ce modèle murin à phénotype dommageable est donc nécessaire. Dans ce modèle, les souris commencent à développer des tumeurs hépatiques à partir de 6 mois. Elles seront donc euthanasiées avant cet âge ou avant l’atteinte des points limites détaillés dans les procédures expérimentales. Puisqu’il s’agit d'élever des souris, nous avons besoins d’adultes sexuellement matures c’est-à-dire âgés de 6-7 semaines.

Un bout de queue coupé sur animal vigile, en quelques secondes et sans anesthésie, parfois complété d'une biopsie d'oreille quand le premier génotypage échoue : 2 500 souris subissent ce prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'opération sert à trier les souriceaux au sevrage selon qu'ils portent ou non l'invalidation du gène MLKL, dans deux lignées destinées à l'étude des hépatites. Le porteur qualifie la douleur de brève et d'intensité limitée, tout en signalant que son animalerie cherche activement d'autres méthodes de génotypage, à partir de poils, de salive ou de fèces. Aucune de ces 2 500 souris n'est tuée dans ce projet, 165 sont gardées comme reproductrices et 2 335 passent en "utilisation continue" vers d'autres protocoles expérimentaux.

Objectifs

L'objectif du projet est d'identifier en fonction de leur génotype les souris génétiquement altérées pour une cible (MLKL), protéine impliquée dans une voie de mort cellulaire programmée, la nécroptose. Deux lignées de souris seront exploitées. Au sein de l'une d'elles, la protéine MLKL ne s'exprime dans aucune cellule de tout leur organisme. Quant à la seconde lignée, seules les cellules principales du foie (hépatocytes et cholangiocytes) n'expriment pas la protéine MLKL. Ces souris seront générées pour d'une part maintenir les lignées et d'autre part pour être utilisées dans des projets scientifiques ayant pour but d'étudier l'implication de cette protéine exécutrice de la nécroptose dans des hépatites aigües ou chroniques.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le génotypage de souris nécessaires au maintient des 2 lignées de souris et pour fournir des animaux pour différents projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP d'expérimentation).

Procédures

Le projet permettra d'identifier par génotypage les animaux à partir d’un prélèvement unique d'une biopsie de queue, éventuellement complété d'un second prélèvement de biopsie d'oreille en cas d'échec exceptionnel du premier génotypage. La procédure de prélèvement s'effectue en quelques secondes sur animal vigile. Cela concerne 500 animaux par an.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont celles liées au prélèvement unique d'une biopsie de queue par individu, voir d'un éventuel second prélèvement au niveau de l'oreille. Ce type de prélèvement, qui s'effectue en quelques secondes seulement, n'induit qu'une douleur d'intensité limitée et est extrèmement brève. Elle peut entrainer une sensation d'inconfort, nuisance passagère qui n'entraîne pas de complications majeures.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie, non pas pour une réutilisation, mais pour utilisation continue pour les expérimentations (2335 animaux) ou pour maintien de la lignée (reproducteurs, 165 animaux).

Remplacement

Aucune alternative à un génotypage par PCR à partir d'un échantillon d'ADN isolé à partir d'un fragment de tissu de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux subissant un prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié au maintien des lignées et aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'intérêt.

Raffinement

Pour minimiser la douleur associée au prélèvement de l'extrémité de la queue des souris âgées de 3 semaines, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage. Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). Des approches alternatives, comme le prélèvement de poils, de salive ou de fèces, sont actuellement en cours d'étude.

Choix des espèces

Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathogenèse humaine d'hépatites aigües ou chroniques sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de cellules d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans ces pathologies. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule manipulation). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.

3 600 souris seront transférées vers des projets expérimentaux du laboratoire ou gardées pour maintenir les lignées, les 1 200 autres étant tuées parce qu'elles n'ont pas le génotype attendu ou qu'elles ne sont plus en âge d'être accouplées. 4 800 souris génétiquement modifiées vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Au sevrage, à trois semaines, chacune est immobilisée le temps de la pose d'une boucle à l'oreille et du prélèvement de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Le porteur justifie le recours à cette espèce en affirmant que la souris partage 99 % de ses gènes avec l'humain.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le génotype des souris génétiquement modifiées pour des gènes connus ou candidats pour leur implication dans le développement musculo-squelettique. Ces animaux sont générés pour être, par la suite, utilisés dans des projets de recherches expérimentaux autorisées.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'identifier les génotypes des animaux pour maintenir les différentes lignées de souris génétiquement modifiées nécessaires aux différents projets de recherche au sein du laboratoire et pour optimiser au mieux la gestion des élevages.

Procédures

Au moment du sevrage, les animaux vigiles seront pris en contention pour réaliser l'identification par pose de boucle à l'oreille et la biopsie caudale pour le génotypage. Ce geste ne dure que quelques secondes et n'est répété qu'une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont liées au prélèvement de l'extrémité caudale de queue pour le génotypage pouvant entrainer une sensation d'inconfort et une douleur légère. Les animaux peuvent également ressentir un stress au moment de la contention de l'animal indispensable pour effectuer la pose de la boucle pour l'identification et le prélèvement pour le génotypage.

Devenir

Les animaux présentant le génotype souhaité seront utilisés pour le maintien des lignées ou intégreront les projets expérimentaux du laboratoire autorisés. Les animaux qui ne seront plus en âge d'être accouplés ou qui présenteront un génotype non souhaité seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Remplacement

Il n'est pas possible de modéliser in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Les gènes impliqués dans le développement musculaire peuvent également avoir un impact sur le développement osseux et le métabolisme lipidique en particulier. La souris est un bon modèle pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies liées au développement musculaire et retrouvées chez les mammifères.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé de manière à maintenir la lignée au sein de l'animalerie et de fournir les animaux nécessaires pour les différents projets d'étude au sein du laboratoire. Les schémas d'accouplement ont été optimisés pour ne produire que les animaux génétiquement modifiés nécessaires pour alimenter les projets de recherche. En fin d'expérimentation, une cryoconservation des lignées sera effectuée de manière systématique par congélation de sperme.

Raffinement

L'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux. Le prélèvement de l'extrémité caudale de la queue est réalisé par du personnel qualifié maitrisant ces gestes techniques au moment du sevrage. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne des animaux. En cas d'apparition d'une souffrance inattendue, d'un changement comportement, les animaux seront mis à mort dans les 24 heures suivants l'apparition des signes. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Si un animal se retrouve isolé de manière imprévue, il bénéficiera de deux enrichissements. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix dans l'étude du développement musculaire du fait de la parenté génétique et d'un développement embryonnaire proche des mammifères dont l'homme. En effet, la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme (et forte identité également avec d’autres mammifères sujets de nos travaux de recherche). De plus, les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en œuvre au cours du développement musculo-squelettique sont similaires entre la souris et l’Homme. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 6 semaine pour les femelles et de 8 semaines pour les mâles, âges auxquels les animaux sont sexuellement matures et jusqu’à ce que les animaux commencent à présenter des difficultés à se reproduire (20 à 24 mois). Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 3 semaines.

1 044 souris seront tuées pour n'avoir pas hérité de la bonne modification génétique. Elles font partie des 3 480 animaux que ce projet d'élevage prévoit de faire naître en cinq ans, à raison de trois accouplements par an pour chacune de vingt-neuf lignées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit au sevrage un prélèvement du bout de la queue ou une prise de sang sous anesthésie pour son génotypage, les 2 436 qui portent le bon génotype retournant à l'élevage en attente d'expériences ultérieures. Le porteur décrit la souris comme un modèle "incontournable" pour l'étude des lymphomes B et affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable", le mélange cellulaire en cause n'étant pas reproductible en culture.

Objectifs

Notre laboratoire étudie la réponse immunitaire normale et pathalogique des cellules spécifiques appelées Lymphocytes B avec différents objectifs: • fondamentaux : mécanismes moléculaires régulant la production des anticorps / étude du remodelage génétique / biologie de la transformation tumorale des cellules et devellopement de cancers / physiologie du lymphocyte B normal… • appliqués à des questions de médecine expérimentale : réalisation de modèles mécanistiques d’étude des pathologies de l’immunité / participation à des travaux de recherche clinique / mise en place de nouveaux outils diagnostiques pour les lymphomes ; • finalisés : approches visant notamment à l’amélioration du diagnostic ou du traitement de pathologies tumorales ou immunitaires / développements technologiques autour des méthodes de détection des cellules immunitaires… Toutes ces études nécessitent l'utilisation de différents modèles murins dont le maintien, l'élevage et le génotypage sont décrits ici. Dans les conditions de maintien des lignées (élevage), le phénotype tumoral ne s'exprime pas. Les différentes techniques de génotypage décrites sont : soit par PCR (amplification en chaîne par polymérase) via une biopsie de la queue de la souris qui permet de mettre en évidence la modification génétique sur l'ADN de l'animal ou par ELISA (technique d'immunoadsorption par enzyme liée) via un prélèvement de sang qui permet de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifique.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de maintenir différentes lignées de souris génétiquement modifiées permettant ainsi aux chercheurs de l'unité d'avoir différents modèles d'étude pour mener à bien leur projet de recherche. Les modèles murins génétiquement modifié permettent d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme possèdant un système immunitaire physiologique complet. La modification spécifique d'un géne cible permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de nombreuses maladies en lien avec le dysfonctionnement du système immunitaire et particulièrement les lymphomes ou les maladies de depôts.

Procédures

Les animaux subiront au moment du sevrage un prélèvement de bout de queue ou de sang après anesthésie.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de bout de queue sous anesthésie entraine une douleur de courte durée aprés le reveil de l'animal. Le prélèvement de sang sous anesthésie induit une douleur de courte durée chez l'animal au reveil. Les animaux immunodéprimés sont maintenus dans des conditions particulières afin que leur phénotype dommageable ne s'exprime pas et qu'ils ne soient pas en contact avec des pathogènes.

Devenir

Pour les 5 ans à venir, 3 accouplements seront lancés chaque année pour renouveller le stock d'animaux avec en moyenne 8 petits par portée soit au total 3 accouplements x 29 lignées x 8 petits x 5 ans = 3480 animaux. Sur la totalité des animaux, 70% auront le bon génotypes et seront replacés dans l'elevage soit 2436 aniamux. Les 30% n'ayant pas le bon génotype seront euthanasiés, soit 1044 animaux.

Remplacement

La réponse immune B et le développement des maladies lymphoprolifératives sont étroitement liés à la présence et à l'interaction de populations cellulaires et d’un microenvironnement adapté (cellules stromales de différents types, facteurs de croissance, chimiokines…). Ce mélange complexe n’est pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux vivants est indispensable pour pouvoir étudier ces mécanismes.

Réduction

Notre laboratoire possède une grande expérience dans l’élevage des lignées murines destinées à la recherche ce qui permet d’anticiper le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires au maintien de chaque lignée ainsi que le nombre de portées nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’animaux pour effectuer les diverses expériences. Ce projet comprend un grand nombre d'animaux car il décrit l'ensemble des lignées de souris élevées par notre laboratoire pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux produits est réduit au minimum afin d'être suffisant pour maintenir la lignée et effectuer les expérimentations ultérieures tout en évitant de produire des animaux inutilement.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux : les prélèvements de sang et de tissus seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé et tout animal présentant des signes de souffrance sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Il existe une très forte homologie de structure et fonction entre les locus IgH humain et murins faisant de la souris un modèle expérimental incontournable pour l'étude des disfonctionnements oncogéniques aboutissant à la genèse des lymphomes B et pour le developpement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La souris est également l'espèce de référence internationale pour l'étude des lymphomes. La réponse immune B et le développement des maladies lymphoprolifératives sont étroitement liés à la présence et à l'interaction de populations cellulaires et d’un microenvironnement adapté (cellules stromales de différents types, facteurs de croissance…). Ce mélange complexe n’est pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux vivants est indispensable pour pouvoir étudier ces mécanismes. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel mâles et femelles sont sexuellement matures et jusqu’à l’âge de 20 semaines car les animaux plus âgés (en particulier les femelles) commencent à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 4 semaines.

Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.

Objectifs

Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.

Bénéfices attendus

Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.

Procédures

Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.

Devenir

Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.

Réduction

Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.

Les 25 000 souris de ce projet naissent dans l'animalerie de la plateforme et sont génotypées pour être triées, celles qui portent la mutation attendue étant destinées à d'autres protocoles. Elles subissent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une biopsie caudale de moins de cinq millimètres pratiquée sur animal vigile en cinq secondes. Le porteur décrit une légère perte de sang, une contention brève, du stress et une légère douleur, et ne dit rien du sort des souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt. Il affirme travailler sur des pathologies "qui ne peuvent être mimées par des cellules en culture" et conclut que l'utilisation de souris transgéniques "reste obligatoire" pour de nombreux projets de recherche.

Objectifs

Les diverses unités utilisatrices de notre plateforme s’intéressent à des thématiques diverses aussi bien dans le domaine de la biologie du développement, du métabolisme, de la trisomie 21, de tumorigénèse, le développement de vaccins… Parmi les maladies sur lesquelles nous travaillons, des modèles murins précliniques présentent des mutations gain ou perte de fonction, modèles inductibles Cre-Lox. L’objectif de ce projet est d’identifier et de génotyper des animaux génétiquement modifiés reproduits au sein de notre animalerie. Cette étape est essentielle pour identifier les animaux qui seront ensuite utilisés à des fins expérimentales dans les projets déposés au MESRI.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre la mise à disposition d’animaux d'un génotype d'intérêt pour le projet. Des lignées de souris transgéniques sont nécessaires pour la compréhension de certains mécanismes du vivant.

Procédures

Un prélèvement caudal (biopsie de la queue) de moins de 5mm pour génotypage (5s) sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Une contention de courte durée est nécessaire, pouvant entrainer un stress et une légère douleur.

Devenir

Les animaux comportant la mutation ou transgène d’intérêt seront utilisés en continu dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le MESRI.

Remplacement

Nous travaillons sur des pathologies qui ne peuvent être mimées par des cellules en culture (développement d’une obésité, d’une trisomie 21...). Il n’est donc pas encore possible de se passer totalement des modèles animaux. A ce jour, l'utilisation de souris transgéniques reste obligatoire pour de nombreux projets de recherche fondamentale et translationnelle.

Réduction

Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche des équipes. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris transgéniques (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. En effet, le nombre de couples en reproduction est monitoré au plus près afin de l’adapter en temps réel aux besoins expérimentaux. A cette fin, les animaux sont génotypés avant le sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêts pour les autres procédures expérimentales.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées en groupe dans l’animalerie avec un statut sanitaire contrôlé. Les installations (ventilation, température et lumière) ainsi que les cages (nourriture, eau, enrichissement) sont vérifiées quotidiennement afin de réduire la détresse des animaux. De plus, un suivi quotidien des animaux est réalisé par les animaliers afin de vérifier leur bien-être. Les animaux sont euthanasiés par des procédures appropriées si leur état se dégrade soudainement. Les souris présentant une perte poids de plus de 10% ou une dégradation de leur état général sont monitorées tous les jours par le personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La souris mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles transgéniques pour nos molécules d’intérêt existant, l’utilisation du modèle murin est légitimée. Enfin, nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Les animaux seront marqués avant le sevrage entre 10 et 15 jours afin d’être génotypés avant le sevrage (soit à minimum 21 jours). Cela permet de rapidement déterminer le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux au moment du sevrage.

Produire des souris atteintes d'un cancer du foie et les expédier vers un autre établissement, c'est tout l'objet de ce projet, qui n'y ajoute aucune expérience. 1 680 souris mâles porteuses de la modification ASV-B vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles développent une dysplasie du foie à huit semaines, des nodules et un abdomen gonflé à douze, puis un carcinome diffus à partir de seize semaines. 600 d'entre elles sont expédiées vivantes avant sept semaines, avant l'apparition du phénotype, les 1 080 gardées pour la reproduction étant tuées avant quatre mois.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seuls 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques et de pouvoir les tester dans un modèle pertinent d’un point de vue de la pathologie humaine. L’objectif de ce projet est de produire, dans notre établissement, un modèle de souris transgéniques (ASV-B) développant un cancer du foie sur foie sain, mimant parfaitement la maladie qui se développe chez le patient. Ces animaux seront ensuite expédiés dans un autre établissement utilisateur afin d’y tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique qui vise à permettre l’évaluation de nouvelles thérapies anti-angiogéniques mais également l’intérêt de l’immunomodulation dans le carcinome hépatocellulaire.

Procédures

Les mâles ASV-B utilisés pour l’élevage dans notre EU peuvent manifester un phénotype dommageable léger au-delà de 12 semaines (abdomen légèrement tendu à la palpation sans gêne particulière) et seront mis à mort avant un stade avancé de la pathologie (avant 4 mois). Les mâles ASV-B utilisés pour l'expérimentation seront expédiés avant 7 semaines, soit avant le début de l’expression du phénotype dommageable dans notre EU. Au total, 1680 mâles ASV-B seront générés en 5 ans : 1080 pour l’élevage et 600 pour l’expérimentation. Pour cette DAP, aucune autre intervention ne sera réalisée dans notre établissement.

Impact sur les animaux

Les souris ASV-B mâles développent la pathologie en 3 phases : à 8 semaines le foie grossit (dysplasie, sans douleur), à 12 semaines, peuvent apparaître un léger gonflement de l’abdomen et de petites taches blanches sur le foie (nodules) mais les animaux restent actifs, se nourrissent et se déplacent. À partir de la 16ème semaine, la totalité du foie commence à être atteinte (carcinome diffus). Des études ont déjà été menées par les porteurs de projet avec ce modèle et ont démontré que le foie tumoral ne devrait augmenter ni au point d’interférer significativement avec les fonctions normales du corps, ni au point d’induire, du fait de son emplacement, souffrance et/ou détresse, entre la 6ème à la 22ème semaine de vie de l’animal concernant les mâles. Selon nos observations, les mâles gardés au-delà de 12 semaines pour la reproduction peuvent manifester un phénotype léger (abdomen légèrement tendu à la palpation sans gêne particulière) et sont mis à mort avant un stade avancé de la pathologie (avant 4 mois).

Devenir

Une partie des mâles portant le génotype d’intérêt ASV-B sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée pour expérimentation dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des mâles ASV-B sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les mâles utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 4 mois, soit avant le stade avancé de pathologie, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

Dans le développement des médicaments anti-cancéreux, l’utilisation d’animaux est aujourd’hui indispensable. En effet, les résultats in vitro sont une étape primordiale, puisqu’ils permettent d’évaluer les effets directement sur les cellules tumorales. Toutefois, les immunothérapies et les anti-angiogéniques nécessitent également de pouvoir évaluer les effets dans un système « intégré ». Nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. À ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 1680 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements permettant la nidification. Les mâles ASV-B sont susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 12 semaines et seront ainsi expédiés avant 7 semaines pour l’expérimentation dans un autre établissement, avant le début de l’expression du phénotype dommageable. Dans le cas où les mâles ASV-B ne sont pas transférés vers l’autre établissement pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 4 mois, avant le stade avancé de la pathologie (abdomen légèrement gonflé sans gêne particulière peut être observé après 12 semaines). Ils seront suivis tous les jours à partir de 8 semaines et ce jusqu'à leur mise à mort avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent car la plupart des immunomodulateurs reconnaissent les cibles murines. De plus, les grosses molécules comme les anticorps, sont réputés pour être difficiles à tester dans des conditions in vitro, et de ce fait, les tests in vivo peuvent être privilégiés. Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC), le modèle ASV-B. C’est un modèle syngénique avec un système immunitaire fonctionnel, idéal pour tester les immunomodulateurs, présentant les mêmes anomalies vasculaires que la pathologie humaine. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse miment à la perfection celles observées chez l’homme (CHC sur foie sain). La pathologie évolue en 3 phases : à 8 semaines le foie grossit (dysplasie, sans douleur), à 12 semaines peuvent apparaître un léger gonflement de l’abdomen et de petites taches blanches sur le foie (nodules) mais les animaux restent actifs, se nourrissent et se déplacent. À partir de la 16ème semaine, la totalité du foie commence à être atteinte (carcinome diffus). Les mâles ASV-B seront ainsi envoyés pour expérimentation avant 7 semaines, avant le début de l’expression du phénotype dommageable. Les mâles ASV-B seront utilisés pour les croisements dès l’âge de 6 semaines et ce jusqu’à 4 mois, soit avant le stade avancé du phénotype dommageable (abdomen légèrement gonflé sans gêne particulière peut être observé après 12 semaines). Les femelles non porteuses de la modification ASV-B étant saines, aucune restriction d’âge n’est attendue. Elles seront utilisées pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable.