Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Conservation des espèces
- Enseignement supérieur et formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Recherche fondamentale
- Tests réglementaires
Création de lignées murines originales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
19 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs vivent cinq ans en isolement intermittent, ne rejoignant des femelles qu'une nuit à la fois, et sont tués au gaz carbonique avant leurs douze mois. Les donneuses reçoivent deux injections hormonales à quarante-huit heures d'intervalle puis sont tuées par dislocation cervicale pour la récolte des embryons, les receveuses subissent un transfert d'embryons sous anesthésie générale et sont tuées en fin de procédure, un second transfert leur étant refusé. Le porteur reconnaît que l'isolement peut générer de l'anxiété chez un animal social, et présente cette plateforme de création de lignées comme un moyen d'obtenir des souris modifiées "en utilisant peu d'animaux".
Objectifs
Les équipes des instituts de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées sous une forme similiaire chez des patients humains, à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. La plateforme a pour objectif la génération de tels modèles murins transgéniques sur site, par approche Crispr/Cas 9.
Bénéfices attendus
L'application du système Crispr/Cas9 à l'embryon de souris permet l'obtention de souris d'intérêt génétiquement modifiées dans des délais courts, en utilisant peu d'animaux (de part l'efficacité des réactifs utilisés), et ce directement dans un fonds génétique d'intérêt donné. Les lignées génétiquement modifiées créées par notre plateforme sont des modèles de choix pour la communauté scientifique. En effet, ce sont des modèles pour la recherche fondamentale, mais aussi des modèles de pathologies humaines servant à mieux comprendre les processus de développement de ces maladies et voire même à tester des molécules/médicaments afin de valider (ou invalider) des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs seront herbergés en situation d'isolement sur 5 ans. Les femelles donneuses seront soumises à une stimulation hormonale (2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 5 secondes) à 48h d'intervalle). Les femelles receveuses recevront des embryons par transfert d'embryons dans l'oviducte sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 40min). Les souriceaux fondateurs seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables. Les souriceaux issus des accouplements des fondateurs seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables.
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement, ces accouplements n'ayant lieu que sur des périodes courtes (une nuit) pour permettre le contrôle et la synchronisation de l'initiation des pseudo-gestations (dans le cas des mâles vasectomisés) ou pour permettre la production d'embryon un jour donné (dans le cas des mâles reproducteurs). L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons. Les animaux issus de ces manipulations peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. Une fiche de suivi sera attribuée à chacun d'entre eux.
Devenir
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs en situation d'isolement seront mis à mort par inhalation de CO2 via un système dédié avant qu'ils aient 12 mois. Les femelles donneuses sont mises à mort par dislocation cervicale afin de récolter les embryons post-mortem. Les femelles receveuses ne peuvent pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons, elles sont donc mises à mort par inhalation de CO2 via un système dédié en fin de procédure.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveurs d'embryons.
Réduction
La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. L'estimation des nombres maximum d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique. La grande effiacité des réactifs utilisés et des techniques de reproduction permettent de diminuer drastiquement le nombre d'animaux utilisés pour la génération d'une lignée
Raffinement
La potentielle douleur liée à la procédure de transfert d'embryons est prise en charge par une injection d'analgésie, et fait l'objet d'un suivi étroit des animaux.
Choix des espèces
Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses,les males vasectomisés et les mâles reproducteurs, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.
Gestion de la production d’animaux expérimentaux de lignée NOD SCID
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Maintenir en animalerie la production d'une lignée de souris immunodéficientes, disponible pour d'autres projets : 545 souris NOD SCID vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun acte expérimental ne leur est infligé, la souffrance vient du phénotype lui-même. Leur système immunitaire génétiquement affaibli les rend vulnérables aux infections, elles peuvent développer un lymphome spontané qui limite leur vie à huit mois environ, un diabète chez certaines femelles, une perte progressive d'audition dès trois mois et des difficultés de cicatrisation. Une partie sera tuée dès qu'un point limite est atteint, les autres gardées vivantes pour la reproduction de la lignée ou versées à un projet déjà autorisé.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de maintenir la production d'une lignée immunodéficiente en animalerie avec un statut sanitaire stricte
Bénéfices attendus
Les animaux utilisés dans ce projet possèdent une particularité importante : ils ne réagissent pas contre certaines cellules étrangères qu’on leur greffe. Cela permet d’introduire des cellules provenant d’un autre animal, ou même de l’humain, sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour pouvoir étudier dans de bonnes conditions le devenir de ces cellules dans le corps. Les animaux seront gardés en vie pendant une période limitée, jusqu’à un maximum de 5 mois, car au-delà, ils peuvent développer une maladie naturelle à leur état fragile. Cette précaution est prise pour garantir leur bien-être, aussi bien pour les souris utilisées à des fins de reproduction que pour celles destinées à d’autres projets expérimentaux. Ce projet permettra de maintenir cette lignée fragile dans notre animalerie, afin qu’elle soit disponible pour des recherches futures, dans un autre cadre déjà autorisé.
Procédures
Les animaux ne subiront aucune intervention directe autre que celle liée à leur phénotype particulier. En effet, cette lignée est porteuse d’un phénotype dommageable, ce qui signifie qu’elle peut développer, avec l’âge, des troubles graves comme un lymphome thymique spontané. Pour éviter cela, les animaux sont utilisés sur une période 6 mois, avant l’apparition de ces signes, et suivis cliniquement chaque jour.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet sont très fragiles. Leur système de défense est génétiquement affaibli, ce qui les rend très vulnérables aux infections. Ils peuvent aussi développer spontanément une forme de cancer du système lymphatique (lymphome) à partir d’un certain âge, ce qui limite leur durée de vie à environ 8 mois. Chez certaines femelles, du diabète peut aussi survenir, ce qui peut réduire leur capacité à se reproduire. Certaines souris peuvent développer un faible niveau de cellules immunitaires fonctionnelles, ce qui peut affecter les résultats des études si cela n’est pas surveillé. Enfin, une perte progressive de l’audition dès l’âge de 3 mois, ainsi que des difficultés de cicatrisation en cas de blessure peuvent survenir. Toutes ces fragilités sont bien identifiées et seront surveillées de près.
Devenir
Certains animaux seront mis à mort lorsqu’un point limite est attaint, afin d’éviter toute dégradation de leur état de santé. D’autres animaux seront gardés en vie, soit pour être utilisés dans un projet expérimental déjà autorisé ainsi que pour assurer la reproduction et le maintien de la lignée dans l’animalerie. Ces décisions seront prises en fonction de l’état des animaux, de leur âge, et des objectifs de suivi dans les projets associés.
Remplacement
La lignée immunodéficiente est indispensable dans ce projet car aucun autre modèle murin ni aucune méthode in vitro ne permet de reproduire ses propriétés immunologiques. Ces souris sont dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, ce qui rend possible la greffe stable de cellules allogéniques ou xénogéniques (notamment humaines) sans rejet. Cette tolérance est une nous permettant l’étude des effets neurofonctionnels à moyen terme de cellules greffées dans notre région cérébrale d’intérêt. Le recours à un système in vitro ou à un autre modèle murin immunocompétent exigerait une immunosuppression pharmacologique, ce qui pourrait interférer avec les résultats que nous obtiendrons en affectant les fonctions neuronales, gliales et vasculaires. De plus, aucun modèle computationnel ou organoïde ne permettrait d’évaluer de manière fiable l’impact des cellules greffées sur l’organisme in vivo. Ainsi, la lignée immunodéficiente ne peut être remplacée dans ce projet, car elle est la seule à permettre une analyse intégrée, physiologiquement pertinente et immunologiquement stable des greffes cellulaires dans le cerveau vivant.
Réduction
La production est strictement adaptée aux besoins expérimentaux et à la fragilité de la lignée. Seuls les animaux nécessaires sont élevés, avec une planification par petites cohortes. Le nombre de reproducteurs est limité, et renouvelé régulièrement en raison de la courte durée de vie reproductive des femelles. Cette organisation permet d’éviter toute surproduction tout en assurant une disponibilité continue des animaux pour les projets autorisés.
Raffinement
Bien que le phénotype dommageable associé à cette lignée ne s’exprime pas durant la période expérimentale prévue, des mesures spécifiques de raffinement sont mises en œuvre pour anticiper toute expression subclinique et garantir le bien-être des animaux. Les souris sont hébergées en conditions barrière, dans des portoirs individuellement ventilés, sous un tatut sanitaire strict, afin de minimiser l’exposition à tout agent pathogène. Leur environnement est enrichi avec des matériaux de nidification, des cachettes et des objets à ronger, afin de réduire le stress chronique, facteur aggravant dans les lignées immunodéficientes. La densité d’animaux par cage est limitée : pour la reproduction, un maximum de deux femelles avec leur portée est autorisé. Ces conditions strictes sont indispensables pour garantir la survie, le bien-être et la validité scientifique des données obtenues chez ces animaux vulnérables. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, intégrant des grilles d’observation standardisées portant sur l’état du pelage, la respiration, le comportement spontané et le poids corporel. Des points limites sont définis a priori. Une euthanasie immédiate sans attendre de dégradation supplémentaire sera envisagée une fois un point limite atteint.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, à développement rapide, modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation d'un modèle murin est la seule approche permettant d’observer directement une corrélation entre les cellules qui nous intéresse et sa fonctionnalité. La souris est également est un modèle animal qui permet de disposer de lignées immunodéprimées, indispensables pour les séries d’expérimentation qui vont être effectuées. Celles-ci sont décrites dans une autre DAP Les souris seront mises en expérimentation après le sevrage, entre P21 et P25. La reproduction se fera entre 6 et 8 semaines d’âge, en restant attentif à l’éventuelle apparition de diabète chez les femelles, généralement observée entre 10 et 14 semaines.
Méthode de prélévement pour l’élevage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une biopsie de moins d'une seconde, pratiquée une fois dans la vie de l'animal : c'est tout ce que le protocole décrit des gestes infligés. 10 800 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, élevées et génotypées par une animalerie qui héberge une soixantaine de lignées et environ 300 couples reproducteurs. Le but tient à la seule gestion de l'élevage, trier les souris au bon génotype pour les projets du campus, et le porteur précise que la majorité de celles qui n'ont pas le génotype recherché seront tuées, les autres partant vers d'autres protocoles. Le résumé ne dit ni quel tissu est prélevé, ni si une anesthésie est pratiquée, ni comment on arrive à 10 800 souris, et la rubrique raffinement se limite à la température et à l'hygrométrie de l'animalerie.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire des souris génétiquement modifiées et d’effectuer les prélèvements (biopsies) ainsi que l’identification des animaux. Dans le cadre des projets de recherche, différents modèles de souris génétiquement modifiés sont utilisées pour des études portant sur l’infectiologie, l'immunologie, les maladies neuro dégénérative, la recherche sur le cancer. Une identification et un génotypage sont requis.
Bénéfices attendus
L'institut de recherche a des thématiques différentes telles que les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, inflammatoires, infectieuses, métaboliques ou encore la cancérologie La plateforme est une animalerie fournissant et utilisant des modèles in vivo. Nous hébergeons et produisons des souris génétiquement modifiées de modèles déjà existants. Nous comptons une soixantaine de lignées hébergées. En production moyenne nous hébergeons environ 300 couples Les modifications génétiques apportées aux animaux que nous produisons et/ou hébergeons sont contrôlées par génotypage. Le génotypage et l'identification permettent de sélectionner les animaux d'intérêts qui seront ensuite utilisés dans les projets scientifiques. La gestion de l'élevage par l'équipe d'animalerie permet une optimisation de la production qui ne dépent plus des équipes utilisatrices.
Procédures
Prélèvement par biopsie, une fois dans la vie de l’animal, moins d’une seconde
Impact sur les animaux
La contention des animaux peut générer un léger stress. Le prélèvement en lui-même peut induire une légère douleur et occasionner un léger saignement
Devenir
L'ensemble des animaux rentreront en utilisation pour les projets autorisés. Les souris ne présentant pas le génotype d'intérêt pourront être utilisés dans le cadre de formations par tutorat. La majorité des animaux n'ayant pas de génotype d'intérêt recherché seront mis à mort.
Remplacement
Certains projets de recherche sont réalisés in vitro. Les modèles murins ne sont utilisés qu'en dernier recours, pour les recherches exigeant un métabolisme complet.
Réduction
Le génotypage permet de sélectionner les animaux d’intérêts dans le cadre des projets développés sur le Campus. Dans le cadre de formation ou tutorat une partie des animaux de non intérêts sont utilisés. Le fait de gérer les élevages permet d’éviter la production inutile ou la surproduction d’animaux. Les utilisateurs doivent programmer leurs expérimentations et l’équipe d’élevage met en place la stratégie la plus opportune pour obtenir le nombre d’animaux demandés.
Raffinement
L'établissement est agréé les animaux sont hébergés avec un contrôle continu des températures (22°C +/- 2° C), également avec un contrôle d'hygrométrie 55% +/-15, un cycle de lumière 12/12 avec un accès ad libitum à la nourriture et l'eau de boisson. Les animaux bénéficient également d’enrichissements; Une surveillance quotidienne est effectuée journalière afin de vérifier l'état de santé des animaux.
Choix des espèces
Les équipes de recherche du campus ont des projets nécessitant l'utilisation de modèles murins. Les prélèvements (Biopsie) des souris génétiquement modifiées afin d'effectuer un génotypage permettent la sélection de lots stables. Pour l’élevage, les animaux utilisés sont des adultes de 8 semaines. Les animaux utilisés en recherche sont disponibles à partir de l’âge de 3 semaines après identification, prélèvement et génotypage.
Élevage des souris transgéniques nécessaires aux recherches portant sur les sarcomes osseux et le remodelage des tissus calcifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Cet élevage fait naître des souris génétiquement modifiées porteuses de défauts du squelette, pour alimenter des protocoles d'étude des tumeurs osseuses. 3 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, un prélèvement d'un millimètre de queue à quatre semaines servant à les génotyper. Certaines lignées naissent sans éruption dentaire et sont nourries de liquide toute leur vie, d'autres présentent un retard de croissance. Une partie des souris quitte l'élevage pour d'autres protocoles autorisés, les autres sont mises à mort passé douze mois quand elles ne se reproduisent plus, le porteur affirmant que la souris transgénique est l'"unique outil" disponible et qu'aucune technique alternative n'existe.
Objectifs
Le développement de nouveaux outils thérapeutiques nécessite une bonne connaissance des mécanismes impliquées dans la pathologie. L’objectif du projet est l’élevage de souris génétiquement modifiées qui montrent un défaut dans le développement ou maintien du système squelettique pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement des tumeurs osseuses et le remodelage des tissus calcifiés.
Bénéfices attendus
Le projet est basé sur l’élevage et la production des animaux jeunes ou adultes génétiquement modifiés associés à des défauts du système osseux. L’objectif est de mieux comprendre le remodelage des tissus calcifiés en l’absence de certains facteurs clés du métabolisme osseux. De même, ces animaux pourront être utilisés dans des protocoles expérimentaux ayant reçu une autorisation pour l’étude des sarcomes osseux et leur microenvironnement qui permettra de mieux comprendre le rôle de ces facteurs dans l’initiation et le développement de la maladie tumorale.
Procédures
Un prélèvement de 1mm de queue pour génotyper les souris à l’âge de 4 semaines est réalisé sous anesthésie volatile.
Impact sur les animaux
Difficultés de prise alimentaire par l’absence de dentition chez certains mutants, retard de croissance des jeunes souris.
Devenir
Sortie de l’élevage pour intégrer un protocole autorise par le MESR. Euthanasie des animaux trop âgés pour la reproduction (âge maximum de 12 mois) et ne pouvant pas intégrer un autre protocole autorise par le ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche.
Remplacement
Les souris transgéniques sont l’unique outil pour l’analyse in vivo des la fonction (perte ou sur expression) d’un gène. Aucune technique alternative n’est actuellement disponible.
Réduction
Les différentes colonies seront maintenues avec le minimum d’animaux pour permettre la viabilité des colonies. Afin d’éviter un nombre élevé d’animaux, les accouplements seront initiés seulement quand les animaux seront utilisés dans une procédure expérimentale ou quand un renouvellement des progéniteurs sera nécessaire. La production et nombre des animaux à utiliser par expérience reposera sur une analyse statistique. Des systèmes de veille bibliographique et d’alerte seront mis en place pour l’obtention des nouvelles données dans les domaines d’intérêt et éviter la répétition des études déjà publiées. A chaque expérience, nous échangerons avec nos collaborateurs afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et réduire la production des individus (ex : collecte de tous les organes).
Raffinement
Pour le bien être des souris, des frisottis en papier seront additionnés aux cages afin de permettre aux femelles gestantes de préparer les nids. Un enrichissement sous forme d’igloo en papier sera ajouté à chaque cage pour permettre aux souris de s’isoler. Un régime adapté aux besoins sera utilisé lors de la gestation et la lactation. Certaines mutations induisent une ostéopétrose et consécutivement une absence d’éruption dentaire. Une alimentation liquide adaptée sera mise à disposition aux animaux sans éruption dentaire dès le sevrage et tout au long de la vie de la souris. Une attention particulière sera apportée à tous les animaux mutants ostéoporotiques obtenus dans notre élevage afin de détecter et traiter au plus vite toute douleur qui pourrait apparaitre.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal qui reproduit de façon fidèle les maladies osseuses diagnostiquées chez l’être humain. Les lignées de souris transgéniques à élever sont déjà existantes. Animaux adultes sauf si besoin d’animaux jeunes pour un projet ayant reçu une autorisation du ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche.
Etude du rôle des substances neurochimiques dans l’activité des circuits neuronaux chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Comprendre comment les neuromodulateurs façonnent la faim, la peur ou le sommeil est l'objet déclaré de ce projet, qui prévoit d'utiliser 5 270 souris, dont 1 164 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 767 un niveau modéré et 2 339 un niveau léger. Après un prélèvement de queue pour génotypage, une partie des souris subit une ou deux chirurgies cérébrales sous anesthésie, jusqu'à trois heures, avec pose d'un dispositif d'enregistrement, puis vingt sessions de trois heures étalées sur six semaines. Certaines reçoivent de l'eau acidifiée pendant six semaines pour que la soif les motive à travailler pour de l'eau sucrée, d'autres un jet d'air aversif dans des tâches de mémoire de la peur, avec jusqu'à quarante injections. Le porteur prévoit de réutiliser 200 souris dans d'autres projets et de tuer les autres, en partie parce que leur modification génétique interdit de les replacer.
Objectifs
Le fait d'avoir sommeil, d'avoir faim, d'avoir peur ou d'être heureux a un impact sur notre expérience quotidienne et influence nos comportements et nos actions. Ces états internes se caractérisent par des signatures uniques d'activité dans le cerveau et sont directement liés à la libération de molécules chimiques, appelées neurotransmetteurs ou neuromodulateurs, permettant la transmission de signaux entre les neurones. À tout moment, des combinaisons distinctes de neuromodulateurs sont libérées dans chaque région du cerveau. Les changements dans l'équilibre des neuromodulateurs ont un impact puissant sur les configurations cérébrales qui sous-tendent les états internes et comportementaux. Alors que presque tous les troubles de l'humeur sont associés à un déséquilibre des neuromodulateurs, la plupart des stratégies thérapeutiques tentent de rétablir cet équilibre. Cependant, la manière dont les combinaisons de neuromodulateurs définissent des configurations cérébrales distinctes et façonnent les états internes reste inconnue. Il est important de noter que l'activité neuronale n'est pas seulement modulée par les neurotransmetteurs internes, mais aussi par les rythmes physiologiques provenant du corps, par exemple les rythmes respiratoires et cardiaques jouent un rôle crucial. L'acte de respirer, par des voies mécaniques et chimiques, influence l'activité neuronale dans diverses régions du cerveau. Ces rythmes physiologiques interagissent avec les systèmes mis en jeu par les neuromodulateurs, créant une interaction complexe qui façonne l’activité du cerveau. Dans ce projet, nous étudierons le rôle joué par les neuromodulateurs dans l’activité cérébrale et les états internes tout en tenant compte de l'influence des rythmes respiratoires et cardiaques, en utilisant des souris génétiquement modifiées qui nous permettront d’étudier des types de cellules cérébrales spécifiques.
Bénéfices attendus
Parmi toutes les maladies, les troubles anxieux et la dépression majeure sont les principales causes d'invalidité et imposent un fardeau et une souffrance énormes aux patients concernés. La compréhension des déterminants neuromodulatoires de l'activité dans les circuits limbiques est d'une importance fondamentale pour élucider les mécanismes sous-jacents à ces troubles. Ce projet pourrait permettre d'approfondir la compréhension de ces processus. Ce programme de recherche pourrait nous permettre de caractériser le rôle fonctionnel de la libération de substances neurochimiques dans des circuits cibles génétiquement définis et d'établir/élucider les principes de la neuromodulation combinatoire en tant que mécanisme majeur organisant l'activité neuronale et gérant l'interaction entre des régions cérébrales éloignées. Cette recherche devrait nous permettre de mieux comprendre les circuits des fonctions cérébrales, à la fois d'un point de vue fondamental et pour assurer une meilleure gestion des dysfonctionnements pathologiques qui existent chez l'homme. Cette compréhension manquante conduira à des aperçus cruciaux sur la mise en œuvre des circuits des états cérébraux. Elle permettra en outre de développer de nouveaux diagnostics en établissant un lien entre les changements dans la dynamique neuronale et l'altération du paysage neuromodulatoire, et suggérera des cibles potentielles pour de nouvelles approches thérapeutiques sous la forme de circuits neuronaux et de récepteurs cibles pour l'administration de médicaments ou pour une stimulation cérébrale profonde. Nous espérons que ces connaissances permettront de participer à la compréhension de la physiopathologie des troubles psychiatriques humains et ouvriront la voie à de nouvelles stratégies de traitement.
Procédures
Tous les souriceaux produits auront un prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique (une fois, vigile, inférieure à 1 min). Une partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réaliser une injection dans le cerveau (une fois, durée inférieure à 1h). Une autre partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réaliser une injection dans le cerveau et mettre en place un dispositif permettant ensuite d’enregistrer l’activité cérébrale (une fois, durée inférieure à 2h). Après une période de récupération minimale de 5 jours, les souris seront ensuite habituées pendant 10 jours maximum au dispositif d’enregistrement avec des sessions augmentant progressivement de quelques minutes à 120 minutes maximum. Pour une partie de ces souris une deuxième chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour pouvoir ensuite introduire des sondes d’enregistrements. Toutes ces souris participeront ensuite à un test comportemental couplé à un enregistrement cérébral pour étudier le lien entre le comportement de l’animal et l’enregistrement obtenu (20 sessions sur 6 semaines max avec 1 session par jour max, 3h max par session). Une autre partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réaliser une injection dans le cerveau et mettre en place un dispositif pour l’enregistrement de l’activité cérébrale (une fois, durée inférieure à 3h). Ils feront ensuite des tests comportementaux couplés à un enregistrement cérébral pour étudier le lien entre les enregistrements obtenus et le comportement exploratoire de l’animal ou l’apprentissage associatif (mémoire de la peur) ou encore le sommeil et la consolidation de la mémoire (20 sessions maximum réparties sur 6 semaines maximum avec 1 session par jour maximum, 3h maximum par session). Pendant les enregistrements tous les animaux pourront recevoir des injections de substances (40 injections max avec 2 injections max par session). 5 jours avant le début et pendant toute la durée des sessions d’enregistrement les animaux recevront de l’eau légèrement acidifiée (6 semaines max) pour obtenir une meilleure motivation pour la réalisation des tests. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire et une partie d’entre eux lors d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée inférieure à 10 minutes).
Impact sur les animaux
La biopsie de l'extrémité de la queue pour le génotypage entraînera une douleur brève et légère. Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie est associée à un risque de douleur et d'inconfort. L'anesthésie est associée à un risque d'hypothermie, de sécheresse oculaire et au risque de dépression cardio-respiratoire. Les souris peuvent être gênées par les implants, qui couvrent le sommet de la tête. Il existe un risque de perte du dispositif ou d'infection. Les animaux peuvent ressentir une légère douleur et une gêne lors des injections intrapéritonéales. Pour les expériences nécessitant une contention de la tête, les souris présentent de légères réactions de stress au cours des premières séances. Pour les expériences de conditionnement à la récompense, les souris reçoivent de l'eau légèrement acide quelques jours avant et pendant toute la durée des expériences afin d'assurer une motivation suffisante pour obtenir des récompenses en eau sucrée. En conséquence, elles peuvent ressentir une soif, et pourront présenter une légère perte de poids. Pour les expériences d'apprentissage par aversion, les souris sont exposées à un jet d'air ou à un léger stimulus aversif de faible intensité, qui sont considérés comme des facteurs de stress aigus. La réponse à ces stimuli fait l'objet de nos études. Il peut être nécessaire d'héberger les souris individuellement pour éviter la destruction des implants due aux interactions avec d'autres souris, ce qui entraîne un léger stress social.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure soit pour faire des prélèvements d’intérêt pour répondre à notre question scientifique soit parce qu’ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés en raison de leur modification génétique. Nous estimons que pour une partie des animaux il pourra y avoir une réutilisation dans d’autres projets, cela représentera un maximum de 200 souris.
Remplacement
Il n'y a pas d'autres alternatives à l'utilisation d'animaux pour ces expériences, car l'étude du rôle des neuromodulateurs et des interactions entre le cerveau et le corps dans les états internes nécessite des expériences in vivo chez l'animal éveillé et dans un cerveau intact. Contrairement aux cultures cellulaires ou aux travaux in vitro, qui offrent des environnements contrôlés mais très simplifiés, les expériences in vivo maintiennent l'interaction complexe entre les différentes régions du cerveau et les populations neuronales, reflétant ainsi la véritable complexité du traitement neuronal. En outre, les études in vivo permettent d'explorer des fonctions cognitives et des comportements d'ordre supérieur qui ne peuvent être reproduits dans des modèles cellulaires isolés. Ainsi, bien que les approches précédentes utilisant des cultures cellulaires ou des méthodologies in vitro aient fourni des informations précieuses sur les mécanismes cellulaires de base, elles ne permettent pas d'étudier le rôle des neuromodulateurs dans le façonnement des fonctions cérébrales et du comportement animal in vivo. Par conséquent, les expériences in vivo sur la souris restent essentielles pour faire progresser notre compréhension des circuits neuronaux et de leur modulation par les systèmes neuromodulateurs, au sein d'un organisme vivant interagissant avec son environnement et les différentes phases physiologiques (sommeil/éveil, motivation, comportement libre).
Réduction
Un maximum de 5 270 animaux sera utilisé dans le cadre de ce projet. Nous avons soigneusement réduit ce nombre au minimum nécessaire pour garantir que les résultats soient scientifiquement fiables. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée à partir d’un calcul de puissance, fondé sur les données de la littérature et nos études précédentes, afin d’obtenir une interprétation statistique solide tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous avons recours à des neurotechnologies de pointe qui permettent de recueillir un grand nombre de données par animal (par exemple, en combinant électrophysiologie et imagerie optique), ce qui réduit encore les effectifs nécessaires. Enfin, nous utilisons des souris mâles et femelles afin de valoriser l’ensemble des animaux produits lors de l’élevage des lignées transgéniques.
Raffinement
Toutes les procédures ont été conçues pour assurer le bien-être des animaux et réduire au maximum tout inconfort. Les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation, avec un enrichissement du milieu (abris, coton, bâtonnets en bois) et un accès libre à la nourriture et à l’eau. Leur état sera surveillé quotidiennement, et en cas d’anomalie, une intervention immédiate sera organisée avec le comité de bien-être animal de l’institut et le vétérinaire, afin de garantir une prise en charge rapide et adaptée. Des critères d’arrêt précis sont définis pour éviter toute souffrance inutile. Les animaux provenant d’éleveurs extérieurs bénéficieront d’une période d’adaptation d’au moins une semaine avant toute procédure, leur permettant de récupérer du transport et de retrouver un état physiologique stable. Le génotypage (nécessaire pour identifier les lignées transgéniques) sera réalisé sur de très jeunes souris, à l’aide d’un prélèvement minimal et d’un matériel désinfecté entre chaque animal. Les souriceaux seront replacés immédiatement avec leur mère, et leur état sera vérifié juste après puis à distance pour s’assurer de l’absence de saignement et d’un bon comportement maternel. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie complète et une gestion adaptée de la douleur sont systématiquement mises en place. Après l’opération, les souris sont surveillées de près et reçoivent des soins complémentaires si nécessaire. Avant toute expérience, les animaux sont progressivement habitués à la manipulation par l’expérimentateur, afin de réduire le stress lié au contact humain. Les protocoles ont été optimisés pour concilier bien-être animal et rigueur scientifique. Par exemple, au lieu d’une restriction alimentaire stricte, une eau légèrement acidifiée est proposée afin de maintenir la motivation des animaux pour les récompenses sucrées sans provoquer de déshydratation ni de malaise. Lors des apprentissages aversifs, l’intensité minimale du stimulus est toujours utilisée et ajustée pour obtenir le comportement recherché tout en limitant la contrainte au strict nécessaire.
Choix des espèces
Des souris adultes seront utilisées pour les procédures expérimentales. La souris est l’espèce la plus adaptée à ce type de recherche, car son comportement est bien connu et son organisation cérébrale présente de fortes similarités avec celle des autres mammifères. Cela permet d’étudier de manière fiable les mécanismes que nous cherchons à comprendre. Il existe chez la souris différentes lignées, dont certaines sont génétiquement modifiées pour permettre d’observer ou d’activer précisément certains groupes de cellules du cerveau. Ces outils sont indispensables pour répondre aux questions scientifiques du projet. Les interventions prévues ne peuvent être réalisées que sur des animaux entièrement développés, ce qui explique l’utilisation de souris adultes. Les jeunes souris nées à l’animalerie seront uniquement manipulées pour être identifiées par un petit tatouage sur la patte et pour être génotypées (un minuscule prélèvement au bout de la queue) vers l’âge d’une semaine. À cet âge précoce, la cicatrisation est rapide et ces gestes n’entraînent pas de gêne durable. Le génotypage précoce permet d’organiser l’élevage de manière efficace et d’utiliser de façon optimale le nombre total d’animaux produits.
Entretien, maintien et génotypage invasif d’une lignée de souris dystrophiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
La moitié des souris nées dans cet élevage rejoindront d'autres projets déjà autorisés, d'autres resteront pour entretenir la colonie, et celles qui ne portent pas le génotype recherché seront tuées avec les anciens reproducteurs. 2530 souris porteuses de la dystrophie musculaire de Duchenne sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger réduites à une biopsie de la queue entre 7 et 14 jours après la naissance. Les lignées développent, selon le porteur, des difficultés locomotrices, respiratoires et cardiaques plus ou moins marquées selon le modèle. Il chiffre le "besoin" à 1200 naissances pour 600 animaux exploitables, la moitié des souriceaux n'ayant pas le bon génotype, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit un "organisme entier".
Objectifs
Des souris à phénotype dommageable (souris dystrophiques) sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche. Les recherches ciblent le muscle squelettique et le cœur, et en particulier l’effet de thérapies sur la force musculaire et la cardiomyopathie dilatée induite par la dystrophie musculaire de Duchenne. Les lignées de souris dystrophiques sont essentielles pour pouvoir étudier la régénération musculaire et la fonction cardiaque en condition pathologique et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques. L’objectif est donc l'entretien et le maintien d'une lignée de souris dystrophiques qui permet l'obtention de 2 phénotypes d'interêts qui sont utilisées dans des projets de recherche.
Bénéfices attendus
La cardiomyopathie est une atteinte cardiaque responsable de la mortalité chez les patients atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne (la dystrophie la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant qui affecte l’ensemble des muscles du corps et qui touche un garçon sur 3500 nés). Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur la mise en place d'approches thérapeutiques pour la correction des atteintes musculaires squelettiques et de la fonction cardiaque dans les dystrophies musculaire chez l’homme, des maladies qui touchent le muscle et le coeur et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Une biopsie caudale pour l’identification génétique des animaux sera réalisée , ce qui pourra engenrer un léger stress de courte durée.
Impact sur les animaux
Les souris du modèle dystrophique modéré peuvent développer des signes d’anxiété, une faiblesse musculaire et un phénotype cardiaque chez les animaux âgés. Les souris du modèle dystrophique sévère développent un phénotype induisant des difficultés locomotrices, respiratoires et cardiaques à plus ou moins long terme. Une biopsie caudale pour l’identification génétique des animaux sera réalisée, ce qui pourra engendrer un léger stress et une douleur légère de courte durée.
Devenir
La moitié des animaux seront affectés à d’autres demandes de projets autorisés (utilisation continue). Un projet est déjà en cours, d’autres sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Des animaux seront maintenus en vie pour l'entretien de la colonie. Les animaux ne portant pas le génotype d’intérêt et les anciens reproducteurs seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant au développement des pathologies musculaires et notamment cardiaques. Un modèle animal est donc nécessaire comme modèle préclinique pour tester des approches thérapeutiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre de couple afin de ne pas générer d'excédent de stock. Afin de réduire le nombre d’animaux nous utilisons une seule lignée qui permet de générer les 2 modèles animaux. Le projet en cours nécessite 600 animaux dystrophiques soit 1200 naissances car la moitié des naissances n’ont pas le bon génotype. D’autres demandes d'autorisation de projet sont en cours de rédaction et nous devons garder suffisamment de reproducteurs pour maintenir la lignée. S'agissant d'un projet d'élevage, il n'y a pas d'analyse statistique, cependant, nous estimons à l’aide des données du logiciel de gestion des animaux que 2530 animaux seront utilisés dans le cadre de ce projet. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu. Basé sur les recommandations des éleveurs, les souris utilisées pour les accouplements auront entre 3 et 8 mois d'âge afin conserver une bonne productivité des accouplements. Si les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, venaient à s’interrompre, les accouplements seront arrêtés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux ne devraient pas développer de phénotype au cours de l’entretien de la lignée, si une déclaration précoce se présente, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.
Choix des espèces
Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire et cardiaque est la souris due à la facilité d'élevage, le coût relativement peu élevé ainsi que la disponibilité d'outils analytiques. Des animaux dystrophiques sont indispensables pour étudier le muscle et le coeur in vivo dans un système pathologique. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu. Basé sur les recommandations des éleveurs, les souris utilisées pour les accouplements auront entre 3 et 8 mois d'âge afin conserver une bonne productivité des accouplements. Ils seront génotypés entre 7 et 14 jours qui suivent la naissance afin de réaliser un génotypage précoce.
Elevage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Deux minutes de contention pour un tatouage et une biopsie de la queue, entre le septième et le douzième jour de vie : 485 souris nouveau-nées subissent cette procédure d'un niveau de souffrance léger, avec un risque d'hémorragie de la queue et de rejet par la mère. Elles naissent d'accouplements programmés tous les quatre mois, dans le seul but d'alimenter des projets sur la maladie d'Alzheimer avec des souris porteuses de la bonne mutation. Le porteur décrit cette lignée transgénique comme "nécessaire" aux études collaboratives et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier le vieillissement pathologique. Celles qui portent le génotype attendu partent en reproduction ou en expérimentation, les surnuméraires vont vers des projets sans exigence de génotype ou vers des formations, les autres sont tuées.
Objectifs
L’objectif du projet est d’assurer la reproduction des souris, de les élever et définir leur génotype dans le cadre de la gestion de projets scientifiques sur la maladie d’Alzheimer pour constituer des groupes de souris issues des croisements programmés. La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Aujourd’hui, aucun traitement n’est capable de prévenir efficacement la maladie qui est initiée plus de 20 ans avant les premiers symptômes. Ces projets cherchent à mieux comprendre les maladies, trouver de nouveaux outils pour les diagnostiquer ou les soigner, et tester de nouveaux traitements, en tenant compte du lien entre la santé des humains, des animaux et de l’environnement. Même si la recherche reste très active, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour évaluer ou prévenir le vieillissement pathologique Alzheimer versus le vieillissement physiologique. L'obtention de lignée de la souris génetiquement modifiée est essentiel pour induire la maladie d'Alzheimer et rechercher des traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu dans ce projet est de pouvoir gérer le nombre d’animaux nécessaires aux projets de recherche sur la maladie d’Alzheimer en fixant le nombre d’accouplements le plus juste pour l’obtention du nombre de souris souhaitées avec un génotype clairement identifié dans les études scientifiques collaboratives publiques. Surveiller les lignées de souris génétiquement modifiées permet de réduire les risques de changements imprévus dans leurs gènes et de garantir la qualité de leur élevage et de leur hébergement.
Procédures
Prélèvement sur animal vigile Tatouage et prélèvement pour génotypage : 1 seule procédure par animal n'excédant pas 2 minutes
Impact sur les animaux
La procédure d'identification et de génotypage consiste en deux actes successifs. Ces deux gestes induisent une douleur légère de courte durée. L'animal est maintenu en contention pendant ces deux actes ce qui est une source de stress. Celle-ci sera minimisée au maximum par l'expérience du zootechnicien réalisant les gestes. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : une légère hémorragie à l'extrémité de la queue ou le rejet des nouveau-nés par la mère.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront utilisés pour la reproduction et dans des projets de recherche sur la maladie d’Alzheimer. Les individus surnuméraires seront utilisés, lorsque possible, dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier ou pour la formation. Les autres seront euthanasiés conformément à la procédure décrite.
Remplacement
Cette lignée de souris transgéniques élevée dans l’animalerie est nécessaire pour répondre aux besoins des études collaboratives évaluées scientifiquement. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour étudier directement chez l’animal (in vivo) les mécanismes liés au vieillissement normal ou pathologique, comme dans la maladie d’Alzheimer, afin d’identifier de nouveaux élements utiles pour le diagnostic ou le traitement, et pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
La stratégie d'accouplement envisagée repose sur les études collaboratives publiques, donc cela évite des accouplements en continu et limite la production d'animaux surnuméraires. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet (environ 1/3). Toutes les souris sont utilisées dans les projets pour comparer les deux phénotypes. Le nombre d’animaux prévu dans cette DAP tient compte du fait que, la première année, deux mâles seront accouplés avec quatre femelles, puis, de la deuxième à la cinquième année, un mâle sera accouplé avec deux femelles. Le nombre moyen de petits est de 7/portée pour cette lignée. Sur une année, on peut compter environ 36 à 40 femelles accouplées sachant que 2 mâles et 4 femelles viendront d'une autre animalerie au début du projet. Les accouplements seront programmés tous les 4 mois pour avoir des souris dans les projets expérimentaux et renouveler les couples reproducteurs. Pour éviter les changements imprévus dans les gènes, les couples reproducteurs sont bien gérés et de nouveaux males et femelles seront introduits au bout des 2 ans et demi.
Raffinement
Des points limites précoces sont mis en place. De plus, les actes d'identification et de prélèvement pour génotypage sont réalisés par du personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par des agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et biopsies sont réalisées avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des règles d'asepsie établies dans la plateforme Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d'expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveaux-nés sont remis en présence de leur mère. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Les souris incluses dans cette procédure (âge max 6 mois) n’expriment pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles de souris transgéniques qui sont largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris sont des espèces de choix pour les projets et permettent d'obtenir aisément des lignées génétiquement altérées par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies bien caractérisées. La très grande majorité des animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours. A cet âge, les animaux sont aisément manipulables, le cartilage est souple et les groupes sociaux constitués sont stables. Nous éviterons autant que possible les biopsies sur animal adulte.
Identification de la cellule d’origine des méningiomes à l’aide de modèles de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à l'issue pour prélèvements, ou parce que leur modification génétique interdit toute réutilisation et tout replacement, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un fragment de tissu est prélevé sur chaque souriceau vigile pour établir son génotype, et une partie des animaux reçoit pendant un à cinq jours une molécule activant une mutation. Le porteur indique que les tumeurs cérébrales attendues peuvent entraîner un déficit moteur et des crises d'épilepsie, et que l'administration de la molécule expose les mères à la perte de leurs petits. Les souris sont suivies de la naissance jusqu'à douze mois, le temps que les méningiomes apparaissent, et le porteur affirme que le modèle mammifère est le "seul moyen" d'identifier la cellule d'origine de ces tumeurs.
Objectifs
Les méningiomes se développent dans les méninges, les trois membranes qui entourent le cerveau et la moelle épinière. Ils représentent les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central de l’adulte. Bien que la majorité des méningiomes puisse être traitée par la chirurgie, une fraction non négligeable est soit inaccessible à la chirurgie, soit présente une histoire naturelle plus proche des cancers, marquée par une agressivité clinique et histologique. Pour ces tumeurs, aucune alternative à la chirurgie n’existe à l’heure actuelle. Le présent projet propose la création de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées de méningiomes en vue d’une meilleure compréhension de l’origine des méningiomes bénins ou malins.
Bénéfices attendus
En permettant l’identification de la cellule d’origine des méningiomes, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la tumorigenèse méningée bénigne et maligne mais également contribuer à une meilleure connaissance de l’anatomie des méninges. Par ailleurs, si les résultats s’avèrent concluants cela pourrait permettre d’utiliser ces nouveaux modèles animaux plus représentatifs de la maladie dans de futures études pré-cliniques. Ceci permettant donc d’obtenir une meilleure translation des résultats obtenus lors d’évaluation de nouvelles thérapies à ce que l’on pourrait attendre chez l’humain. A plus long terme, ces connaissances pourraient permettre de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de méningiomes.
Procédures
Afin de connaitre leur patrimoine génétique un prélèvement d’un petit fragment de tissu sera prélevé chez tous les souriceaux (durée inférieure à 1 minute, une fois, animal vigile). Une molécule sera administrée à une partie des animaux vigiles, pour activer une mutation génétique d’intérêt (1 fois par jour pendant 1 à 5 jours maximum, durée inférieure à 1 minute par administration). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’administration de la molécule pour activer la mutation génétique génèrera une brève et légère douleur au point d’injection, ou un inconfort lors de l’administration orale, et un risque de perte des petits pour les mères concernées. Si les animaux génétiquement modifiés générés et dont la mutation aura été induite par injection d’une molécule développent bien des tumeurs cérébrales, leur apparition pourra engendrer un possible déficit moteur, et, ou, de possibles crise d’épilepsie. Le prélèvement de tissu pour connaitre le patrimoine génétique des animaux induira une brève et légère douleur et un risque de léger saignement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements d’intérêt pour répondre à notre question scientifique, ou parce qu’ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés permettent l'obtention de méningiomes. Ces modèles ont toutefois des limites notamment leur inadéquation en pré-clinique pour des études thérapeutiques et l’impossibilité d’étudier la cellule d’origine des tumeurs. Le modèle animal mammifère est le seul moyen de déterminer avec précision la capacité de chaque population cellulaire méningée à initier ou promouvoir la formation des méningiomes en raison de l’existence de souris génétiquement modifiées générées spécifiquement pour étudier ces populations. La souris reste donc l'espèce la plus appropriée pour cette étude.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au maximum (900 animaux pour l’ensemble du projet) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Nous avons réduit le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir nos animaux génétiquement modifiés d’intérêt au strict minimum et nous piloterons notre élevage de manière raisonnée de façon à ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaires pour nos lots expérimentaux. Afin d'assurer la fiabilité statistique et limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif sur la base de travaux antérieurs et nous analyserons les résultats obtenus à l’aide des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée avant toute entrée en procédure. Un enrichissement de leur environnement leur sera mis à disposition dans les cages (carré de coton pour nidifier et bâtonnet de bois à ronger au minimum). Ils seront observés quotidiennement et en cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les injections pour induire la mutation génétique seront limitées au strict nécessaire, et une vérification de la zone d’injection sera assurée avant chaque nouvelle injection. Nous privilégierons la voie d’administration induisant le moins d’effets secondaires possible dès que cela sera possible. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un geste rapide et parfaitement maitrisé réalisé dans un endroit calme et dédié. Les souriceaux sont replacés avec leur mère et le reste de la portée rapidement, puis une surveillance est assurée immédiatement et environ 30 minutes après pour vérifier l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère. Un suivi spécifique sera réalisé pour les animaux présentant un phénotype induit attendu après injection, notamment une surveillance du poids hebdomadaire en cas de signes de difficultés motrices et une surveillance quotidienne de leurs capacités à s’alimenter et de la présence de signes de souffrance physique et d’inconfort (dépilation, poil ébouriffé).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu, son génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines, il existe déjà des modèles de méningiomes chez la souris, l’existence de ces modèles de méningiomes déjà publiés sera un avantage crucial pour comparer les éventuels nouvelles manifestations cliniques obtenues dans ce projet avec les connaissances de référence sur les modèles murins déjà décrits. Les animaux seront utilisés de la naissance à l'âge de 12 mois en raison de la lenteur d’évolution et d’apparition des tumeurs. Le choix des moments d’activation de la mutation génétique se base sur la chronologie du développement de la méninge chez la souris et l’apparition des différentes populations cellulaires. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux s’effectuera à l’âge de 7 à 10 jours afin de profiter de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre très tôt leur modification génétique.
Prélèvement invasif pour la caractérisation génétique de souris de lignées génétiquement modifiées nécessaires pour l’étude de cavernomes et méningiomes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Nées dans un élevage de lignées génétiquement modifiées destinées à créer des modèles de méningiomes et de cavernomes, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À sept à dix jours, chaque souriceau subit vigile l'ablation de l'extrémité de la queue pour établir son génotype, geste de quelques secondes qui provoque une douleur brève et peut saigner, parfois suivi d'un second prélèvement à l'oreille à l'âge adulte. Le porteur revendique un croisement entre homozygotes afin de limiter le nombre d'animaux qu'il ne pourrait pas utiliser. Une partie des souris part ensuite vers d'autres projets de l'équipe, une autre est cédée à d'autres équipes, le reste est tué.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser des prélèvements invasifs pour connaitre le patrimoine génétique des souris génétiquement modifiées produites qui seront ensuite utilisées pour nos projets scientifiques. Ces projets ont notamment pour objectif de créer des nouveaux modèles souris génétiquement modifiés de de méningiomes. L’un des projets, déjà accepté, a pour objectif de déterminer le rôle du micro-environnement tumoral dans les méningiomes de Grade 2 et 3, de l’OMS, caractérisés par un taux de récidive et de mortalités associés plus élevés, et le second, en cours d’évaluation, a pour objectif de déterminer la cellule d’origine des méningiomes en fonction de leur agressivité histologique. L’objectif de ce deux projets est in fine de mieux comprendre ces tumeurs, qui constituent les plus fréquentes du système nerveux de l’adulte, afin de développer de nouveaux traitements. Ces projets ont également pour objectif de développer de nouveaux modèles de cavernomes, une malformation vasculaire cérébrale touchant 0.5 pourcent de la population générale qui peut être à l’origine de crises d’épilepsie et handicaps neurologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de connaitre les modifications génétiques des animaux produits afin de générer des souris génétiquement modifiées pour des lignées spécifiques d’intérêt qui seront ensuite utilisées soit pour l’obtention de modèles animaux de cavernomes ou méningiomes, soit en utilisation continue dans nos projets de recherche en cours ou à venir. Ces modèles permettront de mieux comprendre la tumorigenèse de ces deux lésions. De plus, le développement de ces modèles pourrait permettre d’avoir des modèles animaux plus représentatifs de la maladie dans de futures études pré-cliniques, ceci permettant de favoriser la translation des résultats obtenus chez l’humain. A plus long terme, ces connaissances pourraient permettre de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
Afin d’identifier leur patrimoine génétique une partie des souriceaux produits dans le cadre de notre élevage de souris génétiquement modifiées aura un petit prélèvement de l’extrémité de la queue (une fois, vigile, durée quelques secondes). Rarement un re-prélèvement à l’oreille (1 seule fois, moins d’une minute) pourrait avoir lieu sur un animal adulte vigile si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue (ou de l'oreille) sera associé à une légère et brève douleur. Il existe également un risque de saignement suite au prélèvement.
Devenir
Une partie des animaux seront transférés en utilisation continue dans nos projets en cours ou à venir pour être analysés afin de répondre à la question scientifique du projet, les autres seront proposés en dons à d’autres équipes ou euthanasiés.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro ou in silico de cavernomes et de méningiomes permettant de répondre aux questions scientifiques posées par nos projets, ce qui justifie l’utilisation de modèles vivants. Par ailleurs nos projets actuels reposent sur l’étude des interactions entre le micro-environnement méningé et les méningiomes d’un côté et l’interface neuro-vasculaire cérébrale et les cavernomes de l’autre, rendant nécessaire l’étude de ces interactions chez un animal vivant puisqu’à ce jour aucun autre modèle ne permet de représenter la complexité de ces interactions.
Réduction
Ce projet nécessitera au maximum 600 animaux. Nous piloterons au plus près la production des animaux destinés à l’entretien des lignées afin d’en diminuer le nombre et d’assurer une production minimale d’animaux pour le maintien des lignées et nos lots expérimentaux. Nous privilégions un schéma d’accouplement entre homozygote afin d’obtenir un maximum d’animaux porteur des génotypes d’intérêt et limiter au maximum les animaux qui ne pourraient pas être utilisés dans nos projets de recherche. Les animaux destinés à entrer dans nos autres projets en cours ou à venir entreront dans des groupes pour lesquels nous auront définis les effectifs à partir de notre expérience et réduisant ce nombre au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le présent projet étant dédié uniquement au prélèvement pour génotypage des animaux aucun test statistique ne sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement composé d’un carré de coton et d’un bâtonnet de bois à ronger en routine complétés d’une maisonnette pour les cages d’élevage. Ils sont observés quotidiennement. En cas d'anomalie, celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer la meilleure prise en charge des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Le geste de biopsie est rapide (moins d’une minute), parfaitement maitrisé et sera de la plus petite taille possible. Il sera réalisé sur de jeunes animaux permettant de favoriser une cicatrisation rapide. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. Ils sont surveillés immédiatement puis environ 30 minutes après pour s’assurer de l’absence de saignement et de la bonne prise en charge par la mère. Cet acte est pratiqué au calme dans une pièce dédiée. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination croisée. Nous privilégierons un schéma de croisement limitant les besoins de prélèvement invasifs pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu, son génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines. Différentes souches de souris génétiquement modifiées nécessaires à l’établissement des modèles désirés dans ce projet existent déjà et présentent donc un réel intérêt dans le cadre de notre projet. De plus des modèles de méningiomes et cavernomes existent déjà, mais ne reproduisent pas encore fidèlement et parfaitement les lésions retrouvées chez l’humain, ce qui justifie la réalisation de nouveaux modèles à visée de compréhension de la pathologie humaine et de prédiction de la possible efficacité de futurs traitements. Les anciens modèles nous permettront néanmoins de comparer les éventuels nouveaux phénotypes obtenus à partir de nos nouveaux modèles avec les phénotypes de référence déjà observés. Les animaux auront un prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre leur modification génétique très tôt.
Impact du neurodéveloppement dans la maladie de Huntington chez un modèle murin MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des injections intracérébrales sont pratiquées sur les embryons, par chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sur les femelles gestantes anesthésiées, et le liquide céphalorachidien est prélevé sous anesthésie avant mise à mort. 6 150 souris vont être utilisées, dont 120 opérées sans réveil, 3 790 au niveau de souffrance léger et 2 240 au niveau modéré, avec deux séries de cinq tests comportementaux à trois et six mois, dont une privation de nourriture de vingt-quatre heures. Le porteur indique que la mutation de la maladie de Huntington peut provoquer des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de douze mois, et prévoit de tuer les souris entre six et huit mois, avant l'apparition de ce phénotype. La mise à mort sert à récupérer les tissus et à prélever les embryons, ou vient de ce que les animaux génétiquement modifiés ne peuvent être ni réutilisés ni replacés.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie génétique incurable causée par une mutation dominante, si un parent porte une version de la mutation il sera atteint et la transmission à sa descendance sera de 50 pour cent. Cette mutation entraîne le dysfonctionnement et la dégénérescence de sous-populations neuronales. Plus spécifiquement, plusieurs étapes du développement cortical sont modifiées. Cependant, les mécanismes physiopathologiques développementaux observés dans la maladie de Huntington, restent méconnus. En particulier, comment des modifications précoces auront des conséquences sur la dégénérescence du cerveau. Dans ce projet, nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement et du cortex adulte, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place pour pallier aux effets délétères de la mutation. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces et d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer cette maladie neurodégénérative. MODIFICATION : L’étude de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans le modèle de la maladie implique une modification du projet initial pour injection de traceur sans ajout d’animaux.
Bénéfices attendus
L’étude des mécanismes sous tendant le développement de la maladie de Huntington permettront à long terme de mettre en évidence des biomarqueurs qui représentent les différents stades d’évolution de la maladie. Après identification de ces différents stades, l’objectif sera de développer des cibles thérapeutiques adaptées afin de retarder ou limiter les symptômes associés à cette pathologie.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué, rapidement et une seule fois sur chaque animal vigile (moins d'une minute par animal). Nous réaliserons des injections de produits pharmacologiques ou de vecteurs viraux, dans des zones spécifiques du cerveau des embryons en intra utérin. Ces injections nécessitent une chirurgie sous anesthésie générale des femelles gestantes (30-45 minutes, 1 fois). Chaque embryon reçoit une injection intracérébrale. Les animaux impliqués dans les analyses comportementales réaliseront 2 séries (l’une à 3 mois, la deuxième à 6 mois) de 5 tests comportementaux vigiles sur une période d’un mois. Lors du test de privation de nourriture les animaux seront mis à jeun sur une période de 24 heures. Le prélèvement du liquide céphalorachidien implique une chirurgie sous anesthésie générale, une seule fois pour chaque animal pendant 5 minutes maximum. Pour étudier la perméabilité de la barrière entre le système nerveux et le système sanguin une partie des animaux recevra une injection d’une molécule fluorescente (une seule fois, vigile, durée inférieure à 1 minute) puis seront euthanasiés au maximum 2 heures après. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire appropriée, efficace et reproductible.
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour génotypage est réalisé sur animaux vigiles. Cet acte peut générer une légère douleur chez l’animal. L’acte d’injection pratiqué sous anesthésie peut générer de la douleur lors de la chirurgie et en post opératoire pendant quelques jours. Il y a un risque lors de l’anesthésie (dépression cardiorespiratoire, hypothermie), ainsi qu’un risque infectieux et hémorragique. Le prélèvement de liquide céphalorachidien réalisé sous anesthésie sera suivi d'une euthanasie, il n'y aura donc pas de douleurs post-opératoires associées. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Le test de suppression de nourriture peut également induire un état de stress et de fatigue chez les animaux. Ce test nécessite une privation de nourriture pendant vingt-quatre heures et met en évidence une activité de type antidépressive. L’injection d’une molécule pour évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique sera associée à une légère et brève douleur au point d’injection, qui pourra être suivie d’un inconfort de courte durée. La mutation génétique portée par les animaux des 2 lignées peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois (phénotype dommageable) : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem, prélever des embryons, ou parce qu'il ne sera pas possible de les réutiliser ou replacer du fait de leur modification génétique.
Remplacement
L’étude du cerveau en développement nécessite le recours à un modèle animal car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec un modèle de mammifère qui permet de suivre l’évolution du cerveau tout au long du développement et de la vie de l’animal. Le développement cérébral et la génétique de la souris présentent des similarités avec ceux de l’Homme. Ces éléments font de la souris un modèle indispensable pour notre étude. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. Pour la totalité du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 6150 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficient d’eau et de nourriture adaptée à leur stade physiologique à volonté et sont observés quotidiennement. Les animaux seront euthanasiés à 6-8 mois, avant apparition du phénotype dommageable, excepté pour les quelques animaux gardés jusqu’à 12 mois pour certaines procédures, qui seront particulièrement surveillés pour détecter des difficultés locomotrices et une prostration, 2 signes caractéristiques liés à la mutation. Nous réaliserons des accouplements avec des souris non génétiquement modifiées afin d’éviter toute dérive génétique. La biopsie de queue pour le génotypage sera réalisée sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et limitée au strict minimum. Le geste est rapide, parfaitement maitrisé, et réalisé dans un endroit dédié au calme. Une surveillance adaptée du souriceau est mise en place après le geste. Cette technique de prélèvement permet d’obtenir une quantité suffisante d’ADN pour le génotypage sans risque d’induire des effets indésirables majeurs pour l’animal. En effet sur un animal si jeune il ne serait pas possible d’obtenir la quantité de poils suffisante, un prélèvement de sang pourrait induire un choc hypovolémique et la biopsie d’oreille n’est pas possible avant 2 semaines du fait de la petite taille des oreilles. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Afin d’améliorer le bien-être de la mère dans les cages post chirurgie ajout d’une maison, d’un nid en coton et d’une nourriture enrichie (hydrogel, nourriture facile d’accès). Les chirurgies sont réalisées le matin afin d’observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires. Une liste d’observation post opératoire sera remplie. Après les chirurgies, les animaux seront observés (infections, mauvaise cicatrisation, prostration ou d’agitation et perte de poids anormaux) 2 fois par jour par l’équipe, et chaque jour par l’animalerie. Une grille de scoring de la douleur sera utilisée. Les nouveaux nés post chirurgie seront suivis durant les premiers stades de vie pour s’assurer que la modification induite par la chirurgie n’entraine pas de modification développementale dommageable. Une grille de score clinique sera utilisée dès la naissance. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur.
Choix des espèces
Il n’existe pas d’autre méthode expérimentale n’impliquant pas d’animaux vivants et permettant d'étudier le développement et la complexité du cerveau. Ces analyses nécessitent l'utilisation de souris : le comportement des neurones diffère selon leur environnement, ils adoptent un comportement migratoire in vivo et de croissance neuritique en culture; l'organisation laminaire du cortex (zone spécifique du cerveau), et les connexions neuronales qui y sont formées ne peuvent être reproduits en culture; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux corticaux. La souris est un modèle de choix pour la transgénèse et les organismes génétiquement modifiés et nous avons à disposition plusieurs modèles murins de la maladie de Huntington. Nos modèles de souris ont été décrits comme reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet étant de suivre l’impact des modifications ayant lieu au stade embryonnaire sur les stades tardifs, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : chez l’embryon (jour de gestation 14 et 16) pour observer l’effet direct de la modification pendant l’établissement des couches du cortex cérébral, à un stade juvénile pour étudier la continuité du développement post-natal ; particulièrement à l’âge de 30 jours et à l’âge de 12 mois pour analyser la perméabilité de la barrière entre le sang et le liquide céphalorachidien; et à 3, 6, 8 et 12 mois pour évaluer les conséquences au stades adultes de la modification embryonnaire, en comparant le phénotype des souris traitées à celui des souris modèles de la maladie. Nous utiliserons des animaux reproducteurs adultes afin de générer les animaux nécessaires pour nos procédures. Les animaux générés seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours.
Rôle de mutations dans l’obtention d’un modèle chez la souris de la maladie vasculaire cérébrale appelée Moyamoya. MODIFICATION
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
476 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, avec un prélèvement à l'extrémité de la queue dès l'âge de 7 à 10 jours puis un à trois prélèvements de sang à la veine faciale sur animal conscient, et des analyses réparties sur 1, 2, 4 et 6 mois. 440 d'entre elles relèvent du niveau de souffrance sévère. Les atteintes annoncées se limitent pourtant à une perte de poids possible, des tremblements ou des difficultés de locomotion chez les souris qui développent la maladie. L'enjeu déclaré est de savoir si une ou deux mutations suffisent à reproduire l'angiopathie de Moyamoya, les approches médicamenteuses chez les patients n'étant évoquées qu'à plus long terme.
Objectifs
L’angiopathie de Moyamoya (MMA) est une maladie rare des vaisseaux du cerveau. Cette maladie se définit par une diminution progressive du diamètre des gros vaisseaux qui apportent le sang au cerveau (artères localisées à la base du cerveau) qui peut atteindre l’occlusion (c'est-à-dire que le vaisseau est totalement obstrué) et qui provoque un manque d’oxygène dans le cerveau. Le MMA se caractérise aussi par la présence d’un réseau de petits vaisseaux fins et anormaux à la base du cerveau, qui se sont probablement formés pour compenser le manque d’oxygène cérébral entrainé par l’occlusion des artères cérébrales atteintes d’anomalie de MMA. Les patients MMA peuvent avoir des accidents vasculaires cérébraux. Les mécanismes de développement de la maladie sont encore largement inconnus aujourd’hui et aucun modèle animal n’existe. Une vingtaine de gènes ont déjà été identifiés comme responsables du MMA chez l’homme. L’objectif de ce projet est de définir si des souris porteuses d’une ou de deux mutations dans un ou deux gènes déjà identifiés chez des patients MMA pourraient être un modèle animal pertinent de la maladie, c'est-à-dire que les animaux reproduiraient les anomalies vasculaires de MMA. Nous caractériserons les vaisseaux du cerveau et de la rétine chez les souris mutées dans un gène responsable du MMA chez l’homme. Cette analyse sera réalisée au cours du temps chez les animaux de 1 à 6 mois afin de déceler une anomalie vasculaire de manière précoce et de suivre son évolution dans le temps. Dans le cas où aucune anomalie vasculaire cérébrale ne serait décelée chez ces souris, elles seront croisées avec les souris mutées dans un autre gène responsable du Moyamoya chez l’homme. Cette expérience permettra alors de tester l’hypothèse de l’implication de deux gènes mutés co-responsables du développement de la maladie. Une modification du projet est nécessaire suite à un changement d’établissement utilisateur impliquant la modification de certaines des techniques utilisées, sans nécessité d’augmenter le nombre d’animaux initialement autorisé.
Bénéfices attendus
Le MMA affecte entre 1 personne sur 30000 (Asie) et 1 personne sur 300000 (Europe). Les mécanismes responsables du développement de la maladie sont largement inconnus aujourd’hui. Il n’existe aucun modèle animal de MMA. L’obtention d’un modèle de MMA chez la souris permettrait tout d’abord d’étudier comment se développent des lésions MMA au niveau des vaisseaux du cerveau en suivant leur évolution au cours du temps mais également de mieux comprendre les mécanismes responsables du développement de la maladie. Il est par exemple important de comprendre si une mutation dans un gène suffit à déclencher la maladie ou si deux gènes mutés sont nécessaires pour entrainer le développement du Moyamoya. Ce modèle pourrait ensuite être utilisé pour évaluer l’efficacité de nouvelles pistes thérapeutiques. A plus long terme, comprendre comment se développent les lésions des artères du cerveau chez les patients MMA et le recours à ce modèle préclinique pourraient permettre d’envisager des approches médicamenteuses chez les patients pour limiter voire stopper le développement de la maladie.
Procédures
Afin de connaitre leur patrimoine génétique tous les souriceaux produits auront un petit prélèvement de l’extrémité de la queue (durée inférieure à 1 minute, une fois, animal vigile). Les animaux du projet seront analysés à 1, 2, 4 et 6 mois. Un à 3 prélèvements sanguins sur animal vigile (c’est-à-dire conscient, en éveil) seront réalisés entre l’âge de 1 et 6 mois, au niveau de la veine faciale. Ce prélèvement est rapide (manipulation totale de 3 minutes maximum par animal). Un petit groupe de souris recevra après l’anesthésie une injection d’un marqueur fluorescent de l’intérieur des vaisseaux. A la fin de l’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Si la maladie de moyamoya se développe, une perte de poids est possible chez les animaux atteints, qui pourraient aussi présenter des troubles du comportement tels que des tremblements ou des problèmes de locomotion. La biopsie de l’extrémité de la queue sera associée à une légère et brève douleur et présentera un risque de léger saignement. Les prélèvements sanguins génèreront une légère et brève douleur au point de piqure et pourront induire un stress de courte durée lié à la manipulation. Ces prélèvements peuvent entrainer un risque léger de saignement persistant et le développement éventuel d’un hématome dans la zone du prélèvement.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié par une méthode réglementaire à l’issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem d’intérêt pour répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Ce projet consiste à étudier les liens potentiels existants entre la présence de mutations dans certains gènes et le développement de la maladie cérébro-vasculaire de MMA. Il requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet et des vaisseaux sanguins dans le cerveau dans un environnement physiologique normal. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo, c’est à dire chez des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux total nécessaire a été prévu pour être limité au maximum (476 maximum). Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs statistiques, issus de résultats précédents. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le projet, la caractérisation des vaisseaux du cerveau et de la rétine sera réalisée en priorité dans les groupes d'animaux âgés de 1 mois et 6 mois. Si aucune anomalie vasculaire n’est observée, les autres groupes ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. L’enrichissement de chaque cage est systématique au minimum un carré de coton pour la nidification et un bâtonnet de bois à ronger.Le prélèvement d’un petit morceau de la queue pour génotypage sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un prélèvement rapide, parfaitement maitrisé et réalisé dans un endroit calme dédié. Les souriceaux sont remis rapidement avec leur mère et le reste de la portée, et l’on vérifie l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère immédiatement puis environ 30 minutes après le prélèvement. Certaines injections seront réalisées sous anesthésie générale et locale pour réduire le stress associé au geste. L’euthanasie médicamenteuse des animaux est réalisée après leur sédation ou leur anesthésie générale pour éviter tout stress. Tous les animaux inclus dans ce projet sont observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer une prise en charge optimale de l’animal. Ils feront également l’objet d’un examen détaillé hebdomadaire par une personne responsable du projet. L’aspect général (qualité du pelage, absence de larmoiement des yeux ...), le comportement de l’animal (par exemple déplacement, convulsions) et le poids seront analysés, afin de déceler au plus tôt un éventuel état de souffrance d’un animal (suivi en fonction de l’âge). Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux
Choix des espèces
Les vaisseaux du cerveau chez la souris sont très proches de ceux trouvés dans le cerveau humain. Par ailleurs, différentes lignées de souris mutées dans l’un des gènes responsables du moyamoya chez l’homme sont disponibles. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre très tôt leurs modifications génétiques. Les animaux seront utilisés à différents âges, à 1 mois, 2, 4 et 6 mois pour caractériser les vaisseaux cérébraux et rétiniens de façon précoce et suivre leur évolution au cours du temps. Nous couvrons ainsi la période d’apparition du Moyamoya chez l’homme.
Demande d’autorisation générique pour la réalisation de prélèvements invasifs à des fins d’identification de poissons zèbre génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Modifiés génétiquement, mais sans phénotype dommageable déclaré, des poissons zèbres sont triés pour constituer des groupes reproducteurs. 18 000 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit, sous anesthésie et analgésie, le prélèvement de 10 % de sa nageoire caudale, geste qui lèse des terminaisons nerveuses et dont le porteur attend un retour à une nage normale en cinq minutes. 16 200 poissons resteront en vie comme reproducteurs et 1 800 seront tués faute de porter les caractéristiques génétiques recherchées, leurs embryons étant ensuite étudiés avant cinq jours de développement, stade auquel la réglementation sur l'expérimentation animale ne s'applique pas.
Objectifs
Ce projet vise à identifier certains poissons zèbre porteurs de caractéristiques génétiques spécifiques, sans qu’ils présentent de phénotypes dommageables. L’objectif est de former des groupes de poissons reproducteurs, capables de produire régulièrement des embryons, en fonction des besoins des chercheurs. Les études porteront ensuite sur les toutes premières étapes du développement des embryons (avant 5 jours). À ce stade, la loi ne considère pas ces recherches comme de l’expérimentation animale. Pour maintenir les lignées de poissons utiles à ces recherches, il est indispensable de prélever fragment de leur nageoire caudale, qui nous permettra de repérer les animaux d’intérêts.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d’optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement altérés qui seront utilisées comme reproducteurs pour la production d’embryons dont l’étude (réalisée avant 5 jours de développement) ne relève pas de la législation de l’expérimentation animale. La méthode de génotypage utilisée dans la présente procédure présente deux bénéfices majeurs : Premièrement elle est parfaitement fiable, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux et le nombre de manipulations de ceux-ci. Deuxièmement, elle est sans incidence sur le bien-être de l’animal, celui-ci reprenant un comportement de nage parfaitement normal dès les premières minutes suivant le réveil d’anesthésie.
Procédures
Un prélèvement par animal de 10% (~2 mm2) de la nageoire caudale sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié. L’ensemble de la procédure de prélèvement dure environ 5 minutes (2 min endormissement, 1 min prélèvement, 2 min réveil) et 5 minutes après le réveil les animaux présentent à nouveau un comportement de nage normal.
Impact sur les animaux
La biopsie entraîne la lésion de terminaisons nerveuses au niveau de la nageoire caudale. Les poissons ayant subi un prélèvement de nageoire doivent se réveiller rapidement (2 minutes) après la sortie de l’anesthésie et reprendre un comportement de nage normal au bout de 5 minutes. Dans le cas (extrêmement rare) d’un individu pour lequel la surveillance post-prélèvement indique un problème de réveil ou des altérations de la nage qui perdurent plus que 15 minutes, l’animal sera mis à mort par surdose d’anesthésique.
Devenir
Animaux gardés en vie pour l'utilisation continue en tant que reproducteurs (16200). Les animaux présentant des caractéristiques génétiques sans intérêt pour le travail expérimental ou le maintien des lignées seront mis à mort (1800).
Remplacement
Une alternative au génotypage par biopsie de nageoire adulte est le prélèvement de fragments de nageoire sur embryons. Celui-ci est réalisé entre 3 et 5 jours de développement et ne relève donc pas de la législation sur l’expérimentation animale. Cette approche de remplacement sera utilisée tant que possible, mais son utilisation reste limitée au vu de la petite quantité de matériel biologique et du temps limité (moins de 48h) disponible pour l’analyse.
Réduction
Les identifications seront adaptés et réduit aux mieux afin de répondre aux stricts besoins des projets de recherche sans surproduction. La procédure réalisée devra permettre l’identification de populations d’adultes reproducteurs permettant de i) répondre au besoin grégaire des animaux, ii) être sûr que chaque population compte aussi bien des mâles que des femelles, iii) avoir un nombre de reproducteurs suffisant pour la réalisation des expériences tout en permettant d’assurer des périodes de repos régulières aux reproducteurs.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour minimiser l’impact du prélèvement sur le bien-être des animaux : i) Les prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés, afin d’éviter tout stress associé à la manipulation. ii) L’anesthésie sera de courte durée pour assurer un réveil rapide (
Choix des espèces
Plus de 80% des gènes associés à des pathologies humaines sont retrouvés chez le poisson zèbre. Son utilisation est pertinente pour deux raisons : Premièrement, la transparence de ses embryons, qui permet par exemple de visualiser des altérations du système cardiovasculaire sur l’animal vivant. Cette transparence permet de réaliser des études sur un organisme vertébré proche de l’homme sans que celles-ci relèvent de la législation sur l’expérimentation animale tant qu’elles sont réalisées au cours des 5 premiers jours de développement. La fécondation du poisson zèbre a lieu de manière externe ce qui veut dire que les embryons peuvent être produits par simple accouplement naturel d’adultes reproducteurs dont l’identification est l’objet de la présente demande. Le second avantage du poisson zèbre est la possibilité de réaliser des études génétiques. Ces études nécessitent de réaliser des prélèvements de fragments de nageoire sur animal adulte (>3 mois) pour d’identifier les animaux d’intérêt. Les animaux seront génotypés à l’état adulte (>3 mois) vu que i) l’objectif de la procédure est d’identifier des adultes reproducteurs et que ii) la nageoire adulte est suffisamment grande pour pouvoir effectuer un prélèvement qui est à la fois suffisant pour le génotypage est assez petit pour être sans incidence sur le bien-être du poisson.