Maintien des lignées génétiquement modifiées

Une biopsie de la queue, des injections quotidiennes pendant quatre ou cinq jours pour bloquer un gène, un prélèvement de sang sous anesthésie : les actes décrits durent chacun quelques dizaines de secondes. 2 064 souris vont être utilisées, 1 104 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 960 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever l'intestin et les fèces. Les souris issues de l'élevage qui ne servent à aucune procédure sont tuées aussi. Le porteur veut comprendre comment une alimentation riche en lipides, le microbiote et le sexe influencent le cancer colorectal, et signale que le développement spontané des tumeurs provoque une douleur modérée. Il justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".

Objectifs

Les objectifs du projet sont de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du côlon et du rectum. Des données de la littérature ont montré qu’une alimentation riche en lipides était un facteur de risque pour le cancer du côlon et du rectum. Une partie des effets délétères de ces régimes est médiée par des changement de la population microbienne de l’intestin. De plus, il existe une importante différence en fonction du sexe d’un individu en ce qui concerne la probabilité de développer un cancer du côlon et du rectum. Ce projet a pour but de comprendre comment les régimes alimentaire, le microbiote et le sexe influencent le développement de ce type de cancer.

Bénéfices attendus

Ces travaux devraient contribuer à une meilleure compréhension du rôle de la nutrition, du sexe de l’individu et du microbiote dans l’initiation et le développement du cancer du côlon et du rectum.

Procédures

1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 Contention pour injection d’une molécule bloquant l’expression d’un gène : 20 secondes, (1X/jour pendant 5 ou 4 jours). 1 Contention pour injection d’une molécule marquant la prolifération cellulaire : 20 secondes. 1 Prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors de la contention et des injections. L’adaptation des souris aux nouveaux régimes ainsi que le développement des tumeurs peuvent induire une perte de poids. Une douleur légère lors de la biopsie. Le développement spontané de tumeur peut engendrer un stress chez la souris et une douleur modérée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établis. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permet d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le développement du cancer colorectal. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

Amputées d'un fragment de queue entre sept et dix jours pour connaître leur génotype, 772 souris génétiquement modifiées entrent ensuite dans un protocole de trois mois, douze injections hebdomadaires pour les unes, quatre-vingt-dix administrations quotidiennes pour les autres, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour d'autres encore. 492 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 280 d'un niveau modéré. La lignée perd spontanément neurones et synapses à partir de six mois, et le porteur prévoit de tuer les souris à ce moment précis, au début de la perte, avant que leur état général ne se dégrade visiblement. Toutes sont tuées, celles qui servent à l'évaluation des traitements pour prélever leur cerveau, les autres parce que leurs modifications génétiques interdisent de les replacer ou de les réutiliser.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer, des pertes de neurones et de synapses, les connexions entre les neurones, se produisent dans le cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Ainsi, des traitements visant à réduire ces pertes pourraient protéger contre les déficits cognitifs. Une autre des caractéristiques de la maladie d’Alzheimer est l’agrégation d’un peptide appelée bêta-amyloïde en plaques qui vont s’accumuler de façon anormale dans le cerveau. Les traitements actuels visent à réduire leur quantité, mais ils ne permettent que de freiner l’évolution de la maladie, pas de la stopper. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de ces traitements sur les pertes de neurones et de synapses chez souris génétiquement modifiées, modèle murin de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

On estime que plus de 850 000 personnes sont affectées par la maladie d’Alzheimer en France, avec une espérance de vie de 8 à 12 ans à partir du moment où le diagnostic est établi. Le mécanisme des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer est encore très mal connu. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre l’implication du peptide bêta-amyloïde dans ces mécanismes. A plus long terme les résultats obtenus pourraient orienter vers de nouvelles pistes pour l’amélioration des traitements existant.

Procédures

Dans le cadre de l’élevage de souris génétiquement modifiées modèles de maladie d'Alzheimer nous réaliserons une biopsie chez l’ensemble des souriceaux (une fois, vigile, durée de moins d’une minute par animal) pour déterminer leur patrimoine génétique. Des souris recevront une injection hebdomadaire pendant 3 mois d’un traitement pharmacologique (12 injections maximum, vigile, durée de moins d’une minute par animal). D’autres souris recevront une administration quotidienne d’un autre traitement pendant 3 mois également (90 administrations maximum, vigile, durée de moins d’une minute par animal). Enfin des souris auront une chirurgie unique sous anesthésie générale, avec une prise en charge analgésique adaptée. Cette chirurgie durera une heure et sera faite une seule fois. Toutes les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer leur patrimoine génétique. Il existe un risque rare de saignement suite au geste. Les souris génétiquement modifiées que nous utilisons dans ce projet développent spontanément une perte de neurones et de synapses avec l'âge, mais elles seront euthanasiées au début de cette perte. La contention des souris nécessaire pour les manipulations (administration et injection) peut entrainer du stress. Les administrations et injections pourront entrainer une légère et brève douleur ou un risque d'irritation de l'œsophage lié à la répétition des administrations. La chirurgie sera associée à un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser entrainera des risques d’hypothermie et de sécheresse oculaire ainsi qu’un risque rare d’arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Toutes les souris utilisées pour l’évaluation des traitements seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser les effets obtenus. Les souris non utilisées pour ces évaluations seront euthanasiés soit pour des analyses post-mortem de la pathologie soit car il ne sera pas possible de les replacer ou les réutiliser du fait de leurs modifications génétiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet le mécanisme de la neuro-dégénérescence dans la maladie d’Alzheimer n’est pas connu. Or les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et de synapses adultes au sein d’un organisme et donc d’évaluer l’effet des traitements utilisés dans la maladie d’Alzheimer sur la neurodégénérescence.

Réduction

Au cours du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 772 souris. Nous n’utiliserons que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour maintenir notre lignée, réaliser les procédures expérimentales, et réaliser des analyses nécessitant seulement la collecte de tissus post-mortem. De plus, le nombre d’animaux utilisés pour les procédures expérimentales est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des composants de nidification et des bâtonnets à ronger. Une observation quotidienne des animaux est effectuée. En cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge adaptée (soins ou euthanasie si nécessaire). Des points limites sont définis pour chaque procédure et ils seront respectés afin de prendre en charge les animaux et éviter toute souffrance. Les souris que nous utilisons dans ce projet présentent une perte de synapses et de neurones à partir de l’âge de 6 mois, elles seront euthanasiées à ce moment-là donc au début des pertes, avant que cela n’engendre un impact visible sur leur état général. De plus pour l’élevage nous n’utiliserons que des mâles pouvant développer ces signes afin de favoriser une bonne prise en charge des petits par leur mère. Le prélèvement d’un fragment de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un geste rapide et parfaitement maitrisé. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprélèvement était nécessaire il sera réalisé au niveau de l’oreille de l’animal et n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie avec une analgésie adaptée. La température des animaux sera maintenue tout au long de leur anesthésie et un gel oculaire sera appliqué pour éviter toute sécheresse oculaire. Nous réaliserons un suivi rapproché en post-opératoire afin d’évaluer l’état de l’animal et adapter sa prise en charge.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche pour modéliser les pathologies humaines. Son patrimoine génétique est bien connu et nous disposons des outils nécessaires pour le modifier permettant de créer et étudier de nombreux modèles de maladies humaines. Pour la maladie d’Alzheimer nous disposons d’un modèle génétiquement modifié déjà existant qui permet de reproduire les pertes de synapses et neurones observées chez l’humain, nous permettant dans le contexte de ce projet d’évaluer l’impact de traitements sur ces pertes. Le prélèvement pour déterminer les modifications génétiques portées par les souriceaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux. Les traitements visant à prévenir les pertes de neurones et de synapses seront commencés à 3 mois, avant que ces pertes ne soient détectées, et leurs effets seront analysés à 6 mois, quand les pertes sont significatives.

226 souris vont être utilisées, dont 202 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, les reproductrices et reproducteurs âgés étant réformés et tués eux aussi. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, puis une injection dans le cerveau sous anesthésie, dont le porteur écrit qu'elle provoque une douleur aiguë "modérée à sévère" liée à l'incision, au forage et à l'inflammation locale, alors qu'aucune procédure du projet n'est déclarée sévère. À sept et dix mois, les animaux passent un test de reconnaissance d'objet et un test de mémoire en labyrinthe, les mâles le matin pour que la présence des femelles ne biaise pas les résultats. L'objet est de tester si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de la protéine Tau, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait que la lignée soit déjà disponible sur place.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.

Procédures

Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.

Remplacement

Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau

Réduction

Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.

Choix des espèces

Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.

2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs intestins et leurs fèces, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, cinq jours d'injections quotidiennes d'une molécule bloquant un gène, une irradiation de cinq minutes et un prélèvement de sang sous anesthésie. Les souris nées dans l'élevage et non retenues pour les procédures sont tuées elles aussi. Le porteur attend de ce travail sur les cellules souches de l'intestin des traitements nutritionnels "à plus long terme" et justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur le maintien et l’autorenouvellement des cellules souches intestinales. Ces cellules permettent un renouvellement permanent de l’épithélium intestinal, essentiel pour maintenir l’équilibre du tissu intestinal et réparer les lésions causées par divers stress. Au cours du projet, l’irradiation provoque une accélération du renouvellement des cellules souches intestinales. Ainsi, il devient possible d’explorer comment les modifications du métabolisme des lipides entrainées par des changements alimentaires jouent sur cet équilibre. La flore intestinale joue également un rôle important dans le maintien de ce tissu. Un traitement antibiotique permet également d’évaluer la contribution de cette flore au phénotype observé.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.

Procédures

1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 contention pour injection de de molécule bloquant l’expression d’un gène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). 1 irradiation : 5min. 1 contention pour injection d’anesthésique: 20 secondes. 1 prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une douleur légère et de courte durée lors de la biopsie et un stress lors de la contention et des injections. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. L’irradiation peut provoquer une perte de poids et un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus l’expérimentation, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établies. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

Vérifier si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de protéine Tau dans l'hippocampe : 226 souris sont utilisées pour cela dans le troisième des trois établissements de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris Tau22 développent des lésions cérébrales et des pertes de mémoire à partir de six à neuf mois, après une injection de vecteur de thérapie génique dans le cerveau et deux tests de mémoire passés à sept et dix mois. La mise à mort passe par une ouverture du thorax sous anesthésie profonde, le porteur écrivant qu'une perfusion réalisée après le décès abîmerait les mitochondries qu'il veut observer. Les reproducteurs âgés sont réformés et tués eux aussi, aucun animal génétiquement modifié ne pouvant être placé ni relâché.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.

Procédures

Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.

Remplacement

Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau

Réduction

Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.

Choix des espèces

Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.

226 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue entre sept et dix jours de vie, puis une injection de vecteur de thérapie génique dans le cerveau sous trente minutes d'anesthésie, acte dont le porteur reconnaît qu'il provoque une douleur aiguë modérée à sévère liée à l'incision, au forage et à l'inflammation. À sept et dix mois, chaque animal passe un test de reconnaissance d'objet puis un test de mémoire en labyrinthe, la question étant de savoir si une protéine du recyclage cellulaire freine l'accumulation de protéine Tau. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'agrégation de Tau est "particulièrement difficile" à reproduire in vitro et conclut que la souris génétiquement altérée reste "nécessaire".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.

Procédures

Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.

Remplacement

Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau

Réduction

Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.

Raffinement

Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.

Choix des espèces

Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.

Biopsie de deux millimètres au bout de la queue, tatouage des coussinets avant le sevrage, gavage oral, prélèvement de sang à la joue toutes les deux semaines, jeûne de douze à quinze heures, puis mise à mort par dislocation cervicale. 20 960 souris vont être utilisées, 20 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 800 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce que les souris seront étudiées avant l'apparition du phénotype dommageable, et décrit aussi une baisse d'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité liés aux lésions prétumorales et au vieillissement accéléré. Rien ne justifie un effectif de 20 960 animaux au-delà d'une phrase sur le "nombre minimum d'animaux nécessaires".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de développer de nouvelles lignées de souris présentant une activation ou diminution d’une molécule d'intérêt récemment identifiée impliquée dans le métabolisme des lipides et qui serait responsable du vieillissement cellulaire. Nous souhaitons moduler génétiquement son expression dans un contexte de lésions précancéreuses et tester son effet thérapeutique sur la progression des lésions dans le tissu. Nous souhaitons confirmer des données obtenues dans un modèle cellulaire sur sa capacité à induire le vieillissement cellulaire.

Bénéfices attendus

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.

Procédures

-avant le sevrage, (2 contentions, quelques secondes ) pour biopsie de queue de 2 millimètres et pour le tatouage aux coussinets -lors des pesées (1 contention, quelques secondes ) - gavage oral à 3 ou 6 semaines de vie (1 ou 5 fois, avec 1 minute par gavage) -prélèvement de sang à la joue (1 fois toutes les 2 semaines, quelques minutes -1 jour avant la mise à mort (mise à jeun (1fois, 12 à 15H) mise à mort précoce par dislocation cervicale et prélèvement des tissus pour différentes analyses.

Impact sur les animaux

-léger stress due à la contention pour biopsie, identification, pesée et prélèvement sanguin -Le gavage oral quotidien peut engendrer des risques de fausse route. -Les souris induites développent des lésions non dommageables à un âge précoce et seront étudiées avant le phénotype dommageable. -Les lésions prétumorales et le vieillissement accéléré peuvent entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité.

Devenir

​Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure pour renouveler les croisements ou pour exploration des tissus et organes d'intérêt.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.

Réduction

Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par des tests statistiques adaptés, et qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux en cage ventilée. Une surveillance accrue sera mise en place tout au long de la procédure. Cependant, tout animal en souffrance sera mis à mort avant l'apparition des points limites stricts et spécifiques définis selon les recommandations en vigueur.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les jeunes souris de trois semaines sont utilisées car il est nécessaire que les organes soit suffisament matures et fonctionnels.

Cent prestations de reproduction assistée et de congélation d'embryons commandées par des laboratoires : 10 700 rats vont être utilisés en cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 10 000 d'entre eux et modéré pour 700 autres. Les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle pour produire un maximum d'embryons, puis sont tuées pour les récupérer. Les mâles sont vasectomisés et les femelles receveuses subissent une laparotomie d'implantation, avec une douleur abdominale et un risque de mort sous anesthésie. Les mâles vasectomisés sont utilisés pendant dix-huit mois puis tués, leur "efficacité" s'affaiblissant au-delà, les receveuses sont autopsiées après avoir élevé et sevré leurs petits, et seule une partie des jeunes est expédiée au chercheur commanditaire.

Objectifs

La reproduction assistée est utilisée chez le rat pour produire des modèles murins utilisables par la communauté scientifique dans les domaines de la recherche fondamentale, biomédicale, pharmaceutique et préclinique. Afin d’assurer la reproductibilité des études et garantir les résultats obtenus, il est indispensable d’utiliser des modèles génétiquement contrôlés et aux statuts sanitaires conformes aux standards européens. La reproduction assistée est également utilisée dans les élevages pour synchroniser les naissances dans le but d’obtenir des lots d’animaux génétiquement identiques et au même âge (cohortes) pour des besoins expérimentaux. Nous proposons également à la communauté scientifique la possibilité de cryoarchiver sous forme d’embryons leurs lignées. La congélation d’embryons est essentielle pour préserver les modèles de recherche de différents aléas (problème d’élevage, perte de la lignée, dérive génétique, etc.) et permet de réduire le nombre d’animaux utilisés uniquement pour le maintien des colonies. La congélation de lignées permet également de distribuer les lignées sous forme d'embryons congelés en remplaçant le transport d’animaux vivants.

Bénéfices attendus

Les techniques de cryoconservation et reproduction assistée contribuent concrètement aux principes des 3Rs (Réduire, Raffiner, Remplacer) en limitant au maximum la préservation de lignées sous forme respirante et le recours aux accouplements superflus. De plus, l’archivage de lignées en facilite l’accès à l’ensemble de la communauté scientifique, contribuant ainsi à mutualiser l’utilisation d’animaux en optimisant les ressources existantes. Ces techniques permettent aux chercheurs d’utiliser des animaux au statut sanitaire souhaité et génétiquement contrôlés dans le but d’assurer la reproductibilité et la fiabilité de leurs études.

Procédures

Injection sur animaux vigiles : 1 intra-péritonéale d'anesthésique (2 secondes par animal) ou 2 intra-péritonéales d'hormones à 48h d'intervalle. Injection sur animaux déjà anesthésiés : 1 sous-cutanée pré-opératoire d’analgésique (2 secondes par animal) puis une sous-cutanée post-opératoire d’analgésique (2 secondes par animal). Chirurgie ne dépassant pas 10 minutes par animal : vasectomie ou laparotomie pour implantation embryonnaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables sont liés essentiellement aux injections (superovulation de femelles donneuses) ou à la chirurgie (réimplantation d’embryons sur femelles receveuses et vasectomie de mâles) : douleur ou rougeur sur le lieu d'injection ou d'incision/suture, douleur abdominale suite à la chirurgie, mortalité pendant l'anesthésie. Certaines prestations pourront impliquer l'utilisation d'animaux à phénotype potentiellement dommageable ou induire la naissance d'animaux à phénotype dommageable. Dans ce cas, nous tiendrons compte des recommandations de raffinements propres au modèle, décrites dans les procédures pour leurs élevages.

Devenir

La majorité des animaux issus de ce projet seront mises à mort à la fin de la réalisation de chaque procédure. Les mâles vasectomisés seront utilisés pendant 18 mois pour générer des femelles pseudogestantes puis mis à mort car au-delà de cet âge, leur "efficacité" s'affaiblit. Les femelles superovulées sont mises à mort afin de récupérer les embryons d'intérêt. Les femelles receveuses sont laissées en vie après la chirurgie implantatoire pour donner naissance aux petits, les élever et les sevrer. Ces femelles sont ensuite adressées au service de diagnostic microbiologique afin d'effectuer une autopsie et vérifier la conformité sanitaire des petits avant leur utilisation pour des projets de recherche. Seulement une partie de petits seront gardés en vie et transférés dans une zone d'hébergement de l’EU ou expédiés au chercheur ayant fait la demande de prestation.

Remplacement

L'objectif du projet est de cryopréserver ou de redériver/revivifier un modèle animal. De ce fait, aucun remplacement n'est possible parce qu’à ce jour, pour le cryoarchivage ou la reproduction assistée d’une lignée de rat, il n’y a pas d’autre alternative que l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu a été calculé afin de pouvoir réaliser un volume de 100 prestations sur 5 ans en utilisant le nombre d'animaux minimum nécessaire. L’utilisation de lots homogènes d’animaux (âge, génotype et statut sanitaire) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, optimise les résultats obtenus et évite notamment les répétitions. La superovulation permet d’obtenir un maximum d’embryons en réduisant le nombre de femelles utilisées. Ces femelles seront réutilisées si elles ne présentent pas de bouchon vaginal. De plus, un tri des embryons sous microscope est réalisé avant le transfert, il consiste en la sélection des embryons au préalable selon leur morphologie pour augmenter la probabilité de viabilité de ces derniers. Pour les cryopréservations de lignées, dans la mesure du possible les chercheurs nous fournissent de jeunes mâles bons reproducteurs afin d'utiliser le moins possible d'animaux pour chaque lignée cryopréservée. Les mâles sont mis régulièrement en accouplement avec des femelles produites dans notre EU ou fournies par les autres EU.

Raffinement

Les animaux sont hébergés si possible en groupe social et ont à disposition trois types d’enrichissement (refuge, matériaux de nidification et de rongeage). Au vu de la douleur estimée comme modérée (incision lombaire inférieure à 1cm et temps d’intervention inférieur à 5 min), on estime que l’analgésie doit durer 24h post-chirurgie. Le protocole appliqué est une anesthésie par voie intrapéritonéale (IP) et une fois l’animal endormi, une injection sous-cutanée (SC) d'analgésique est effectuée. A la fin de la chirurgie, une injection sous-cutanée d'antidouleur est effectuée. Pour les animaux ayant subi une microchirurgie (les mâles vasectomisés et les femelles après réimplantations d’embryons), un suivi post-opératoire avec grille de scoring est réalisé à +1h, +4h et +24h après intervention, avec prolongation possible à +48h et +72h. Dans le cas où des animaux à phénotype dommageable seraient utilisés dans ce projet, nous tiendrons compte des recommandations de raffinements propres au modèle. L’expérience de notre EU dans la reproduction assistée et la cryoconservation de lignées nous permet d’optimiser nos pratiques.

Choix des espèces

Le rat est la quatrième espèce animale la plus utilisée à des fins scientifiques en France (source : enquête statistique 2023). De ce fait, les prestations de service sur ce modèle sont de plus en plus demandées par les chercheurs utilisateurs de notre plateforme. Les femelles sont utilisées à partir de 3 semaines pour la superovulation. Les mâles vasectomisés doivent être matures sexuellement (à partir de 7-8 semaines) pour les accouplements contrôlés, ainsi que les femelles pseudo gestantes réimplantées.